單葉薔薇基因組SSR標記開發(fā)與應用

摘 要：【目的】單葉薔薇是薔薇屬唯一的單葉物種，目前已被列為國家二級瀕危保護植物，開發(fā)高效的分子標記可以為單葉薔薇居群遺傳多樣性分析、克隆生長格局等研究提供重要的數(shù)據(jù)支撐，為其居群遺傳資源的保育提供理論指導?！痉椒ā坷肒rait v1.3軟件對單葉薔薇全基因組序列中1～6核苷酸重復的SSR位點進行搜索并分析其序列特征，進而采用Primer Premier3.0軟件設計引物。選取16個單葉薔薇樣本通過瓊脂糖凝膠電泳和毛細管電泳檢驗引物的有效性和多態(tài)性。最后用POPGENE32軟件和PowerMarker3.25軟件對高多態(tài)性引物擴增產(chǎn)物數(shù)據(jù)進行遺傳參數(shù)分析，利用軟件NTSYS-pc2.10對16個單葉薔薇樣本進行聚類分析。【結果】單葉薔薇基因組序列上共識別出142 083個SSR位點，其中二核苷酸重復類型數(shù)目最多，占比46.95%。單核苷酸至六核苷酸重復型中占比最高的基序類型分別為A/T、AT/AT、AAG/CTT、AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT和AAAAAG/CTTTTT，充分表明A/T為優(yōu)勢堿基。單葉薔薇基因組SSR序列長度變化范圍為12～1 026 bp，不同的核苷酸重復類型均呈現(xiàn)長度越長數(shù)量越少的規(guī)律，區(qū)間長度為10～15 bp的SSR位點數(shù)量最多，占比47.42%。合成的140對引物中112對可以獲得清晰的目的條帶，引物有效率為80%；最后篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的14對引物在16份單葉薔薇樣本中檢測到等位基因58個，PIC值在0.314 3～0.675 9之間，等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon信息指數(shù)（I）及PIC值平均分別為4.142 9、2.576 9、1.080 8和0.529 2。Pearson相關分析結果表明所篩選引物的PIC值與SSR長度間并無顯著相關性。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，篩選出的14對引物能夠?qū)⒒诓煌尤旱膯稳~薔薇進行較好地區(qū)分，遺傳相似系數(shù)在0.45～0.86之間?！窘Y論】利用單葉薔薇全基因組大規(guī)模開發(fā)的SSR標記數(shù)量豐富且類型多樣，篩選出的高多態(tài)性SSR位點將為后續(xù)單葉薔薇居群遺傳多樣性研究發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：單葉薔薇；SSR；標記開發(fā)；多態(tài)性

中圖分類號：S759.95 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）06-0186-11

基金項目：國家自然科學基金面上項目（32071820）；國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFD1001001）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項”（QNTD202306）；北京高校高精尖學科建設項目“城鄉(xiāng)人居生態(tài)環(huán)境學”。

Development and application of genomic SSR markers in Rosa persica

ZHANG Xueyun， ZHANG Xiaolong， LI Na， KONG Qingyang， YU Chao， PAN Huitang， ZHANG Qixiang， LUO Le

（a. Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation and Molecular Breeding； b. National Engineering Research Center for Floriculture； c. Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment； d. Engineering Research Center of Landscape Environment of Ministry of Education； e. Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education； f. State Key Laboratory of Efficient Production of Forest Resources； g. School of Landscape Architecture， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China）

Abstract：【Objective】Rosa persica is the only single-leaf species of Rosa genus， which has been classified as the second class of national endangered plants. The development of efficient molecular markers can provide important data support for the analysis of the genetic diversity of R. persica populations and the study of the growth pattern of clones， as well as theoretical guidance for the conservation of genetic resources of its populations.【Method】SSR loci with 1-6 nucleotide repeats in the whole genome sequence of R. persica were searched and analyzed by Krait v1.3 software， and then primers were designed by Primer Premier3.0 software. Sixteen samples of R. persica were selected to test the validity and polymorphism of the primers by agarose gel electrophoresis and capillary electrophoresis. Finally， the data of amplification products of high polymorphism primers were analyzed by POPGENE32 software and PowerMarker3.25 software for genetic parameters， and the 16 R. persica samples were analyzed by clustering using the software NTSYS-pc 2.10.【Result】A total of 142 083 SSR loci were identified on the genome sequence of R. persica， with the largest number of dinucleotide repeat types， accounting for 46.95%. The units with the highest percentage from mononucleotide to hexanucleotide repeat types were A/T， AT/AT， AAG/CTT， AAAT/ATTT， AAAAT/ATTT and AAAAAG/CTTTTTT， which fully indicated that A/T were the dominant unit. The SSR sequence lengths of R. persica genome varied from 12 to 1 026 bp， and the different nucleotide repeat types all showed the pattern of the longer length and the lower number， and the number of SSR loci with interval lengths of 10-15 bp was the largest， accounting for 47.42%. Among the 140 pairs of primers synthesized， 112 pairs of primers could obtain clear bands， and the primer efficiency was 80%； finally， 14 pairs of primers with high polymorphism and good stability were screened out and 58 alleles were detected in 16 R. persica samples. The PIC value ranged from 0.314 3 to 0.675 9. The average allele number （Na）， effective alleles （Ne）， shannon diversity index （I） and polymorphic information content （PIC） were 4.142 9， 2.576 9， 1.080 8 and 0.529 2， respectively. Pearson correlation analysis showed that there was no significant correlation between the PIC values of the screened primers and the lengths of the SSRs. Cluster analysis revealed that the 14 pairs of primers screened were able to better differentiate R. persica based on different populations， with genetic similarity coefficients ranging from 0.45 to 0.86.【Conclusion】The large-scale development of SSR markers using the whole genome of R. persica is rich in number and diverse in type， and the highly polymorphic SSR loci screened will play an important role in the study of the genetic diversity of R. persica populations.

