根蘗與嫁接繁殖靈武長棗不同時期果實差異表達基因分析

摘 要：【目的】研究靈武長棗根蘗繁殖與嫁接繁殖果實品質(zhì)差異的內(nèi)在機理，為提高其果實品質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！痉椒ā恳造`武長棗根蘗繁殖與嫁接繁殖白熟期（NB）、著色期（NZ）、成熟期（NC）和嫁接繁殖白熟期（JB）、著色期（JZ）、成熟期（JC）的果實為試驗材料，采用高通量測序技術(shù)進行果實轉(zhuǎn)錄組測序，篩選與根蘗和嫁接繁殖的靈武長棗果實品質(zhì)差異相關(guān)的基因，初步探究根蘗和嫁接繁殖靈武長棗果實不同時期基因表達差異情況。【結(jié)果】18個靈武長棗樣品經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測序，得到質(zhì)控數(shù)據(jù)138.26 GB，將其比對到參考基因組冬棗上，18個樣品的Cleans reads與參考基因組比對效率在93.77%以上。主成分分析結(jié)果顯示，3次生物學(xué)重復(fù)樣品聚集程度較高且組間存在分離現(xiàn)象，說明其基因表達量存在差異。差異分析結(jié)果表明，靈武長棗果實發(fā)育各時期組間分析對比中，果實白熟期（JB-vs-NB）、著色期（JZ-vs-NZ）和成熟期（JC-vs-NC）各組間分別篩選出65、4 509和1 534個差異基因。GO功能富集到生物過程、分子功能和細胞組分三大類中的50個亞類中，KEGG通路注釋將差異基因顯著富集在次生代謝物生物合成、代謝途徑、氨基酸生物合成等通路中，成熟期差異基因富集在糖酸相關(guān)通路的顯著性較高。【結(jié)論】在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝，乙醛酸和二羧酸代謝、丁酸代謝5條與果實可溶性糖和總酸含量相關(guān)的代謝途徑中篩選出了ncbi_107424266、ncbi_107414286、ncbi_107425230、ncbi_107429837等31個差異基因，分別在果實發(fā)育不同時期的糖酸代謝途徑中差異表達，調(diào)控各時期果實中可溶性糖及總酸含量。

關(guān)鍵詞：靈武長棗；根蘗繁殖；嫁接繁殖；差異基因

中圖分類號：S727.3；S793.9 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）06-0030-13

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32060338）。

Differential gene expression analysis of Lingwuchangzao jujube fruit at different stages of root tiller and grafting reproduction

YANG Rong1， LIU Jiajia1， LI Xueni1， YU Ruili2， MA Yuan1

（1. College of Forestry and Prataculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， Ningxia， China； 2. Ningxia Wolfberry Industry Development Center， Yinchuan 750000， Ningxia， China）

Abstract：【Objective】The differences in the internal mechanism of fruit quality between root tiller reproduction and grafting reproduction of ‘Lingwuchangzao’ jujube were studied to provide basic research for improving its fruit quality.【Method】The fruits of‘Lingwuchangzao’ jujube root tiller reproduction and grafting reproduction at white maturity stage （NB）， coloring stage （NZ）， maturity stage （NC） and grafting reproduction at white maturity stage （JB）， coloring stage （JZ） and maturity stage （JC） were used as experimental materials. High-throughput sequencing technology was used to sequence the fruit transcriptome. The differential genes related to the quality difference of ‘Lingwuchangzao’ jujube fruit of root tiller and grafting reproduction were screened， and the gene expression differences of the fruit of root tiller and grafting reproduction at different stages were preliminarily explored.【Result】The 18‘Lingwuchangzao’ jujube samples were subjected to transcriptome sequencing to obtain 138.26 GB of quality control data， which were aligned to the reference genome winter jujube. The cleans reads of the 18 samples were aligned with the reference genome. The efficiency was above 93.77%. The principal component analysis results showed that the three biological repeat samples had a higher degree of aggregation， and there was a separation phenomenon between the groups， indicating that there were differences in gene expression. After the difference analysis， the results showed that in the analysis and comparison of the fruit development of ‘Lingwuchangzao’ jujube in each period， 65， 4 509 and 1 534 differentially expressed genes were screened out in the white ripening period （JB-vs-NB）， coloring period （JZ-vs-NZ） and ripening period （JC-vs-NC）， respectively. The GO function was enriched into 50 subcategories of three categories： biological process， molecular function and cellular component. The KEGG pathway annotation significantly enriched the differentially expressed genes in secondary metabolite biosynthesis， metabolic pathway， amino acid biosynthesis and other pathways. The differentially expressed genes in mature stage were significantly enriched in sugar and acid related pathways.【Conclusion】Among five metabolic pathways related to fruit soluble sugar and total acid content， starch and sucrose metabolism， galactose metabolism， amino sugar and nucleotide sugar metabolism， glyoxylic acid and dicarboxylic acid metabolism， and butyric acid metabolism， 31 differential genes such as ncbi_107424266， ncbi_107414286， ncbi_107425230， ncbi_107429837 were screened out， which were differentially expressed in the sugar and acid metabolic pathways at different stages of fruit development， regulating the soluble sugar and total acid content in fruits at different stages.

