基于核基因組的樟科檬果樟屬亞洲類群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的重建

摘 要：【目的】樟科Lauraceae檬果樟屬Caryodaphnopsis Airy Shaw植物種子含油量豐富，果實和木材極具開發(fā)潛力。由于該屬亞洲類群種間差異小、種間關(guān)系混亂、現(xiàn)存標本量少，人們對該屬植物了解甚少，極大地阻礙了檬果樟屬物種的開發(fā)利用，因此，構(gòu)建檬果樟屬亞洲類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系迫在眉睫?！痉椒ā繛榱松钊肓私饷使翆賮喼揞惾?，采用二代測序技術(shù)分別獲得44個檬果樟屬植物的核糖體基因組（nrG）序列構(gòu)建高支持的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并綜合系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果與形態(tài)性狀比較論證。【結(jié)果】使用nrDNA序列矩陣構(gòu)建ML樹和貝葉斯樹，ML樹和貝葉斯樹的分組完全一致。對比ITS樹發(fā)現(xiàn)除檬果樟和寬葉檬果樟外的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)基本一致，老撾檬果樟、緣毛檬果樟和河口檬果樟依然共同聚成在一個大分支下，且寬葉檬果樟和檬果樟2個物種也聚在一起。ITS序列和nrDNA序列樹都表明：寬葉檬果樟和檬果樟親緣關(guān)系較近；老撾檬果樟、河口檬果樟和緣毛檬果樟的親緣關(guān)系較近，推測這2個物種之間可能發(fā)生過雜交或基因交流。綜合形態(tài)性狀輔助論證，將44個檬果樟屬樣本分為9組，依次為小花檬果樟C. henryi、赤毛檬果樟C. poilanei、二藥室檬果樟C. bilocellata、麻栗坡檬果樟C. malipoensis、寬葉檬果樟C. latifolia、檬果樟C. tonkinensis、河口檬果樟C. hekouensis、緣毛檬果樟C. metallica和老撾檬果樟C. laotica?！窘Y(jié)論】研究結(jié)果不僅揭示了檬果樟屬亞洲類群的種間親緣關(guān)系，還對檬果樟屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和性狀的研究具有重要的生態(tài)意義和經(jīng)濟意義。

關(guān)鍵詞：檬果樟屬；系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；形態(tài)學(xué)性狀；核糖體基因組（nrG）

中圖分類號：S718.46 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）06-0043-13

基金項目：云南省科技人才與平臺計劃項目（202205AF150022）。

Reconstruction of phylogenetic relationship of Asian Caryodaphnopsis（Lauraceae） based on nuclear genome

LI Qishaoa，b， QU Yayab， XIN Yaxuana， TANG Junrongb， CAO Zhengyinga，b， YU Qingfua，b， XIN Peiyaoa

（a. Southwest Research Center for Landscape Architecture Engineering， National Forestry and Grassland Administration； b. Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conservation in Southwest China， Southwest Forestry University， Kunming 650224， Yunnan， China）

Abstract：【Objective】Caryodaphnopsis Airy Shaw （Lauraceae） is rich in seed oil， and its fruit and wood have great development potential. Due to the small differences between species， the confusion of interspecific relationships and the small number of existing specimens， people have little understanding of the genus， which greatly hinders the development and utilization of the species of Caryodaphnopsis. Therefore， it is urgent to construct the phylogenetic relationship of the Asiatic group of Caryodaphnopsis.【Method】In order to further understand the Asian group of Caryodaphnopsis， the ribosomal genome （nrG） sequences of 44 Caryodaphnopsis plants were obtained by second-generation sequencing technology to construct a highly supported phylogenetic relationship， and comprehensive phylogenetic results and morphological traits comparative demonstration.【Result】Using nrDNA sequence matrix to construct ML tree and Bayesian tree， the grouping of ML tree and Bayesian tree was completely consistent. By comparing the ITS tree， it was found that the phylogenetic structure except for C. tonkinensis and C. latifolia was basically the same. C. laotica， C. metallica and C. hekouensis were still clustered together under a large branch， and C. latifolia and C. tonkinensis were also clustered together. The ITS sequence and nrDNA sequence tree showed that the genetic relationship between C. latifolia and C. tonkinensis was close. The genetic relationship of C. laotica， C. hekouensis and C. metallica was close， and it was speculated that hybridization or gene exchange occur between the two groups of species. Based on the comprehensive morphological traits， 44 samples were divided into 9 groups. They were C. henryi， C. poilanei， C. bilocellata， C. malipoensis， C. latifolia， C. tonkinensis， C. hekouensis， C. metallica and C. laotica.【Conclusion】The results of this study not only reveal the interspecific genetic relationship of the Asian group of Caryodaphnopsis， but also have important ecological and economic significance for the study of the phylogenetic relationship and traits of Caryodaphnopsis.