Keywords： Rose persica； SSR； marker development； polymorphism

單葉薔薇Rosa persica為薔薇科Rosaceae薔薇屬Rosa L.多年生落葉叢生灌木，是薔薇科薔薇屬珍貴種質(zhì)，主要分布在我國新疆西北地區(qū)[1]，具備單葉、黃色花瓣和紅褐色花心等獨特特征[2]。同時，它還具有抗寒、抗旱、耐鹽堿和根系發(fā)達等優(yōu)點[3]，經(jīng)常以建群種的形式生長于海拔120～950 m的山坡、荒地或路旁等干旱地帶的灌叢群落中，是用于防治水土流失、控制荒漠化和防風固沙的優(yōu)良植物[4]。但由于人類活動的影響以及環(huán)境的改變導致新疆野外單葉薔薇居群的面積在逐年減少，目前已被列為國家二級瀕危保護植物[5]，亟待保護。

在自然狀態(tài)下單葉薔薇居群數(shù)量增長以發(fā)達的地下橫走結構進行無性繁殖為主，具備克隆植物的特點[6]。早期克隆結構的研究主要通過挖掘地下部分，觀察根莖或匍匐莖連接情況來區(qū)分單個克隆植物的分布范圍，但存在工作量大、破壞性取樣等問題[7]。因此，通過分子標記的手段研究克隆植物的遺傳多樣性及空間遺傳結構等方面具有重要意義[8]，可以為單葉薔薇對環(huán)境的適應性策略研究提供科學依據(jù)，為順利開展單葉薔薇野外居群的保育工作提供保障。

簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）或微衛(wèi)星標記，是一類由1～6個核苷酸為基本重復單位并在基因組中多次串聯(lián)重復的一段DNA序列[9]，長度一般在200 bp以下[10]，具有多態(tài)性豐富、共顯性、重復性高和操作方便等特點[11-12]，已被廣泛應用于植物遺傳資源DNA指紋圖譜分析、遺傳多樣性分析、品種鑒定和分子標記輔助育種等方面[13-14]。在薔薇屬植物中，Meng等[15]基于大花香水月季開發(fā)出18個微衛(wèi)星標記，并在27個野生薔薇屬植物中通過驗證；Panwar等[16]從薔薇屬植物的EST序列中鑒定出了668個微衛(wèi)星標記，并設計了293對引物用于后續(xù)研究；楊晨陽[17]結合SSR及其他分子標記分析月季組種質(zhì)資源的遺傳背景，將月季組復合體可分為3類，即香水月季類、月季花類和混合類群；吳林世等[18]基于高通量測序的羊躑躅葉綠體基因組及SSR序列分析，構建了杜鵑花科物種的系統(tǒng)進化樹；董勝君等[19]利用SSR的關聯(lián)分析，篩選出與野杏重要經(jīng)濟性狀相關聯(lián)的優(yōu)異等位變異及聚合優(yōu)異等位變異的典型載體材料。目前，國內(nèi)外關于單葉薔薇遺傳多樣性的研究較少，主要集中在育種、系統(tǒng)發(fā)育學、化學、藥用成分和生物學特性等方面，仍缺乏適用于單葉薔薇遺傳分析的SSR特異引物。單葉薔薇全基因組序列的開發(fā)為實現(xiàn)大規(guī)模開發(fā)SSR位點提供了條件。本研究利用Krait軟件[20]檢索SSR位點并分析其分布及組成特征，開發(fā)并篩選高多態(tài)性引物，為后續(xù)其遺傳多樣性分析、克隆生長格局研究和分子標記輔助育種等工作奠定基礎，豐富薔薇屬的SSR標記資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于篩選SSR位點所需的16個單葉薔薇樣本部分（R1～R3）來自實生苗，由采自野外居群的種子在北京播種發(fā)育而來，剩余樣本來源于6個新疆野生單葉薔薇采樣點（R4～R16，表1）。取樣時選取少量新鮮健康的葉片，液氮速凍后帶回實驗室放入-80℃冰箱中保存。采用新型植物 DNA試劑盒（天根DP320）提取基因組DNA。選擇A260/A280值在1.7～1.9之間且瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰的DNA樣品，并統(tǒng)一用ddH2O將濃度稀釋至25 ng/μL左右，保存至-20 ℃冰箱中備用。