Keywords： Lingwuchangzao jujube； root tiller reproduction； grafting propagation； differential genes

靈武長棗是寧夏重要的經(jīng)濟林樹種，是優(yōu)秀的鮮食棗品種，其果皮顏色鮮艷、口感脆甜多汁、營養(yǎng)豐富，受到廣大消費者的青睞[1]。隨著靈武長棗產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，消費者對于靈武長棗的果實品質(zhì)也提出了更高要求[2]。在實際生產(chǎn)中，靈武長棗以傳統(tǒng)的根蘗繁殖和嫁接繁殖2種方式為主進行繁殖[3]。根蘗繁殖可以保持母樹抗旱、耐鹽堿等優(yōu)良遺傳性狀，但所生產(chǎn)的根蘗苗數(shù)量有限[4]，生長速度緩慢；而嫁接繁殖的靈武長棗植株生長快、樹勢強、結(jié)果早[5]，適宜于大規(guī)模發(fā)展。然而生產(chǎn)及研究中均發(fā)現(xiàn)嫁接苗的棗果風(fēng)味及營養(yǎng)品質(zhì)不如根蘗苗，2種繁殖方式各有優(yōu)劣，在生產(chǎn)中都有廣泛的應(yīng)用[6-7]。

近年來，隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)在各個領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，對于棗樹各器官的差異性研究不再局限于物候期[8-9]、土壤養(yǎng)分[10-11]及葉片光合[12-13]等生長表現(xiàn)上，在分子水平上的研究也越來越多。包括基于RNA-Seq分析鑒定棗果皮顏色相關(guān)差異基因[14]、對成熟期的靈武長棗果實進行轉(zhuǎn)錄組測序篩選到調(diào)控果實糖酸的關(guān)鍵差異基因[15]等研究，但未見對不同繁殖方式下，不同時期棗果實基因表達差異研究。

本研究采集3個發(fā)育時期的靈武長棗果實提取RNA，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，比較2種繁殖方式下果實基因序列的差異，篩選與根蘗和嫁接繁殖的靈武長棗果實品質(zhì)差異相關(guān)的差異基因，初步探究根蘗和嫁接繁殖靈武長棗果實營養(yǎng)品質(zhì)和基因表達差異情況，以期為后續(xù)探明2種繁殖方式的靈武長棗果實品質(zhì)差異調(diào)控機理提供基礎(chǔ)研究參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于寧夏靈武市千畝設(shè)施果業(yè)基地（106°15′04″E，38°04′22″N），海拔1 115 m，該地氣候類型為大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫8.8 ℃，年降水量206.2～255.2 mm。

1.2 試驗材料

本試驗供試樣樹為8年生靈武長棗根蘗植株和以酸棗為砧木的靈武長棗嫁接植株（嫁接時間一致），根蘗植株平均地徑83 mm、樹高2.45 m、冠幅2.51 m×2.42 m，嫁接植株平均地徑8.9 cm、樹高2.63 m、冠幅2.53 m×2.49 m。分別選取5株生長基本一致、無病蟲害的靈武長棗根蘗植株和嫁接植株進行果實采集，在靈武長棗果實白熟期、著色期和成熟期時，每株采集5顆果實，各時期每個處理得到25顆果實，混合后作為試驗材料。

1.3 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

對所得到的試驗材料進行隨機取樣，并設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，共18個樣品。將樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行測序。樣品編號分別為靈武長棗嫁接植株不同時期果實（JB、JZ、JC），靈武長棗根蘗植株不同時期果實（NB、NZ、NC）。基于Illumina Novaseq 6000測序平臺，對樣品的所有mRNA進行測序，采用 Illumina Truse qTM RNA sample prep Kit方法進行文庫構(gòu)建。對轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量監(jiān)控，經(jīng)過濾后得到高質(zhì)量的Clean reads，利用Trinity軟件對得到的Clean Reads進行拼接組裝，將測序數(shù)據(jù)以冬棗基因組為參考基因組進行比對、注釋。利用R語言DESeq數(shù)據(jù)包篩選差異表達的基因，以FPKM=1為基因表達標(biāo)準(zhǔn)，以FDR<0.05、|log2 FC|>log2 （2）作為差異基因篩選條件。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（https：// www.genome.jp/kegg/）和The Gene Ontology Resource（http：//gene ontology.org/）數(shù)據(jù)庫對差異基因進行注釋，利用R語言完成GO和KEGGpathway顯著性富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測