Keywords： Caryodaphnopsis Airy Shaw； phylogenetic relationship； morphological traits； ribosomal genome

檬果樟屬Caryodaphnopsis Airy Shaw是樟科的一個小屬，是Airw Shaw在1940年建立起來的，約有20種[1]。全球生物多樣性信息服務(wù)網(wǎng)絡(luò)平臺（GBIF）中記錄的已接收檬果樟種類為16種（不包含寬葉檬果樟），世界植物在線（Plants of the world online）中收錄的檬果樟屬物種共17種，中國植物志記載僅4種（FRPS）[2]。檬果樟屬一開始被認為是亞洲的一個小屬，隨著前人對檬果樟屬研究的深入，2個產(chǎn)于新熱帶南美洲的物種被歸入檬果樟屬中，檬果樟的分布由一開始的熱帶亞洲擴展到了熱帶南美地區(qū)，正式成為了經(jīng)典的熱帶環(huán)太平洋分布的屬[3]。在我國，檬果樟屬植物屬于熱帶稀缺林木資源，是西南地區(qū)森林的重要組成部分，種子含油量豐富，果實和木材極具開發(fā)和研究價值，但由于檬果樟屬物種標本數(shù)量不足，取材困難，使得人們對于該屬植物了解甚少，這極大地阻礙了該屬植物的研究與開發(fā)工作。此外，檬果樟屬亞洲類群植物的種間差異小，種間分類界定混亂[4]。因此，對檬果樟屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究具有重要的生態(tài)意義。

由于種間的遺傳差異較小，僅使用少量的基因標記很難準確地分析物種關(guān)系。近年來，眾多學(xué)者偏向于使用完整的線粒體基因組、葉綠體基因組以及nrDNA對物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行探討[5-7]。在3個基因組中，核基因組序列最大，且占據(jù)了主導(dǎo)地位[8]。核基因組內(nèi)編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列的進化速率不同，由于功能上的限制較少，通常非編碼區(qū)序列（包括內(nèi)含子和基因間區(qū)）比編碼區(qū)進化速率更快[9-11]。核基因組的核糖體DNA（nrDNA）屬于雙親遺傳，系統(tǒng)學(xué)分析可綜合揭示雙親譜系及系統(tǒng)網(wǎng)狀進化關(guān)系[12]，核糖體DNA由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)構(gòu)成， 18S、5.8S和28S三個基因形成多拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列[13]， 而5S rDNA基因自身形成一個多拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列。核糖體DNA序列中的ITS區(qū)是中度保守區(qū)，進化速率較快，具有核苷酸序列的高度變異性和長度上的保守性，能夠提供較豐富的變異位點和信息位點，因此常被用于植物屬間及屬下水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳多樣性分析[14-18]。核糖體DNA基因間隔區(qū)序列主要有ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）序列、IGS（重復(fù)基因間的間隔區(qū)）和5S rDNA基因間隔區(qū)序列，ITS（Internal transcribed spacer）是18S和28S基因間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，主要包括ITS1片段、5.8S rRNA基因、ITS2片段和28S rRNA基因，是在分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的基因片段之一[19]，在研究種間和較近的族間、屬間關(guān)系時都表現(xiàn)出較高的趨異率和信息位點百分率，為較低分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究提供了較好的支持[20]。Chanderbali等[21]對樟科的122種植物取樣，利用ITS片段和葉綠體DNA中多個片段對整個樟科植物進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示檬果樟屬、無根藤屬和新樟屬在同一個分支下面，但是支持率低于50%。Li等[22]以檬果樟屬9種共20個個體（為3種來自熱帶亞洲，6種來自新熱帶，）和樟科其他類群為研究對象，基于ITS序列和2個核基因RPB2與LEAFY建立系統(tǒng)發(fā)育樹，探討了檬果樟屬植物的系統(tǒng)位置和生物地理歷史，結(jié)果顯示新樟、無根藤屬與樟科其他屬在同一個分支下，共同與檬果樟屬構(gòu)成姐妹群，且檬果樟屬內(nèi)亞洲類群與美洲類群獨立為2個分支，這一結(jié)果證明了檬果樟屬的單系性。孫添添[23]選取61個檬果樟樣品，利用核基因ITS、RBP2和LEAFY基因序列開展了對亞洲檬果樟屬復(fù)合群研究，并結(jié)合形態(tài)性狀變異式樣和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果將亞洲檬果樟復(fù)合體劃分為8個種：麻栗坡檬果樟、小花檬果樟、老撾檬果樟、檬果樟、二藥室檬果樟；恢復(fù)了之前被并入檬果樟屬的寬葉檬果樟并命名2個新種：河口檬果樟C. hekouens和紅脈檬果樟C. rubrinervis；認為亞洲檬果樟復(fù)合群的多樣中心在云南、老撾和越南交界地帶；提出葉柄毛被、花序毛被、果實形狀、果實直徑、果實毛被、花藥室數(shù)為檬果樟種級分類的重要性狀。