1.2 全基因組SSR位點查找及引物設計

根據(jù)單葉薔薇基因組序列數(shù)據(jù)，利用Krait v1.3（https：//github.com/lmdu/krait）軟件對單葉薔薇基因組序列中的SSR位點進行查找。其中單、二、三、四、五、六核苷酸的最小重復次數(shù)分別為12、6、5、5、4、4，而且相鄰SSR序列間隔區(qū)域長度不小于100 bp，其余參數(shù)設置為默認。

利用Krait軟件附帶Primer Premier3.0軟件批量設計引物，參數(shù)設置為：引物長度18～28 bp，預期PCR擴增產(chǎn)物大小為80～300 bp，變性溫度55～65 ℃，GC含量40%～60%，其余參數(shù)默認設置。

1.3 PCR擴增及引物有效性檢測

每種重復類型的SSR位點在不同染色體上（2n=14）隨機挑選2～5個，共設計并合成140對引物。為驗證引物的有效性，先選取2個單葉薔薇基因組DNA進行PCR擴增。PCR擴增體系為20 μL：1 μL DNA模板（25 ng/μL），上下引物各1 μL，10 μL 2×Taq Mastermix，7 μL超純水。PCR反應程序為：94 ℃變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共擴增30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。3%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物[21]。

1.4 引物多態(tài)性篩選

從能夠擴增出條帶的引物中繼續(xù)選取8個單葉薔薇基因組DNA進行擴增，并用3%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。經(jīng)過兩次篩選，將多態(tài)性較高且穩(wěn)定性較好的引物利用16個單葉薔薇基因組 DNA模板進行毛細管電泳檢測。PCR反應體系為10 μL：1 μL DNA模板（25 ng/μL），0.3 μL M13F（10 μmol）上游引物序列結合的熒光標記物，0.1 μL（10 μmol）上游引物和0.2 μL（10 μmol）下游引物，5 μL Mix（2×），3.4 μL超純水。其中M13引物序列進行的熒光標記分別為FAM、HEX、TAMRA、ROX[22]。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s（每個循環(huán)降低1 ℃），72 ℃延伸40 s，合計10個循環(huán)；再94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，合計25個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR反應產(chǎn)物送至睿博興科公司進行毛細管電泳檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用GeneMapper v4.1軟件對每個位點擴增片段峰值圖進行讀取并用Excel表格進行統(tǒng)計[23]；采用POPGENE32和PowerMarker 3.25軟件計算具有多態(tài)性的SSR位點的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon信息指數(shù)（I）以及多態(tài)信息含量值（Polymorphic information content，PIC），采用NTSYS-pc2.10軟件對16份單葉薔薇試驗材料的SSR數(shù)據(jù)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 單葉薔薇基因組SSR位點數(shù)量分布特征

利用Krait軟件對單葉薔薇基因組序列進行識別，在7對染色體和若干未匹配序列中共篩選得到142 083個完美型微衛(wèi)星位點，序列總長度為2 686 480 bp，占基因組長度的0.74%。對單葉薔薇全基因組1～6個核苷酸重復的SSR位點進行特征分析，包括對數(shù)量、長度、平均長度、相對豐度和相對密度進行統(tǒng)計（表2），其中二核苷酸重復型SSR數(shù)目最多，為66 197個，占總數(shù)的46.95%，其次為單核苷酸重復型，占41.94%，六核苷酸重復型占0.61%，數(shù)目最少，僅有869個。

從表3可以看出，在每種核苷酸重復類型中，重復次數(shù)越多其數(shù)量越少。SSR位點的重復次數(shù)以12次最多，SSR位點數(shù)為17 670個，占總SSR的 12.44%；其次為重復次數(shù)6次，共有16 746個，占總SSR的11.79%。其中單核苷酸重復型中重復次數(shù)為12次的是所有重復類型最多的，共14 180個。

