暴馬桑黃SbLSD基因克隆及差異表達分析

劉增才，王世新，孫婷婷，曲曉磊，鄒 莉

（1.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱學院 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150086）

桑黃是一類大型的藥用真菌，近幾十年來深受消費者的喜愛和追捧，主要由于桑黃在降血糖[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、增強人體免疫[4]等方面具有良好的醫(yī)療功效，并且在產(chǎn)生良好藥用效果的同時，不會使患者機體出現(xiàn)不良反應和副作用[5-6]。桑黃良好的藥用效果主要源于其富含的多種活性物質，包括三萜、多糖、黃酮、酚類等，通過分化誘導、抗侵襲轉移、對腫瘤細胞的毒作用等方式來發(fā)揮功效[7-8]。三萜是一類基本母核由30 個碳原子組成的復雜化合物，是桑黃發(fā)揮藥用功效的重要成分，并且三萜含量的多少是衡量桑黃藥用價值高低的重要指標[9]。

暴馬桑黃Sanghuangporus baumii(Pilát) L.W.Zhou &Y.C.Dai 是生長在暴馬丁香樹上的一種桑黃，目前從中分離提取得到的三萜含量較低，通過大面積人工栽培暴馬桑黃或者利用化學手段獲得大量三萜難度均較大，所以三萜的獲取限制了其藥用價值的應用。暴馬桑黃三萜是通過甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway,MVA）途徑合成的，由起始物乙酰輔酶A 經(jīng)過乙酰輔酶A ?；D移酶（acetyl-CoA acetyltransferase,AACT）、羥甲基戊二酰輔酶A 合酶（3-hydroxy-3-methylglutary-CoA synthase,HMGS）、羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR）、甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase,MVK）、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（mevalonate pyrophosphate decarboxylase,MVD）、異戊二烯焦磷酸異構酶（isopentenyl diphosphate isomerase,IDI）、羊毛甾醇合酶（lanosterol synthase,LS）等一系列酶催化后反應生成中間三萜產(chǎn)物羊毛甾醇[10]。但是羊毛甾醇如何在多種酶的催化、修飾下演變成不同結構的三萜依然未知，目前大多數(shù)研究者認為，P450 家族基因在羊毛甾醇后續(xù)反應中起著重要作用，并且已有研究者發(fā)現(xiàn)證實，在靈芝和蒺藜苜蓿等生物中存在少量P450 基因參與三萜合成過程[11-14]。如果通過分子手段對暴馬桑黃三萜合成途徑中的相關酶基因進行研究，解析三萜生物合成途徑機制，從而提高三萜產(chǎn)量，也不失為一種切實可行的獲取大量三萜的技術手段。

為此，本研究對P450 家族的暴馬桑黃SbLSD基因進行研究，基于前期測得的轉錄組數(shù)據(jù)，同時結合基因組數(shù)據(jù)篩選得到SbLSD基因電子序列，設計特異性引物進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物測序后進行生物信息學分析，并對SbLSD基因在暴馬桑黃不同發(fā)育階段的轉錄水平進行差異表達研究，可為揭示SbLSD基因在暴馬桑黃三萜合成途徑中的功能及探明三萜合成的機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的暴馬桑黃菌種DL101（GenBank KP974834）、大腸桿菌克隆菌株Top10、大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)、原核表達載體pET-32a(+)于東北林業(yè)大學森林保護學科實驗室保藏。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ、Premix Taq 酶、TB Green ? Premix Ex Taq ? Ⅱ(Tli RNaseH Plus)酶、5×In-Fusion HD 試劑盒、Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒、Prime Script ?RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒均購自大連Takara 公司。植物總RNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒均購于北京天根生化公司。質粒提取試劑盒購自于上海Omega 公司。聚丙烯酰胺凝膠電泳（dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE）試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗引物

試驗引物信息見表1。

1.2.2 SbLSD 基因克隆

采用植物總RNA 提取試劑盒提取暴馬桑黃總RNA，檢測其純度和濃度后，反轉錄成cDNA。用cDNA 為模板，SbLSD-F1、SbLSD-R1（表1）為引物進行PCR 擴增。PCR 擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，16 ℃結束。PCR 產(chǎn)物電泳檢測后，用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒進行純化回收，檢測回收產(chǎn)物濃度并送至哈爾濱擎科生物公司測序。