植物形態(tài)學(xué)性狀是物種鑒定的最直觀和最常用的手段，通過對植物的形態(tài)性狀進行觀察分析，總結(jié)出有分類價值的植物形態(tài)性狀對植物進行分類即是傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類法，具有直觀、快捷、成本低等優(yōu)點[4]。高園等[24]以34個茶梅品種為研究對象，觀察并記錄其形態(tài)學(xué)性狀，并利用ISSR-PCR技術(shù)分析其親緣關(guān)系。34個茶梅品種間遺傳多樣性豐富，且各個類群間的親緣關(guān)系均較遠，不同類群中的茶梅品種在樹形、花瓣類型、花色、花期等形態(tài)學(xué)性狀方面具有明顯差異，研究結(jié)果為茶梅品種的鑒別及雜交育種提供了理論依據(jù)。柏文富等[25]對16個櫻屬植物的葉片形態(tài)特征和葉片解剖結(jié)構(gòu)等20項典型特征指標進行測定，華中櫻桃等7個物種的葉片形態(tài)特征和解剖結(jié)構(gòu)有顯著差異，親緣關(guān)系相近的品種之間差異不顯著，葉片形態(tài)特征和解剖結(jié)構(gòu)可以作為櫻屬植物種間鑒定和分類的重要依據(jù)。本研究將進一步對亞洲檬果樟屬物種的種間關(guān)系進行探究，基于44個檬果樟屬亞洲個體的核糖體基因組（nrG）序列構(gòu)建高支持的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并加以形態(tài)性狀輔助論證，揭示檬果樟屬亞洲類群的種間親緣關(guān)系，以求獲得更接近于檬果樟屬真實演化發(fā)展的研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究共采集檬果樟屬植物44個體（Dmgz1來源于NCBI），采樣清單見表1。采樣地點主要集中于我國云南與越南、老撾、緬甸的邊界線附近，少量材料來源于廣東廣州。其中，來自云南個體為36個，緬甸為4個，廣東為2個，老撾為1個，越南為1個。采樣時選取生長狀況良好的植物個體的莖和完整的葉片進行采集，壓成標本后用鼓風(fēng)機烘干保存。同時將采集到的花、果保存于固定液中（固定液配置：分析純級別的甲醛、冰乙酸和丙三醇各100 mL，95%的乙醇1 347 mL，蒸餾水353 mL），用于后續(xù)試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉脈拍攝與測量

1）從每份材料標本中隨機選取3片葉子，設(shè)置放大倍數(shù)為7.5X；2）在7.5X下拍攝每片葉片葉背面的主脈、側(cè)脈、網(wǎng)脈區(qū)域的形態(tài)，每片葉片拍攝4張，每個材料個體共拍攝12張。3）隨機選取每個測序材料個體3片葉片，取中間區(qū)域（避開主要葉脈），用剪刀剪取5 mm ×5 mm的方形區(qū)域放入試管中，以5%的NaOH溶液浸沒；4）90℃下恒溫水浴加熱煮至褪色呈現(xiàn)近透明后制成臨時裝片（背面朝上）；5）在10X、20X顯微鏡下分別拍照，記錄不同倍數(shù)葉背形態(tài)，不同倍數(shù)下各拍12張。