SSR基序重復類型（考慮互補系列）共發(fā)現(xiàn)285種，其中六核苷酸重復基序類型數(shù)目最多，共174種。對重復基序的分布特征進行統(tǒng)計（表4），發(fā)現(xiàn)單核苷酸重復型SSRs中A/T的出現(xiàn)頻率最高，重復次數(shù)12～73次，有55 101個，占所有單核苷酸重復的92.47%；二核苷酸重復型SSRs中AT/ AT最多，有30 884個，占所有二核苷酸重復的46.65%，其次為AG/CT，占比37.87%，重復次數(shù)多達201次；三核苷酸重復中出現(xiàn)最普遍的基序類型是AAG/CTT（44.31%）和AAT/ATT（20.32%），出現(xiàn)最少的是CCG/CGG（1.96%），僅有237個；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復型SSRs中占比最高的部分分別為AAAT/ATTT、AAAAT/ ATTTT和AAAAAT/ATTTTT，分別占3種重復類型的32.52%、27.57%和9.67%。

總體來看，單葉薔薇基因組SSR重復基序具有偏好性，以A/T堿基為主，C/G堿基出現(xiàn)頻率相對較低。

2.2 單葉薔薇基因組SSR長度分布情況

單葉薔薇基因組SSR序列長度變化區(qū)間為12～1 026 bp，跨度很大，平均長度為21.61 bp。其中，六核苷酸重復型SSR序列的平均長度最大，為26.68 bp；單核苷酸重復型平均長度最小，為15.35 bp（表2）。重復基序中ATAC/GTAT的平均長度最長，為34.88 bp（表4）。

6種類型的核苷酸重復均呈現(xiàn)長度越長數(shù)量越少的趨勢（圖1）。區(qū)間長度為10～15 bp的SSR位點數(shù)量最多，具有67 374個，占SSR位點總數(shù)的47.42%，主要以單核苷酸為主；位居第二的是長度為16～20 bp的SSR位點，具有39 642個，占比27.90%，此范圍內(nèi)所占比例最高的為二核苷酸；三核苷酸長度變化范圍為15～1 026 bp，變化范圍最大；四核苷酸和五核苷酸SSR位點的長度區(qū)間主要分布于16～20 bp，分別具有1 182和1 078個，占四核苷酸和五核苷酸SSR總數(shù)的58.78%和82.10%；六核苷酸SSR位點的長度主要集中在21～25 bp的區(qū)間，占六核苷酸SSR總數(shù)的73.76%。

2.3 單葉薔薇基因組SSR引物初步篩選

根據(jù)SSR位點批量設計引物，共成功設計103 309對引物，引物設計成功率為72.7%。將隨機選取的140對引物用2個單葉薔薇樣本進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，112對引物擴增出的條帶清晰，且片段大小在預期擴增片段范圍內(nèi)，引物有效率為80%。選用8份DNA模板擴增篩選有條帶的引物進行PCR擴增，3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，共篩選出20對多態(tài)性較高且穩(wěn)定性較好的引物。引物RP-131、RP-51和RP-47均可擴增出多個位點的片段，可進一步用于毛細管電泳檢測（圖2）。

2.4 毛細管電泳驗證引物多態(tài)性

篩選得到的20對SSR引物在16份單葉薔薇試驗材料中可以擴增出多態(tài)性產(chǎn)物，其PIC值在0.058 7～0.675 9之間，8對引物具有高多態(tài)性，PIC值>0.50，8對引物具有中度多態(tài)性（0.25

進一步從中挑選出14對多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的引物（表5），在16份單葉薔薇試驗材料中共檢測到58個等位基因，每個位點的等位基因數(shù)在2～6個，平均等位基因數(shù)為4.142 9；有效等位基因數(shù)在1.515 2～3.596 3之間，平均為2.576 9；Shannon信息指數(shù)在0.673 9～1.468 1之間，平均為1.080 8；PIC值在0.314 3～0.675 9之間，平均為0.529 2。

運用NTSYS-pc2.10軟件對16份單葉薔薇樣本進行Upgma非加權算術平均聚類分析，結果表明，供試材料相似系數(shù)為0.45～0.86。當遺傳相似系數(shù)為0.56左右時，來自同一采集地的樣本R4、R5、R6、R7和R8聚類到一起；此外，來自同一居群的單葉薔薇大多都被聚類到一起（R11和R12、R9和10、R13和R14、R4和R5），且遺傳相似系數(shù)均較高。這些結果反映了單葉薔薇野外居群間存在著明顯的遺傳差異以及居群內(nèi)存在不同的遺傳多樣性水平（圖5）。