經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測序、原始數(shù)據(jù)凈化和質(zhì)量過濾，從18個靈武長棗樣品中共獲得138.26 GB數(shù)據(jù)（表1）。測序質(zhì)量在99%和99.9%以上的堿基占總堿基的百分比（Q20、Q30）分別在97.02%和91.81%以上，GC堿基含量（GC content）為43.10%～43.90%，且單個堿基位置的測序錯誤率小于1%，說明根蘗與嫁接繁殖的靈武長棗果實各時期轉(zhuǎn)錄組的測序質(zhì)量較高，數(shù)據(jù)可靠，可用于下一步數(shù)據(jù)分析。

將根蘗與嫁接繁殖的靈武長棗測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組冬棗（NCBI_GCF_020796205.1）上，18個樣品的Clean reads與參考基因組的比對效率（Total mapped）為93.77%～95.10%（表2），比對到參考基因組唯一位置的reads為89.73%～91.10%，2種繁殖方式的靈武長棗果實與參考基因組的匹配率都較高，證明選擇的參考基因組能夠為本次分析試驗提供正確可靠的背景信息。

基于表達量信息，利用R語言開展主成分分析（Principal component analysis，PCA），研究樣本間的距離關(guān)系。如圖1所示，主成分PC1的貢獻率為93.4%，主成分PC2的貢獻率為3.3%。3次生物學(xué)重復(fù)的樣本聚集程度較高，表明不同重復(fù)間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的高度重現(xiàn)性和試驗數(shù)據(jù)的可靠性，且不同組間存在良好的分離現(xiàn)象，說明3個生長發(fā)育時期基因表達量存在差異，為下一步試驗奠定基礎(chǔ)。

2.2 根蘗與嫁接繁殖靈武長棗不同時期差異基因表達量分析

不同發(fā)育時期靈武長棗果實差異基因表達量結(jié)果顯示（圖2），2種繁殖方式的果實在白熟期（JB-vs-NB）的對比中共篩選到65個差異基因，其中上調(diào)表達的基因30個，下調(diào)表達的基因35個；著色期（JZ-vs-NZ）相比，得到4 509個差異表達的基因，其中上調(diào)基因2 892個，下調(diào)基因1 617個；成熟期（JC-vs-NC）處理相比，篩選到1 534個差異基因，包括677個上調(diào)基因，857個下調(diào)基因。

通過繪制不同發(fā)育時期靈武長棗果實差異基因表達量韋恩圖（圖3）發(fā)現(xiàn)，根蘗與嫁接繁殖的靈武長棗果實在白熟期（JB-vs-NB）有39個差異基因特異表達，著色期（JZ-vs-NZ）有3 938個差異基因特異表達，成熟期（JC-vs-NC）有976個差異基因特異表達。根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育3個時期篩選出的共有差異基因有7個（表3），分別是MSTRG.1546、MSTRG.21442、MSTRG.9423、ncbi_107404917、ncbi_107423910、ncbi_107426831和ncbi_125420622，7個差異基因目前未明確注釋在KEGG途徑中，其中 ncbi_107426831和ncbi_125420622由RAV轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控表達量，相關(guān)研究表明RAV轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)調(diào)控中起著重要作用[16]。

2.3 根蘗與嫁接繁殖靈武長棗不同時期差異基因GO功能富集分析

根據(jù)根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育不同時期差異基因GO功能富集的結(jié)果顯示（圖4～6），3個時期差異基因均注釋到生物過程、分子功能、細胞組分3個類別中，白熟期（JB-vs-NB）、著色期（JZ-vs-NZ）、成熟期（JC-vs-NC）在GO數(shù)據(jù)庫中分別鑒定出203、20 312、7 176個差異基因。在生物過程大類中，白熟期（JB-vs-NB）差異基因主要注釋在細胞過程、代謝過程、刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)、定位、發(fā)育過程等16個亞類中；著色期（JZ-vs-NZ）差異基因注釋在29個條目中；成熟期（JC-vs-NC）差異基因主要注釋有27個條目。在分子功能大類中，JB和NB組差異基因主要注釋在結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運活性、ATP依賴性活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性、結(jié)構(gòu)分子活性等7個亞類中，JZ和NZ組差異基因注釋在18個條目中，JC和NC組中差異基因注釋在15個條目中；在細胞組分大類中，JB和NB組注釋到細胞結(jié)構(gòu)實體和含蛋白質(zhì)復(fù)合體2個亞類中，分別有21和5個差異基因，JZ和NZ、JC和NC注釋在3個亞類中，包括細胞結(jié)構(gòu)實體、含蛋白質(zhì)復(fù)合體和病毒體成分。