1.2.2 葉下表皮形態(tài)拍攝

1）每個物種隨機選取3個葉片進行試驗，每片葉子剪取中間區(qū)域左右各5 mm ×5 mm的方片狀（注意不能用手破壞表面）；2）用雙面導(dǎo)電膠將方片背面朝上固定在掃描電鏡專用的置物臺上，在離子濺射鍍膜儀內(nèi)水平放置鍍金2 min后，在掃描電子顯微鏡下觀察；3）并分別拍攝40X、100X、200X、400X和800X倍數(shù)下的葉下表皮形態(tài)；4）全過程佩戴硅膠手套操作。

1.2.3 花形態(tài)拍攝

體視鏡拍攝：1）將新鮮花正面直立放置在打濕的平展的衛(wèi)生紙上，用體視鏡在2.5X、4X和6.3X的倍數(shù)下拍攝完整花照片；2）將花解剖，將解剖好的花被片、第一、二輪雄蕊、第三輪雄蕊、柱頭整齊排列，用體視鏡在2.5X、4X和6.3X的倍數(shù)下拍攝相應(yīng)的花解剖圖。

電鏡拍攝：1）固定液固定：將新鮮花用FAA固定液浸泡固定至少2 d，保持花朵形態(tài)結(jié)構(gòu)；2）脫水：將無水乙醇分別稀釋至30%、50%和90%，準備3份100%濃度的乙醇，分別置入各試管中并貼上濃度標簽，然后將不同檬果樟種的花朵分別進行脫水；3）臨界點干燥：臨界點干燥可以使花朵保持盛開時的狀態(tài)，氣孔、細胞等結(jié)構(gòu)和組織不會發(fā)生較大改變。使用臨界點干燥將脫水后的花朵干燥1.5 h后放入硅膠保存；4）固定花樣品：用鑷子、指甲油、導(dǎo)電膠等輔助物將花正面朝上穩(wěn)固固定在電鏡專用置物臺上（戴硅膠手套操作，避免因觸碰花而落下指紋）；5）鍍金和拍攝：在離子濺射鍍膜儀內(nèi)以不同角度將花鍍至外表面均勻覆滿金色粉末后將鍍好金的電鏡置物臺置入掃描電子顯微鏡下觀察，拍攝花的形態(tài)。

1.3 基因組系統(tǒng)學(xué)研究方法

1.3.1 基因組測序與組裝

將44個檬果樟個體經(jīng)硅膠干燥后，分批送至“北京諾禾致源科技股份有限公司”測序公司進行二代測序，測序完成后，利用GetOrganelle軟件對測序數(shù)據(jù)分別進行組裝，組裝出nrDNA序列（約6 500 bp）。

1.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

1）檢索NCBI上已有的關(guān)于檬果樟的序列發(fā)現(xiàn)共包含約186項（截至2022年3月），其中ITS序列共有9種（包含5個美洲種），核基因LEAFY和RBP2各有8種。本研究中，組裝獲得了所有個體遠長于ITS序列的nrG序列，序列長度和種類都遠多于NCBI上的序列。因此，在對檬果樟屬物種進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究時，僅用到了NCBI中的ITS序列（約700 bp）。2）利用軟件將組裝后的檬果樟nrG與NCBI上相應(yīng)的檬果樟DNA序列一起列隊，使用在線軟件MAFFT version 7（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/）和Bioedit v7.1.3軟件對nrDNA序列進行排列，最后采用人工校對的方式將其分別排列成整齊的DNA矩陣。3）依據(jù)前人對樟科和檬果樟屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究，選取與檬果樟親緣關(guān)系最近的新樟屬物種如川鄂新樟Neocinnamomum fargesii和海南新樟Neocinnamomum lecomtei作為外類群。4）使用44個檬果樟個體和6個新樟個體（外類群）的核糖體基因組序列矩陣，基于最大似然法（Maximum-likelihood），利用jmodeltest v2.1.10計算模型、iqtree v1.6.7.1和在線軟件CIPRES（https：//www.phylo.org/portal2/home.action#）分別構(gòu)建ML樹和貝葉斯樹，利用Figtree v1.4.0和Photoshop軟件進行調(diào)整美化。其中，ITS序列樹加入了NCBI上下載的23個檬果樟ITS序列（5個美洲種和3個亞洲種）共68個檬果樟個體。