3 討 論

高通量測序技術成本的降低和組裝策略的不斷完善使得越來越多的物種完成了全基因組測序[25]，基于全基因組序列開發(fā)SSR標記也成為一種高效且高通量的便捷途徑[26]。本研究利用Krait軟件從單葉薔薇基因組中共篩選到142 083個SSR位點，利用Primer Premier3.0軟件成功設計引物103 309對，從中隨機選取140對引物進行驗證并最終篩選出20對SSR引物進行多態(tài)性分析。單葉薔薇基因組中重復類型以二核苷酸為主，占比46.95%，其次為單核苷酸，占比41.94%，這一結果和許多植物中二核苷酸重復類型在植物基因組中所占比例最高是一致的[27-28]。然而，棗Ziziphus jujuba基因組SSR位點特征研究中發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢重復類型為六核苷酸（40.1%）[29]；二倍體草莓Fragaria vesca和八倍體草莓Fragaria×ananassa中重復類型為單核苷酸的占比最大，分別占40.92%（62 942個）和38.94%（128 413個）[30]，上述結果表明SSR在不同物種以及相同物種的不同核苷酸重復類型之間存在一定差異[31]。Haydar等[32]研究發(fā)現(xiàn)這可能與基因組大小有關，單核苷酸重復類型在基因組較小的物種中占優(yōu)勢地位，多核苷酸重復類型可能在基因組較大的物種中占主導。

從SSR重復基序來看，不同類型SSR位點中的優(yōu)勢基元略有不同，但存在一定的共性[25]。單核苷酸重復中以A/T基序為主，同樣二核苷酸中以AT/AT基序頻率最高，CG/CG出現(xiàn)頻率最低，三核苷酸～六核苷酸優(yōu)勢重復基元分別為AAG/ CTT、AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT和AAAAAT/ ATTTTT。這表明單葉薔薇全基因組序列富含堿基A和T，與許多植物中SSR基序的分布規(guī)律一致，比如石榴Punica granatum[33]、毛果楊Populus trichocarpa[34]、杜仲Eucommia ulmoies[35]、棗[29]和向日葵[36]等。植物基因組自身SSR位點信息差異及查找工具的默認參數(shù)設置不同都會影響SSR優(yōu)勢基元的分布情況。

多態(tài)信息含量PIC是用來衡量位點多態(tài)性程度的信息[37]，當PIC>0.50時，表明該標記具有高度豐富的多態(tài)信息；當PIC值在0.25～0.50之間時，說明該標記可以合理地提供多態(tài)信息；當PIC<0.25時，說明該標記具有較低反映多態(tài)信息的能力[38]。研究發(fā)現(xiàn)，SSR引物的多態(tài)性與核苷酸重復類型和序列長度有關，基因組SSR引物多態(tài)性隨著重復基元長度增加而降低，但隨著重復序列長度的增加而升高[39]。研究表明，重復序列長度大于20 bp的SSR位點多態(tài)性顯著高于序列長度在12～20 bp的SSR位點[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過瓊脂糖凝膠電泳篩選得到的20對SSR引物中，二核苷酸重復類型最多，占比65%；且重復序列長度>20 bp的SSR位點占比80%，但20對引物的PIC值與SSR長度并無顯著相關性，可能是引物數(shù)量較少未形成規(guī)律特征。因此，在選擇高多態(tài)性SSR標記時應著重考慮二核苷酸重復類型，并選擇序列較長的SSR位點[33]。

本研究選用16個不同的單葉薔薇樣本進行聚類分析，結果表明可以聚類到一起的單葉薔薇個體大多來自同一居群或相同地理位置，但位于石河子鎮(zhèn)P6居群的R15和R16并未聚類到一起，這可能是因為P6居群遺傳變異水平高。鄧童等[41]也曾發(fā)現(xiàn)石河子鎮(zhèn)居群內(nèi)的單葉薔薇葉功能性狀變異系數(shù)較高，其中R15與居群P2的個體（R6）有更高的遺傳相似性，R16與居群P5的個體（R13、R14）有更高的遺傳相似性，這在相當程度上表明了單葉薔薇具有長距離的基因流特性。鄭書星等[42]在歐洲山楊中也得到了類似的結果，居群內(nèi)變異是歐洲山楊遺傳變異的主要來源，距離超過100 km的居群遺傳相似性明顯高于相鄰居群。此外，從聚類結果中可以推斷出實生苗R2和R3的親緣關系較近，它們的種子可能來自于P3居群，R1的種子可能來自于P2居群。

本研究從設計合成的103 309對引物中隨機挑選出140對進行多態(tài)性分析，試驗結果符合預期目標，但仍有大部分引物未進行篩選。未來可進一步開發(fā)利用，分析引物的PIC值與SSR長度的關聯(lián)性，獲取更多的多態(tài)性高的可轉移性引物，為薔薇屬植物提供豐富的SSR標記資源。