2.4 根蘗與嫁接繁殖靈武長棗不同時期差異基因KEGG富集分析

對根蘗與嫁接繁殖靈武長棗不同時期的差異基因進行KEGG富集分析，結(jié)果表明，白熟期（JB-vs-NB）（圖7A）差異基因主要富集在次生代謝物生物合成、代謝途徑、類胡蘿卜素生物合成、淀粉和蔗糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝等通路中，著色期（JZ-vs-NZ）（圖7B）差異基因主要富集在代謝途徑、光合作用、次生代謝物生物合成、卟啉代謝等通路中，其中參與代謝途徑的基因數(shù)量最多（510個），占比56.6%；成熟期（JC-vs-NC）（圖7C）差異基因主要富集在氨基糖和核苷酸糖代謝（20，6.29%）、代謝途徑（174，54.72%）、丁酸代謝（5，1.57%）、半乳糖代謝（9，2.83%）等通路中。

2.5 果實品質(zhì)形成相關(guān)的主要差異基因篩選

根據(jù)根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育白熟期、著色期和成熟期的差異基因KEGG通路富集結(jié)果，差異顯著性較強的與果實可溶性糖和總酸含量密切相關(guān)的途徑有淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism，ko 00500）、半乳糖代謝（Galactose metabolism，ko 01187）、氨基糖和核苷酸糖代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism，ko 13648）、乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism，ko 00630）、丁酸代謝（Butanoate metabolism，ko 00650）。本研究以這5條作為主要關(guān)注通路，根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育白熟期、著色期和成熟期3個時期分別有不同數(shù)量差異基因注釋在5條相關(guān)通路上，各通路之間互相作用、相互影響，共同構(gòu)成了根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實品質(zhì)差異的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制。本研究選取各通路中差異倍數(shù)排序前五的差異基因進行展示。

2.5.1 果實發(fā)育白熟期

根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育白熟期對比，差異基因相對著色期和成熟期較少，富集在淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝這3條通路中的差異基因數(shù)共7個。其中在淀粉和蔗糖代謝通路中有ncbi_107410850和ncbi_107424266兩個上調(diào)基因差異表達，差異倍數(shù)分別是2.18和2.66。ncbi_107412669基因下調(diào)表達，差異倍數(shù)為4.82。氨基糖和核苷酸糖代謝通路中有ncbi_107424266一個差異基因上調(diào)表達，差異倍數(shù)為2.66倍，ncbi_107404967基因下調(diào)表達，差異倍數(shù)為34.80；乙醛酸和二羧酸代謝通路中有1個差異基因ncbi_107417353上調(diào)表達， 1個差異基因ncbi_107415024下調(diào)表達，差異倍數(shù)分別是2.33和6.67倍?？傮w上，根蘗與嫁接繁殖果實發(fā)育白熟期可溶性糖含量相關(guān)的2條主要途徑中有3個差異基因上調(diào)表達，2個基因下調(diào)表達，與總酸含量相關(guān)的1條通路中上調(diào)基因數(shù)和下調(diào)基因數(shù)均為1個。

2.5.2 果實發(fā)育著色期

根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育著色期注釋在可溶性糖和總酸相關(guān)的5條通路中的有25個差異基因，與可溶性糖相關(guān)的上調(diào)表達基因有4個，下調(diào)表達基因有11個，與總酸相關(guān)的上調(diào)表達基因有5個，下調(diào)表達基因有5個。在淀粉和蔗糖代謝途徑中，ncbi_107430563和ncbi_107432082兩個基因上調(diào)表達，差異倍數(shù)分別為31.19、20.03?；騨cbi_107409332、ncbi_107430302、ncbi_112491050下調(diào)表達，差異倍數(shù)分別是19.83、22.79、28.57；在半乳糖代謝途徑中，僅ncbi_107432082基因上調(diào)表達，其余4個基因均下調(diào)表達；在氨基糖和核苷酸糖代謝途徑中，1個基因上調(diào)表達，4個基因下調(diào)表達，差異倍數(shù)為4.51～19.83，在乙醛酸和二羧酸代謝途徑中，基因ncbi_107405417、ncbi_107433052和ncbi_107423244上調(diào)表達，差異倍數(shù)分別是3.38、3.54、5.78，基因ncbi_107415024和ncbi_ 107429892下調(diào)表達，差異倍數(shù)分別是3.99、3.37；丁酸代謝途徑中，2個基因上調(diào)表達，差異倍數(shù)分別是3.18、3.30，3個基因下調(diào)表達，差異倍數(shù)最高為4.24。