2 結(jié)果與分析

2.1 核基因組序列樹

ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）顯示檬果樟亞洲類群和美洲類群沒有各自構(gòu)成單系，美洲檬果樟物種全部聚在亞洲檬果樟下，即美洲種來源于亞洲物種，但整體支持率偏低。小花檬果樟、赤毛檬果樟、二藥室檬果樟、麻栗坡檬果樟、寬葉檬果樟和檬果樟各成獨立分支，而老撾檬果樟、緣毛檬果樟和河口檬果樟共同聚成在一個大分支下。此外，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，本研究中的老撾檬果樟與NCBI中下載的老撾檬果樟（EF538711、GU082364、KT248560）沒有聚在一起，而是與檬果樟混在一起。

使用nrDNA序列矩陣（總長約6 500 bp）構(gòu)建系統(tǒng)ML樹和貝葉斯樹如圖2。長度拓展后的系統(tǒng)發(fā)育樹的支持率得到了很大的提升，且ML樹和貝葉斯樹的分組完全一致。對比ITS樹發(fā)現(xiàn)除檬果樟和寬葉檬果樟外的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)基本一致，老撾檬果樟、緣毛檬果樟和河口檬果樟依然共同聚成在一個大分支下，且寬葉檬果樟和檬果樟也聚在一起。

ITS序列和nrDNA序列樹都表明：寬葉檬果樟和檬果樟親緣關(guān)系較近；老撾檬果樟、河口檬果樟和緣毛檬果樟的親緣關(guān)系較近，推測這2組檬果樟物種之間可能發(fā)生過雜交或基因交流。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果與性狀論證

結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果與形態(tài)性狀進行論證，將44個檬果樟物種分為9個物種，依次為小花檬果樟（6109、8613、9344、9287、9217、9229和9661）、赤毛檬果樟（9475）、二藥室檬果樟（6136、6010、8783、8758）、麻栗坡檬果樟（9643、7702、7703、7704）、寬葉檬果樟（8735、8763、8748、57836、9666）、檬果樟（9640、9641、9642、9665、6122、8734、8795、Dmgz1）、河口檬果樟（57834、6062）、緣毛檬果樟（7700、7701、7705、8742、8756、6123、9644）和老撾檬果樟（9855、8841、8787、8792、57835、9386）。具體如下：

1）小花檬果樟處于檬果樟屬中最早分化的一個種。小花檬果樟的葉片多呈披針形，葉片相對于其他檬果樟種類通常較小，薄紙質(zhì)，葉片邊緣經(jīng)常呈波浪形褶皺（圖3），葉背蒼白但不光滑發(fā)亮，主脈和側(cè)脈非常明顯，葉背有極小的田字形小網(wǎng)脈但很不明顯，新葉多為鮮嫩的黃綠色。小花檬果樟下可分為兩支群體，第一支群體包括：6109（云南滄源）、8613（云南滄源）和9344（云南勐臘），第二支群體包括：9287、9217、9229和9661，根據(jù)材料來源表（表1）可知，2個群體分別產(chǎn)自緬甸和云南，在葉片上的性狀也略有差異，其葉背在電鏡下的形態(tài)如圖4所示：①兩者皆近乎無毛。產(chǎn)自云南的小花檬果樟葉背的主脈和側(cè)脈上有稀少的近乎退化的短毛（整體認為近乎無毛），產(chǎn)自緬甸葡萄的小花檬果樟的葉背整體被非常稀疏的短毛，比云南小花檬果樟的毛略多；②2個群體的葉下表皮有著類似的遍布絲屑狀的橢球形表皮細胞，但第一群體的細胞突起程度較高，第二群體表現(xiàn)得較為平坦。2個群體小花檬果樟有相同的共組節(jié)點，源于同一內(nèi)支，但由于來源地的不同，在葉片形態(tài)上表現(xiàn)出了微小差異，這也印證了環(huán)境對葉片性狀的影響。