4 結 論

本研究利用單葉薔薇基因組測序數(shù)據(jù)開發(fā)出的SSR位點數(shù)量多、種類豐富，最后篩選出的14對引物中有8對屬于高多態(tài)性（PIC>0.50），且能夠?qū)⒉煌尤旱膯稳~薔薇進行聚類，符合地理分布情況，準確度較高，證實了開發(fā)的多態(tài)性SSR引物的有效性。未來可利用高多態(tài)性引物進行單葉薔薇野外居群遺傳多樣性分析，研究其在不同生境下的克隆結構和克隆多樣性水平的差異，探討形成原因，為開展單葉薔薇野外居群保育工作提供科學依據(jù)。

參考文獻：

[1] 中國科學院中國植物志委員會.中國植物志（37卷）[M].北京：科學出版社，1985. The Flora of China Committee in Chinese Academy of Sciences. Flora of China （Vol.37）[M]. Beijing： Science Press，1985.

[2] 惠俊愛，張霞，王紹明.新疆野生單葉薔薇生物學特性分析[J].山東林業(yè)科技，2013，43（4）：61-63. HUI J A， ZHANG X， WANG S M. Analysis of biological characteristics of wild Hulthemia berberifolia （Pall.） Dumort. in Xinjiang[J]. Shandong Forestry Science and Technology，2013，43（4）： 61-63.

[3] 朱金啟.單葉薔薇生殖生物學及其繁殖方法研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2003. ZHU J Q. Studies on the reproductive biology and the propagating methods of Rosa persica[D]. Urumqi： Xinjiang Agricultural University， 2003.

[4] 張曉龍，鄧童，劉學森，等.單葉薔薇幼苗根系對不同潛水埋深的適應機制[J].生態(tài)學報，2022，42（15）：6137-6149. ZHANG X L， DENG T， LIU X S， et al. Adaptability mechanism of Rosa persica seedlings root in different groundwater levels[J]. Acta Ecologica Sinica，2022，42（15）：6137-6149.

[5] 國家林業(yè)和草原局，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部.《國家重點保護野生動物名錄》（2021年2月1日修訂）[J].野生動物學報，2021，42（2）： 605-640. National Forestry and Grassland Administration，Ministry of Agriculture and Rural Affairs.List of national key protected wild animals （revised in 2021-2-1）[J].Chinese Journal of Wildlife， 2021，42（2）：605-640.

[6] 賀海洋.單葉薔薇花形態(tài)建成與繁殖生物學研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2005. HE H Y. Reproductive biology and flora morphogenesis of Rosa persica[D]. Beijing： China Agricultural University，2005.

[7] 余鴿.巴山木竹克隆結構及遺傳多樣性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2016. YU G. Clonal structure and genetic diversity of Bashania fargesii[D]. Yangling： Northwest A F University，2016.

[8] 馬青青，劉建軍，余鴿，等.佛坪國家級自然保護區(qū)秦嶺箭竹克隆結構的SSR分析[J].生態(tài)學報，2016，36（20）：6496-6505. MA Q Q， LIU J J， YU G， et al.Clonal structure of a Fargesia qinlingensis population inferred using simple sequence repeat fingerprints in Foping National Nature Reserve[J]. Acta Ecologica Sinica，2016，36（20）：6496-6505.

[9] 杜偉，王東航，侯思宇，等.基于苦蕎全長轉錄組測序開發(fā)SSR標記及遺傳多樣性分析[J].植物生理學報，2020，56（7）： 1432-1444. DU W， WANG D H， HOU S Y， et al. Development of SSR markers based on full-length transcriptome sequencing and its application for genetic diversity analysis in Fagopyrum tataricum[J]. Plant Physiology Journal，2020，56（7）：1432-1444.

[10] 宋琳琳，潘佳穎，李夢思，等.大葉鐵線蓮Clematis heracleifolia DC.多態(tài)性SSR引物開發(fā)[J].分子植物育種，2022，20（2）： 448-454. SONG L L， PAN J Y， LI M S， et al. Development of polymorphic SSR primers for Clematis heracifolia DC.[J]. Molecular Plant Breeding，2022，20（2）：448-454.

[11] 田路明，曹玉芬，董星光，等.SSR分子標記在梨種質(zhì)資源研究中的應用[J].生物學雜志，2013，30（6）：91-94. TIAN L M， CAO Y F， DONG X G， et al. Application of SSR molecular marker in pear germplasm resources[J]. Journal of Biology，2013，30（6）：91-94.

[12] 申響保，朱妍潔，徐剛標.密葉紅豆杉SSR位點分布特征及分子標記開發(fā)[J].中南林業(yè)科技大學學報，2021，41（4）： 139-147. SHEN X B， ZHU Y J， XU G B. Distribution characteristics of SSR loci and development of molecular markers in Taxus fuana[J]. Journal of Central South University of Forestry Technology， 2021，41（4）：139-147.