2.5.3 果實發(fā)育成熟期

根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育成熟期在可溶性糖和總酸相關(guān)的5條通路中注釋的差異基因共有18個。與可溶性糖相關(guān)的上調(diào)表達基因有4個，下調(diào)表達基因有8個，與總酸相關(guān)的上調(diào)表達基因有1個，下調(diào)表達基因5個。淀粉和蔗糖代謝途徑中基因ncbi_125422819上調(diào)表達，差異倍數(shù)為5.51，4個差異基因下調(diào)表達，差異倍數(shù)最高為6.62；在半乳糖代謝途徑中，2個基因ncbi_107418468、ncbi_125422819均為上調(diào)表達，差異倍數(shù)分別是2.85、5.51；氨基糖和核苷酸糖代謝途徑中僅1個基因ncbi_112492524上調(diào)表達，其余4個基因均下調(diào)表達，差異倍數(shù)最高為7.49；乙醛酸和二羧酸代謝途徑中僅有1個基因ncbi_107415818下調(diào)表達，差異倍數(shù)為2.16；丁酸代謝途徑中1個差異基因ncbi_107423578上調(diào)表達，4個差異基因下調(diào)表達，差異倍數(shù)為2.00～6.07。

2.5.4 3個時期差異表達基因?qū)Ρ?/p>

在根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育白熟期、著色期和成熟期差異基因?qū)Ρ龋▓D7）中發(fā)現(xiàn)，與可溶性糖有關(guān)的淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝，與總酸含量相關(guān)的乙醛酸和二羧酸代謝、丁酸代謝5條途徑中，共有31個差異基因在果實發(fā)育不同時期或同一時期不同途徑中均有富集，其中與可溶性糖相關(guān)的有28個差異基因，與總酸相關(guān)的有3個差異基因，并對這31個差異基因進行blast分析。

31個差異基因blast分析結(jié)果（表7）表明，ncbi_ 107425230、ncbi_125422819、ncbi_107418468等5個差異基因分布在參考基因組冬棗的1號染色體上，ncbi_107405417、ncbi_107418465等4個基因分布在2號染色體上，ncbi_107422361、ncbi_112489059分布在3號染色體，ncbi_107404604分布在4號染色體上，ncbi_107420179等3個基因分布在5號染色體上，ncbi_107429837、ncbi_107430147等4個基因分布在6號染色體上，ncbi_107424266分布在7號染色體上，ncbi_107412906、ncbi_107404967等4個基因位于8號染色體上，ncbi_107409332、ncbi_107426021等4個基因位于9號染色體上，ncbi_107432082、ncbi_107435723等3個基因位于參考基因組冬棗11號染色體上。

在根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育白熟期，基因ncbi_107424266同時富集在淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝2條途徑中；著色期有ncbi_107414286、ncbi_107425230、ncbi_ 107429837等7個基因同時富集在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等途徑中的至少2條途徑中。其中與可溶性糖有關(guān)的有6個差異基因，僅1個差異基因ncbi_107425230與總酸含量相關(guān)。著色期和成熟期富集在2條以上糖酸相關(guān)途徑中的差異基因共有ncbi_107409332、ncbi_107414395、ncbi_107418468和ncbi_ 107420179，2個時期共同存在差異僅富集在單條途徑上的差異基因有ncbi_107405417、ncbi_ 107412906、ncbi_107418465等16個，其中14個富集在可溶性糖含量相關(guān)途徑上，2個基因ncbi_ 107404604和ncbi_107419655富集在丁酸代謝途徑中；果實成熟期ncbi_125422819富集在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝2條途徑中，ncbi_107421126同時富集在半乳糖代謝和氨基糖和核苷酸糖代謝途徑中。果實發(fā)育白熟期和成熟期無共同富集的差異基因。