2）赤毛檬果樟材料只有1份，來源于越南。在nrG系統(tǒng)發(fā)育樹中，赤毛檬果樟與二藥室檬果樟和小花檬果樟互為姐妹關(guān)系，其葉片形態(tài)也結(jié)合了2個物種的特征。整體葉片形態(tài)與其他檬果樟有著明顯區(qū)別，有著類似于二藥室檬果樟但很不明顯的小網(wǎng)脈（比二藥室檬果樟的網(wǎng)脈纖細），但葉片質(zhì)感接近于小花檬果樟（小花檬果樟葉背蒼白，該種干燥后的葉背呈棕褐色），薄紙質(zhì)感易皺。干燥后的赤毛檬果樟葉脈為紅色，葉下表皮中，只在主脈和側(cè)脈上附著少量稀疏的毛。電鏡下的赤毛檬果樟有著顯著不同于其他亞洲檬果樟的特征，葉背有稀疏毛和密集的多邊形孔洞，是參試材料中葉背孔洞最密集的一個種（圖5）。

3）二藥室檬果樟葉下表皮無毛，葉片通常為硬紙質(zhì)（偶爾有薄紙質(zhì)葉片，通常很大），該種的突出特征是其葉下表面獨特而又明顯的“田字形”小網(wǎng)脈（通常為橘黃色），在亞洲種里，二藥室檬果樟獨特的葉脈能夠被一眼辨識。其次，之所以命名“二藥室”，是因為其花藥室為二室（圖6），其他亞洲檬果樟物種則皆為4個花藥室（圖7～8）。

4）麻栗坡檬果樟的鑒定依據(jù)為劉冰等的標本（圖9），葉片在亞洲檬果樟里也很有辨識度，葉背蒼白，有獨特而明顯的近乎平行的梯形三級脈，小網(wǎng)脈很不明顯，主脈、側(cè)脈和三級脈上均有較密集的毛。

5）寬葉檬果樟和檬果樟親緣關(guān)系較近，有相同的共祖節(jié)點。檬果樟分組下又可細分為2個群體。第一群體包括：9640、9665、9641、9642；第二群體包括：Dmgz1、6122、8795、8734；檬果樟為紙質(zhì)，葉背蒼白而光滑，是亞洲檬果樟中唯一一個葉背光滑發(fā)亮的種（圖10）。電鏡下的 2個檬果樟群體在主脈和下表皮特征上都表現(xiàn)出高度的一致性，葉下表皮平坦，表面有少量不均勻分布的小孔洞，葉脈和表面皆無毛（圖11）。

6）寬葉檬果樟葉下表皮也有著類似于二藥室檬果樟的密集的方形小網(wǎng)脈（圖12），但沒有二藥室檬果樟葉脈明顯，葉下表皮被疏毛或接近無毛。電鏡下的寬葉檬果樟有著很不一致的葉下表皮形態(tài)（圖13）：1）均有分布較為均勻的孔洞，其中8735最密集，與老撾檬果樟密集程度一致，僅次于孔洞最密集的赤毛檬果樟；2）均有稀疏的、均勻分布扁平（近乎退化）的短毛，被毛程度為：8735=9666>8763=8748，8735和9666被毛密集于后2個個體，后2個個體整體被毛可以忽略不計；3）在800X電鏡下，4個個體的表皮細胞結(jié)構(gòu)都為較平坦的片狀細胞，不同的是9666表面有層層波紋形隆起；8748的表面附著物很多；8763孔洞較密；8735有較多的孔洞和毛。

寬葉檬果樟中的8735和8763個體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系極不穩(wěn)定，8748和57836的系統(tǒng)發(fā)育位置較為穩(wěn)定。8735有稀疏、短小（看起來有些退化）的毛，很可能與有毛的檬果樟發(fā)生過雜交而產(chǎn)生被毛這一性狀，但這一性狀可能在逐漸退化，從而回歸至無毛。