[13] 賀文瑞，廖保生，沈曉鳳，等.基于黃花蒿低覆蓋度高精度基因組SSR分子標記開發(fā)[J].分子植物育種，2022，20（18）：6087-6096. HE W R， LIAO B S， SHEN X F， et al. Development of genomic SSR molecular markers with low coverage and high precision in Artemisia annua Linn.[J]. Molecular Plant Breeding，2022，20（18）： 6087-6096.

[14] FANG X M， HUANG K H， NIE J， et al. Genome-wide mining， characterization， and development of microsatellite markers in tartary buckwheat （Fagopyrum tataricum Garetn.）[J]. Euphytica， 2019，215（11）：1-10.

[15] MENG J， LI D， YI T， et al. Development and characterization of microsatellite loci for Rosa odorata var. gigantea rehder e. h. wilson. （Rosaceae）[J]. Conservation Genetics，2009，10（6）： 1973-1976.

[16] PANWAR S， SINGH K P， NAMITA N， et al. Identification and characterization of microsatellites in easts of Rosa species： insight in development of SSR markers[J]. Indian Journal of Agricultural Sciences，2015，85（3）：429-433.

[17] 楊晨陽.薔薇屬月季組種質(zhì)資源遺傳多樣性和系統(tǒng)進化[D].北京：北京林業(yè)大學，2020. YANG C Y. Genetic diversity and phylogeny of Rosa Section Chinenses germplasm resources[D]. Beijing： Beijing Forestry University，2020.

[18] 吳林世，廖菊陽，劉艷，等.基于高通量測序的羊躑躅葉綠體基因組及SSR序列分析[J].經(jīng)濟林研究，2022，40（1）：123-131. WU L S， LIAO J Y， LIU Y， et al. Chloroplast genome and SSR sequence analysis of Rhododendron molle based on high throughput sequencing[J]. Non-wood Forest Research，2022，40（1）： 123-131.

[19] 董勝君，溫佳星，盧彩云，等.野杏經(jīng)濟性狀SSR關聯(lián)分析及優(yōu)異等位變異挖掘[J].經(jīng)濟林研究，2022，40（2）：71-82. DONG S J， WEN J X， LU C Y， et al. Association analysis with SSR markers and mining elite allelic variation of economic traits of Armeniaca vulgaris[J]. Non-wood Forest Research， 2022，40（2）：71-82.

[20] DU L， ZHANG C， LIU Q， et al. Krait： an ultrafast tool for genome-wide survey of microsatellites and primer design[J]. Bio informatics，2018，34（4）：681-683.

[21] 郭磊，寧寧，王玉柱，等. 杏RAPD兩種凝膠電泳指紋特點及PCR擴增片段的序列分析[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學，2010（3）：1-6. GUO L， NING N， WANG Y Z， et al. Chloroplast genome and SSR sequence analysis of Rhododendron molle based on high throughput sequencing[J]. Liaoning Agricultural Sciences， 2010（3）：1-6.

[22] 洪文娟.石榴種質(zhì)資源SSR分子標記遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建[D].北京：北京林業(yè)大學，2021. HONG W J. Genetic diversity analysis and fingerprints construction of pomegranate germplasm resources based on SSR markers[D]. Beijing： Beijing Forestry University，2021.

[23] 戴曉港，房芝馨，胡雪純，等.薄殼山核桃全基因組SSR分析及多態(tài)性引物篩選[J].分子植物育種，2021，19（24）：8199-8207. DAI X G， FANG Z X， HU X C， et al. Whole genome SSR analysis and polymorphic primer screening in Carya illinoinensis[J]. Molecular Plant Breeding，2021，19（24）：8199-8207.

[24] BOTSTEIN D， WHITE R L， SKOLNICK M， et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics， 1980，32（3）：314-331.

[25] 杜磊，蒙秋伊，尚昆，等.薏苡基因組SSR標記開發(fā)與應用[J].分子植物育種，2022，20（3）：887-894. DU L， MENG Q Y， SHANG K， et al. Development and application of genomic SSR markers in Coix lacrymajobi L.[J]. Molecular Plant Breeding，2022，20（3）：887-894.

[26] LI N， ZHENG Y Q， DING H M， et al. Development and validation of SSR markers based on transcriptome sequencing of Casuarina equisetifolia[J]. Tree，2018，32（1）：41-49.

[27] DETTORI M T， MICALI S， GIOVINZZI J， et al. Mining microsatellites in the the peach genome： development of new long-core SSR markers for genetic analyses in five Prunus species[J]. Springerplus，2015，4（1）：337.

[28] ZHU H Y， SONG P Y， KOO D H， et al. Genome wide characterization of simple sequence repeats in watermelon genome and their application in comparative mapping and genetic diversity analysis[J]. BMC Genomics，2016，17（1）：557.