3 討 論

目前開展了一些靈武長棗轉(zhuǎn)錄組方面的研究，但轉(zhuǎn)錄組信息仍比較少，并缺少不同時期靈武長棗果實轉(zhuǎn)錄組信息。本研究發(fā)現(xiàn)根蘗和嫁接2種繁殖方式下的靈武長棗果實各發(fā)育時期間存在大量的差異表達基因，并且上、下調(diào)基因數(shù)量不等，表明果實在成熟過程中上、下調(diào)基因在基因差異表達中的促進或抑制作用復(fù)雜。果實白熟期差異表達基因較少，著色期和成熟期差異表達基因增加。本研究中主要關(guān)注與果實中可溶性糖和總酸含量相關(guān)的代謝途徑，在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、丁酸代謝5條途徑中篩選出了31個差異基因，為下一步探究根蘗和嫁接繁殖靈武長棗果實不同發(fā)育期糖酸等營養(yǎng)物質(zhì)含量的分子調(diào)控機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

馬亞平等[15]研究了根蘗和嫁接靈武長棗成熟果實轉(zhuǎn)錄組之間的差異，共分析篩選出27個顯著差異表達基因，其中9個顯著上調(diào)，18個顯著下調(diào)；GO富集分析結(jié)果表明15個差異基因顯著富集到GO的三大功能類別分子功能、細胞組分、生物過程中；KEGG富集分析結(jié)果表明10個差異表達基因顯著富集到12條代謝通路中，其中包括3個上調(diào)基因和7個下調(diào)基因。進一步篩選出調(diào)控糖及有機酸代謝關(guān)鍵差異基因BAM1、PCO和HAOX1在淀粉和蔗糖代謝、牛膽素和亞?；撬岽x、乙醛酸和二羧酸代謝中顯著表達，并在糖和有機酸的相互轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，其中，BAM1注釋信息為β-淀粉酶，PCO注釋信息為半胱氨酸氧化酶，HAOX1注釋信息為羥基酸氧化酶，均未在本研究中出現(xiàn)。

蘇媚等[17]以同一果園不同砧木的8年生嫁接香橙、紅桔和枳砧鮑威爾臍橙成熟果實作為試驗材料，分析其生理和生化指標(biāo)及糖酸代謝相關(guān)基因的表達情況。結(jié)果表明，砧木對可食率、可滴定酸含量及果皮色澤均無明顯影響，但對臍橙果實的單果質(zhì)量、果皮厚度、可溶性固形物含量、維生素C含量、可溶性糖含量和有機酸含量存在較大影響。香橙砧臍橙的單果質(zhì)量和果皮厚度顯著大于枳砧臍橙。紅桔砧臍橙果肉中糖、酸的含量均顯著低于香橙砧和枳砧臍橙。其分子機理是紅桔砧臍橙果肉中蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因CsSUC1和CsSC4表達量低，糖酵解途徑關(guān)鍵酶之一的丙酮酸激酶基因CsPKP3表達量高；檸檬酸合成酶CsCS2表達量較低，檸檬酸降解酶谷氨酸脫羧酶基因CsGDH1和谷氨酰胺合成酶基因Cs-GH1表達量高。類似的研究也表明，葡萄和蘋果都有幾個MYB轉(zhuǎn)錄因子參與果皮花色素苷的生物合成，有時也與 b HLH和WD40相互影響[18]。在對“泰山紅”和“牡丹”2個石榴品種成熟期果實轉(zhuǎn)錄組的研究中發(fā)現(xiàn)，鑒定出參與石榴果實糖酸代謝的關(guān)鍵基因有17個，‘泰山紅’中FRK、SS、BGLU、UXS、FBA和ADH基因的表達量高于‘牡丹’[19]。石榴果實中，葡萄糖和果糖是主要的糖組分，酸以檸檬酸和蘋果酸為主，差異基因在糖酸代謝中如何調(diào)控還需進一步研究。

植物細胞轉(zhuǎn)錄表達后，涉及轉(zhuǎn)錄后修飾[20]、蛋白質(zhì)翻譯[21]、翻譯后修[22-23]的過程，轉(zhuǎn)錄結(jié)果才能在代謝水平上呈現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄組是基因表達的媒介，而代謝組反映細胞表型和功能的變化[24]。本研究中主要對根蘗與嫁接繁殖的靈武長棗在果實發(fā)育時期存在的差異基因進行了初步探究，其在代謝物水平也可能存在一定差異，后續(xù)研究中可以進一步探討代謝物水平的異同之處，并可分析其代謝調(diào)控的分子機制。