7）河口檬果樟的葉背顏色為白綠色（圖14），葉背密被均勻的棕黃色毛。所有檬果樟物種中，有毛的僅有河口檬果樟、老撾檬果樟和緣毛檬果樟中的9386個體。緣毛檬果樟中，僅有9386有密集的毛被，其他緣毛檬果樟個體均無毛，而9386的系統(tǒng)發(fā)育位置在不同的系統(tǒng)樹中也是不穩(wěn)定的。兩細胞器基因組系統(tǒng)樹均顯示9386屬于老撾檬果樟分支下，與老撾檬果樟8841聚在一起，性狀結(jié)果也顯示9386屬于老撾檬果樟分組中。9386的下表皮密被均勻毛狀體，且細胞邊緣略微隆起，看起來綜合了老撾檬果樟和緣毛檬果樟的表皮形態(tài)，但更接近于老撾檬果樟，由此可推斷，老撾檬果樟和緣毛檬果樟之間很可能發(fā)生過雜交。

8）緣毛檬果樟和老撾檬果樟與河口檬果樟聚在一起，有著較近的親緣關(guān)系。老撾檬果樟和河口檬果樟葉下表皮均密被棕色毛，緣毛檬果樟則無毛。緣毛檬果樟的葉為硬紙質(zhì)，上表面光滑且發(fā)光，葉上下表面主、側(cè)脈非常明顯。老撾檬果樟葉背被有密集的黃褐色的毛，葉片通常寬大，葉片通常為厚紙質(zhì)，偶有超大型薄紙質(zhì)葉片。電鏡下的老撾檬果樟葉背布滿孔洞，河口檬果樟的孔洞較稀疏。在800X電鏡下將第七、八、九3大分組進行比較后發(fā)現(xiàn)：河口檬果樟與老撾檬果樟的表皮更加相似，整體都呈現(xiàn)出平坦的片狀細胞表皮，且能觀察到支撐柱與表皮細胞連接處類似于變形蟲狀的痕跡；緣毛檬果樟則與兩者不同，表皮細胞邊緣呈線狀隆起，整體表皮凹凸不平且遍布屑狀附屬物，且整體被毛數(shù)量可以忽略不計（圖15）。

3 討 論

3.1 檬果樟屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

隨著樟科分類系統(tǒng)構(gòu)建的不斷完善和分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展，檬果樟屬的系統(tǒng)位置也在逐步發(fā)展和完善。Rohwer[26]選取了51個樟科植物樣本，基于matK序列構(gòu)建了系統(tǒng)樹，結(jié)果顯示檬果樟屬位于瓊楠屬與鱷梨屬之間。但由于取樣少，單個基因序列太短又較為保守，據(jù)此建立的系統(tǒng)樹不穩(wěn)定，支持率較低，所以不足以闡明檬果樟的系統(tǒng)學(xué)位置。Chanderbali等[21]對樟科的122種植物進行取樣，利用ITS片段和葉綠體DNA中多個片段對整個樟科植物進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示檬果樟屬、無根藤屬和新樟屬在同一個分支下面，但是支持率低于50%。Rohwer等[27]共選取了57個樟科植物材料（包括了5個外類群），基于葉綠體基因trnK建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示檬果樟屬與新樟屬的關(guān)系比無根藤屬關(guān)系近，且檬果樟屬與新樟屬在同一個分支下的支持率很低。Li等[22]以檬果樟屬9種共20個個體（為3種來自熱帶亞洲，6種來自新熱帶）和樟科其他類群為研究對象，基于ITS序列和2個核基因RPB2與LEAFY建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），探討了檬果樟屬植物的系統(tǒng)位置和生物地理歷史，結(jié)果顯示新樟、無根藤屬與樟科其他屬在同一個分支下，共同與檬果樟屬構(gòu)成姐妹群，且檬果樟屬內(nèi)亞洲類群與美洲類群獨立為2個分支，這一結(jié)果證明了檬果樟屬的單系性。Song等[28]利用131種植物的質(zhì)體基因組成功構(gòu)建了樟科“6族9分支”的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，在獲得高支持率的同時也與多數(shù)形態(tài)分類性狀相互印證，結(jié)果將新樟族和檬果樟族為兩新單系族正式發(fā)表，2個族互相構(gòu)成姐妹群，認為檬果樟屬與新樟的親緣關(guān)系近于無根藤屬。綜合分子系統(tǒng)學(xué)研究表明檬果樟屬與新樟屬親緣關(guān)系較近，且檬果樟很可能不屬于鱷梨族（Perseae group），而是在樟科下獨立成族或?qū)伲c無根藤屬、新樟屬成為核心樟群的外群[16，29-30]。以上研究都是關(guān)于檬果樟屬在樟科內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育位置的研究，但關(guān)于檬果樟種間關(guān)系的研究還很少。在2017年，孫添添選取61個檬果樟樣品，利用核基因ITS、RBP2和LEAFY基因序列開展了對亞洲檬果樟屬復(fù)合群研究，并結(jié)合形態(tài)性狀變異式樣和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果將亞洲檬果樟復(fù)合體劃分為8個種：麻栗坡檬果樟、小花檬果樟、老撾檬果樟、檬果樟、二藥室檬果樟；恢復(fù)了之前被并入檬果樟屬的寬葉檬果樟并命名2個新種：河口檬果樟C. hekouens和紅脈檬果樟C. rubrinervis；認為亞洲檬果樟復(fù)合群的多樣中心在云南、老撾和越南的交界地帶；提出葉柄毛被、花序毛被、果實形狀、果實直徑、果實毛被、花藥室數(shù)為檬果樟種級分類的重要性狀。本研究進一步對亞洲檬果樟屬物種的種間關(guān)系進行了探究，利用nrG序列構(gòu)建了檬果樟屬的系統(tǒng)發(fā)育樹，并加以形態(tài)性狀輔助論證，將檬果樟亞洲類群的44個樣本界定為9個物種分組，依次為小花檬果樟、赤毛檬果樟、二藥室檬果樟、麻栗坡檬果樟、寬葉檬果樟、檬果樟、河口檬果樟、緣毛檬果樟和老撾檬果樟，研究結(jié)果可為檬果樟屬植物的系統(tǒng)演化研究提供新的證據(jù)。