[29] 馬秋月，戴曉港，陳贏男，等.棗基因組的微衛(wèi)星特征[J].林業(yè)科學，2013，49（12）：81-87. MA Q Y， DAI X G， CHEN Y N， et al. Characterization of microsatellites in genome of Ziziphus jujuba[J]. Scientia Silvae Sinicae，2013，49（12）：81-87.

[30] 苗立祥，楊肖芳，張豫超，等.基于草莓全基因組SSR標記的開發(fā)和應用[J].分子植物育種，2021，19（4）：1210-1222. MIAO L X， YANG X F， ZHANG Y C， et al. Development of genome-wide SSR marker and application in strawberry[J]. Molecular Plant Breeding，2021，19（4）：1210-1222.

[31] 揭應碧，盧迎春，宋婉玲，等.三七基因組SSR位點分析和多態(tài)性引物開發(fā)[J].熱帶作物學報，2018，39（7）：1351-1358. JIE Y B， LU Y C， SONG W L， et al. Analysis of SSR loci in the genome of Panax notoginseng and development of polymorphic primers[J]. Journal of Tropical Crops，2018，39（7）：1351-1358.

[32] HAYDAR K， YING L C M， WIELAND M. Survey of simple sequence repeats in completed fungal genomes[J]. Molecular Biology Evolution，2005，22（3）：639.

[33] 洪文娟，郝兆祥，劉康佳，等.基于石榴全基因組序列的SSR標記開發(fā)及鑒定[J].北京林業(yè)大學學報，2019，41（8）：38-47. HONG W J， HAO Z X， LIU K J， et al. Development and identification of SSR molecular markers based on whole genomic sequences of Punica granatum[J]. Journal of Beijing Forestry University，2019，41（8）：38-47.

[34] TUSKAN G A， GUNTER L E， YANG Z K， et al. Characterization of microsatellites revealed by genomic sequencing of Populus trichocarpa[J].Canadian Journal of Forest Research，2004，34： 85-93.

[35] 吳敏，杜紅巖，烏云塔娜，等.杜仲基因組微衛(wèi)星特征及SSR標記開發(fā)[J].林業(yè)科學研究，2015，28（3）：387-393. WU M， DU H Y， WUYUN T N， et al. Microsatellite characteristics and SSR marker development of Eucommia ulmoides genome[J]. Forest Research，2015，28（3）：387-393.

[36] 張曼，田娟，孫墨可，等.基于向日葵全基因組序列的SSR標記開發(fā)及鑒定[J].分子植物育種，2022，20（10）：3294-3299. ZHANG M， TIAN J， SUN M K， et al. Development and identification of SSR markers based on the entire genome sequence of sunflowers [J]. Molecular Plant Breeding，2022，20（10）： 3294-3299.

[37] 呂寶忠.多態(tài)信息量（PIC）等于雜合度嗎？[J].遺傳，1994，16（4）： 31-33. LYU B Z. Does the polymorphism information content equal the heterozygosity？[J]. Hereditas，1994，16（4）：31-33.

[38] AMOANIMAA-DEDE H， ZHANG J， SU C， et al. Development and characterization of simple sequence repeat （SSR） markers from the genomic sequence of sweet potato [Ipomoea batatas L.（Lam）][J]. Biocell，2021，45（4）：1095-1105.

[39] 李淑嫻，張新葉，王英亞，等.桉樹 EST 序列中微衛(wèi)星含量及相關特征[J].植物學報，2010，45（3）：363-371. LI S X， ZHANG X Y， WANG Y Y， et al. Content and characteristics of microsatellites detected in expressed sequences in Eucalyptus[J]. Chinese Bulletin of Botany，2010，45（3）：363-371.

[40] TEMNYKH S， DECLERCK G， LUKASHOVA A. Computational and experimental analysis of microsatellites in rice （Oryza sativa L.）： frequency， length variation， transposon associations， and genetic marker potential[J]. Genome Research，2001，11（8）： 1441-1452.

[41] 鄧童，張曉龍，劉學森，等.單葉薔薇居群葉功能性狀變異特征分析[J/OL].分子植物育種，http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46. 1068.S.20220304.1000.002.html. DENG T， ZHANG X L， LIU X S， et al. Variation characteristics of leaf functional trait in Rosa persica populations[J/OL]. Molecular Plant Breeding， http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20220304. 1000.002.html.

[42] 鄭書星，張建國，何彩云，等.新疆額爾齊斯河流域白楊派植物居群遺傳多樣性分析[J].林業(yè)科學研究，2015，28（2）： 222-229. ZHENG S X， ZHANG J G， HE C Y， et al. Genetic diversity of section leuce in Populus along the Erqis river[J]. Forest Research， 2015，28（2）：222-229.

[本文編校：吳 彬]