4 結(jié) 論

基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育各時期組間分析對比中，果實白熟期（JB-vs-NB）、著色期（JZ-vs-NZ）、成熟期（JC-vs-NC）各組間分別鑒定出65、4 509和1 534個差異基因。GO功能富集到生物過程、分子功能和細胞組分三大類中的50個亞類中，KEGG通路注釋將差異基因顯著富集在次生代謝物生物合成、代謝途徑和氨基酸生物合成等通路中，成熟期差異基因富集在糖酸相關(guān)通路的顯著性較高。

根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實發(fā)育白熟期、著色期和成熟期果實在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、丁酸代謝5條與果實可溶性糖和總酸含量相關(guān)的代謝途徑中篩選出了ncbi_107424266、ncbi_107414286、ncbi_107425230、ncbi_107429837等31個差異基因，分別在果實發(fā)育不同時期的糖酸代謝途徑中差異表達，調(diào)控各時期果實中可溶性糖及總酸含量。

參考文獻：

[1] 李百云，李慧.靈武長棗早熟優(yōu)系選育[J].果樹資源學(xué)報， 2021，2（6）：81-86. LI B Y， LI H. Breeding of early maturing superior lines of Lingwu long jujube[J]. Journal of Fruit Tree Resources，2021，2（6）：81-86.

[2] 院欽，張欣，任玉鋒，等.冷棚栽培對靈武長棗果實品質(zhì)的影響[J].中國南方果樹，2023，52（5）：170-174. YUAN Q， ZHANG X， REN Y F， et al. Effect of cold shed cultivation on fruit quality of Lingwu long jujube[J]. South China Fruits Trees，2023，52（5）：170-174.

[3] 李振強，馬旭，田應(yīng)明，等.不同施氮量對靈武長棗各發(fā)育階段果實品質(zhì)的影響[J].經(jīng)濟林研究，2022，40（4）：124-132. LI Z Q， MA X， TIAN Y M， et al. Effects of different nitrogen rates on fruit quality of Lingwuchangzao at different developmental stages[J]. Non-wood Forest Research，2022，40（4）：124-132.

[4] ZHANG Z， WEI T J， ZHONG Y， et al. Construction of a highdensity genetic map of Ziziphus jujuba Mill. using genotyping by sequencing technology[J]. Tree Genetics Genomes，2016， 12（4）：76.

[5] GAIKWAD S P， CHALAK S U， KAMBLE A B. Effect of spacing on growth， yield and quality of mango[J]. Journal of Krishi Vigyan，2017，5（2）：50-53.

[6] 萬仲武，芮長春，張治業(yè).靈武長棗物候期與氣溫和地溫的關(guān)系研究[J].北方園藝，2013（15）：47-50. WAN Z W， RUI C C， ZHANG Z Y. Study on relationship between phonological period and air temperature， soil temperature of Zizyphus jujube Mill cv. Lingwuchangzao[J]. Northern Horticulture，2013（15）：47-50.

[7] 紀(jì)晴，石倩倩，徐世宏，等.棗產(chǎn)品開發(fā)現(xiàn)狀及未來趨勢研究[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技，2015，26（7）：11-12，20. JI Q， SHI Q Q， XU S H， et al. Research on the current situation and future trend of jujube product development[J]. Rural Economy of Science and Technology，2015，26（7）：11-12，20.

[8] 陳麗華，楊喜盟，賈昊，等.氣溫升高與干旱對靈武長棗果實糖積累、蔗糖代謝關(guān)鍵酶及相關(guān)基因表達的影響[J].核農(nóng)學(xué)報，2020，34（9）：2112-2123. CHEN L H， YANG X M， JIA H， et al. Effects of elevated temperature and drought on sugar accumulation， key sucrose enzymes metabolism and related gene expression in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2020，34（9）：2112-2123.

[9] BI X Y， LIAO L， DENG L J， et al. Combined transcriptome and metabolome analyses reveal candidate genes involved in Tangor（Citrus reticulate×Citrus sinensis） fruit development and quality formation[J]. Molecular Sciences，2022，23（10）：5457.

[10] 李振強.根蘗與嫁接繁殖對靈武長棗生長、葉片性狀及根系生長的影響[D].銀川：寧夏大學(xué)，2022. LI Z Q. Effects of tiller propagation and graft propagation on growth， leaf traits and root growth of ‘Lingwuchangzao’[D]. Yinchuan： Ningxia University，2022.