表1 引物信息?Table 1 Primer information

1.2.3 SbLSD 基因序列分析

將SbLSD基因測序結果提交到NCBI，并預測開放閱讀框（open reading frame，ORF）和保守結構域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；利用生物信息學軟件對SbLSD基因編碼的氨基酸序列進行預測和分析：ProtParam 預測蛋白的理化性質；TMHMM 和SignalP 分別預測蛋白的跨膜區(qū)和信號肽；NetPhos 預測蛋白的磷酸化位點；PSORT Ⅱ預測蛋白的亞細胞定位；SOPMA 和Swissmodel分別預測蛋白的二級結構和三級結構；MEGA 6.0預測蛋白系統(tǒng)進化關系[15-17]。

1.2.4 SbLSD 基因原核表達載體構建

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ對pET-32a質粒進行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后，用In-Fusion HD 試劑盒將其與SbLSD基因片段進行同源重組，得到pET-32a-SbLSD重組質粒，隨后轉入大腸桿菌Top10 感受態(tài)細胞中。從轉化后的大腸桿菌Top10中提取質粒，用引物pET-32a-F、pET-32a-R（表1）進行PCR 檢測，PCR 擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，16 ℃結束。將PCR 檢測正確的陽性質粒送至哈爾濱擎科生物公司測序。

1.2.5 SbLSD 基因誘導表達及檢測

將檢測正確的pET-32a-SbLSD質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞后進行菌落PCR檢測，將陽性菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基（含100 μg·mL-1Amp）中過夜振蕩培養(yǎng)，取50 μL 菌液加入新鮮LB 液體培養(yǎng)基（含100 μg·mL-1Amp）中振蕩培養(yǎng)，當OD600達到0.6～0.8 時收集陰性對照菌液，在剩余菌液中加入IPTG（終濃度為1 mmol·L-1）誘導表達，收集不同誘導時間段的菌液進行SDS-PAGE 檢測。

1.2.6 SbLSD 基因熒光定量檢測

將長滿培養(yǎng)皿的暴馬桑黃菌絲接種至PD 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，收集6、8、10、12、14 d 不同時間段的菌絲。同時將暴馬桑黃菌絲接到栽培袋中，接種45 d 后收集原基，60 d 后收集子實體[10]。將收集得到的暴馬桑黃材料分別提取總RNA，得到的總RNA 用Prime Script ? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒反轉錄成cDNA，采用α-tubulin基因作為內(nèi)參（表1），每組樣品設置3 個重復。qRT-PCR 反應在核酸擴增熒光檢測儀上完成，反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃1 min，40 個循環(huán)；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，95 ℃30 s。根據(jù)得到的不同Ct 值，按照公式2-ΔΔCt計算暴馬桑黃不同發(fā)育階段基因相對轉錄水平[18]。

2 結果與分析

2.1 SbLSD 基因克隆

以暴馬桑黃總RNA 反轉錄得到的cDNA 為模板，用所設計的引物在1 000～2 000 bp 之間擴增出單一的SbLSD基因條帶，與預測目的條帶大小相吻合（圖1）。純化回收產(chǎn)物送至哈爾濱擎科生物公司測序，測序結果提交到GenBank（登錄號為MN864180）。

圖1 SbLSD 基因cDNA 全長PCR 產(chǎn)物電泳檢測Fig.1 Electropherograms of SbLSD gene cDNA full-length amplified by PCR

2.2 SbLSD 基因生物信息學分析

2.2.1 SbLSD 蛋白理化性質預測

利用NCBI 網(wǎng)站上的ORF Finder 進行ORF 查找，結果顯示序列中含有一個最大長度為1 662 bp的ORF，編碼553 個氨基酸（圖2），具有P450超家族的保守結構域。ProtParam 分析結果表明，SbLSD 蛋白中亮氨酸的含量最高（8.5%），半胱氨酸的含量最低（0.5%），蛋白分子量為62.26 kDa，理論等電點為6.42，親水性的總平均值為-0.255，不穩(wěn)定系數(shù)為36.24，說明SbLSD 蛋白是親水的穩(wěn)定蛋白。

圖2 SbLSD 基因cDNA 全長及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Complete cDNA and deducted amino acid sequence of SbLSD gene