3.2 檬果樟屬種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

對比孫添添[23]對于檬果樟屬亞洲種的種間關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，檬果樟屬亞洲種中最古老的種為小花檬果樟，其次是二藥室檬果樟和麻栗坡檬果樟，這3個物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系在核糖體基因組序列樹中的系統(tǒng)發(fā)育位置是相對穩(wěn)定的。其次為檬果樟、河口檬果樟和老撾檬果樟，以上6個物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與本研究一致。對于寬葉檬果樟的系統(tǒng)發(fā)育位置可能存在爭議：孫添添[23]基于ITS序列和核基因序列（RPB2、LEAFY）構(gòu)建了檬果樟屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其用BEAST分析推算的可信度最高分化枝樹顯示寬葉檬果樟與檬果樟、老撾檬果樟和河口檬果樟聚成的小支有共同祖節(jié)點，這與本研究中的nrDNA樹結(jié)果一致。本研究使用ITS序列構(gòu)建的檬果樟屬種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系則與孫添添[23]和Li等[22]的研究不一致，他們都是分別以樟科不同屬物種和新樟屬植物做外類群，利用ITS序列、核基因RBP2和LEAFY構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果均表明檬果樟美洲物種與亞洲物種各自獨立為兩大分支。本研究基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示檬果樟屬美洲類群都聚在亞洲類群下，即檬果樟美洲物種可能源于亞洲種。但相較于前人的研究，本研究選用的序列較短，包含的信息點有限，關(guān)于檬果樟屬亞洲類群和美洲類群的關(guān)系還需要更多分子數(shù)據(jù)來論證。

4 結(jié) 論

重建樟科檬果樟屬亞洲類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，是開展檬果樟屬植物生物學(xué)研究及其資源開發(fā)利用的基礎(chǔ)性工作。本研究基于44個檬果樟屬亞洲個體的核糖體基因組（nrG）序列構(gòu)建高支持的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并加以形態(tài)性狀輔助論證，將檬果樟亞洲類群的44個樣本界定為9個物種分組，依次為小花檬果樟、赤毛檬果樟、二藥室檬果樟、麻栗坡檬果樟、寬葉檬果樟、檬果樟、河口檬果樟、緣毛檬果樟和老撾檬果樟。研究結(jié)果可為該屬亞洲類群植物種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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[本文編校：吳 彬]