[11] 劉豐鳴，黃瑤，劉偉鋒，等.施肥對阿克蘇地區(qū)駿棗園土壤、葉片養(yǎng)分及棗果品質(zhì)的影響[J].經(jīng)濟林研究，2023，41（1）： 106-116. LIU F M， HUANG Y， LIU W F， et al. Effect of fertilization on soil nutrients， leaf nutrients and fruit quality of Jun jujube inAksu[J]. Non-wood Forest Research，2023，41（1）：106-116.

[12] KRONER G M， THOMAS R L， JOHNSON-DAVIS K L. Retrospective analysis of pediatric and adult populations using an LC-MS/MS method for Oxcarbazepine /Eslicarbazepine metabolite[J]. The Journal of Applied Laboratory Medicine，2020，6（3）： 637-644.

[13] 禹瑞麗，劉佳嘉，吳國偉，等.靈武長棗根蘗苗與嫁接苗葉片光合特性的比較[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2023，43（9）：70-79. YU R L， LIU J J， WU G W， et al. Comparison of photosynthetic characteristics between the root tiller seedlings and grafted seedlings of Ziziphus jujube ‘Lingwuchangzao’[J]. Journal of Central South University of Forestry Technology，2023，43（9）： 70-79.

[14] 韓雅茹.氣溫升高與干旱互作下靈武長棗果皮花青苷合成的代謝調(diào)控機制[D].銀川：寧夏大學(xué)，2023. HAN Y R. Metabolic regulation mechanism of anthocyanin synthesis in the pericarp of Zipiphus jujuba Mill cv.‘Lingwuchangzao’ under interaction of elevated temperature and drought stress[D]. Yinchuan： Ningxia University，2023.

[15] 馬亞平，白琳云，徐偉榮，等.靈武長棗嫁接和根蘗繁殖植株果實轉(zhuǎn)錄組差異分析[J].分子植物育種，2021，19（16）：5297-5306. MA Y P， BAI L Y， XU W R， et al. Transcriptome differences analysis of fruit of grafting and root tiller propagation of‘Lingwuchangzao’ jujube[J]. Molecular Plant Breeding，2021，19（16）： 5297-5306.

[16] ZHANG C W， WANG X Y， LI H W， et al. GLRaV-2 protein p24 suppresses host defenses by interaction with a RAV transcription factor from grapevine[J]. Plant Physiology，2022，189（3）： 1848-1865.

[17] 蘇媚，伊華林.砧木對臍橙果實品質(zhì)及糖酸代謝相關(guān)基因表達的影響[J].中國南方果樹，2016，45（5）：34-37. SU M， YI H L. Effects of rootstocks on fruit quality and expression of genes related to sugar and acid metabolism in navel orange[J]. South China Fruits，2016，45（5）：34-37.

[18] 程嬌.MeSA處理調(diào)控桃形李采后果實花色苷合成代謝的研究[D].浙江：浙江工商大學(xué)，2022. CHENG J. MeSA regulates anthocyanin anabolism in postharvest taoxingli plum[D]. Hangzhou： Zhejiang Gongshang University，2022.

[19] 馮立娟，付瑩，王傳增，等.基于RNA-Seq鑒定不同石榴品種間果實糖酸代謝基因[J].植物生理學(xué)報，2022，58（6）：1161-1172. FENG L J， FU Y， WANG C Z， et al. Identification of sugar and acid metabolism genes in different pomegranate （Punica granatum） cultivars based on RNA-Seq[J]. Plant Physiology Journal，2022，58（6）： 1161-1172.

[20] CHAUDHARY S， JABRE I， REDDY A S N， et al. Perspective on alternative splicing and proteome complexity in plants[J]. Trends in Plant Science，2019，24（6）：496-506.

[21] KWANUK L， HUNSEUNG K. Emerging roles of RNA-binding proteins in plant growth， development， and stress responses[J]. Molecules and Cells，2016，39（3）：179-185.

[22] WASZCZAK C， AKTER S， JACQUES S， et al. Oxidative posttranslational modifications of cysteine residues in plant signal transduction[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66（10）： 2923-2934.

[23] XU S L， CHALKLEY R J， MAYNARD J C， et al. Proteomic analysis reveals O-GlcNAc modification on proteins with key regulatory functions in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2017，114（8）： 1536-1543.

[24] 蔡凈蓉，王杰，趙俊躍，等.成熟期不同橄欖品種（系）果實代謝組及其差異[J].熱帶作物學(xué)報，2022，43（11）：2304-2315. CAI J R， WANG J， ZHAO J Y， et al. Metabolomics and its difference of Chinese olive fruit of different varieties （lines） during the ripening period[J]. Journal of Tropical Crops，2022，43（11）： 2304-2315.

[本文編輯：吳 彬]