2.2.2 SbLSD 蛋白跨膜區(qū)預測

跨膜區(qū)預測是檢驗一個蛋白是否具有傳遞物質或信號的能力，其中跨膜螺旋區(qū)的位置和數(shù)量對于細胞膜的功能具有重要的影響[19]。使用TMHMM 對跨膜區(qū)預測，結果顯示SbLSD 蛋白1～30 位氨基酸在膜內(nèi)，54～553 位氨基酸在膜外，31～53 位氨基酸之間含有一個跨膜螺旋結構（圖3），說明SbLSD 蛋白可能為跨膜蛋白。

2.2.3 SbLSD 蛋白信號肽預測

信號肽是一段能將新合成的蛋白質引導到不同亞細胞器中去發(fā)揮作用的氨基酸序列，其序列長度在8～90 個氨基酸殘基之間，一般長度在18～25 個之間[20]。使用SignalP 對信號肽預測，結果表明SbLSD 蛋白在24 位和40 位氨基酸可能存在信號肽，并且在42 和43 位氨基酸間存在一個PLA-II 切割位點（圖4）。

2.2.4 SbLSD 蛋白磷酸化位點預測

修飾作用在形成多功能蛋白質的過程中具有十分重要意義，它能使蛋白質的結構更加多樣，功能更為全面，調(diào)節(jié)更為精細。磷酸化修飾作為蛋白質翻譯后的修飾之一，它在生物體內(nèi)普遍存在[21]，使用NetPhos 對磷酸化位點預測結果表明，SbLSD 蛋白存在51 個潛在的磷酸化位點，包括20 個絲氨酸位點、18 個蘇氨酸位點以及13 個酪氨酸位點（圖5）。

2.2.5 SbLSD 蛋白亞細胞定位預測

蛋白質是生命體的基本組成部分，它的功能發(fā)揮與亞細胞區(qū)間有著密切關聯(lián)，只有處在特定的亞細胞區(qū)間內(nèi)，才能發(fā)揮每種蛋白所特有的功能，通過對蛋白所處的亞細胞區(qū)間預測，有利于了解該蛋白的功能性質及和其他蛋白之間的聯(lián)系[22]。使用在線軟件PSORT Ⅱ分析SbLSD 蛋白的亞細胞定位，結果顯示其主要定位于內(nèi)質網(wǎng)（44.5%）和高爾基體（22.2%），在線粒體（11.1%）、細胞核（11.1%）、細胞質（11.1%）也有少量分布，說明SbLSD 蛋白主要在內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體完成蛋白質的加工修飾。

圖3 SbLSD 蛋白的跨膜區(qū)預測結果Fig.3 The prediction of transmembrane region for SbLSD protein

圖4 SbLSD 蛋白信號肽預測結果Fig.4 The prediction of signal peptide for SbLSD protein

圖5 SbLSD 蛋白磷酸化位點預測結果Fig.5 The prediction of phosphorylation potential for SbLSD protein

2.2.6 SbLSD 蛋白高級結構預測

使用SPOMA 軟件對SbLSD 蛋白二維結構預測分析，結果顯示43.76%的SbLSD 蛋白處于α 螺旋狀態(tài)，11.57%處于延伸狀態(tài)，3.80%處于轉角狀態(tài)，40.87%處于無規(guī)則卷曲狀態(tài)，說明該蛋白大部分氨基酸都處于卷曲狀態(tài)。使用Swissmodel 軟件對SbLSD 蛋白三維結構預測分析，結果顯示SbLSD 蛋白結構預測圖是以釀酒酵母Lanosterol 14-alpha demethylase 的蛋白三維結構圖（SMTL ID:5hs1.1.A）為模板構建的，序列相似度為45.60%（圖6）。

圖6 SbLSD 蛋白的三維結構預測結果Fig.6 Three-dimensional structure prediction for SbLSD protein

2.2.7 SbLSD 蛋白同源性分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中挑選與暴馬桑黃具有一定同源性的LSD 氨基酸序列，用MEGA 6.0 軟件構建LSD 蛋白同源進化樹（圖7）。結果顯示所有生物的LSD 蛋白聚為一大分支，說明LSD 蛋白具有同一個祖先；隨后大分支分成真菌和動物兩個次分支，可能由于不同類生物在進化過程LSD 蛋白產(chǎn)生的差異表達；而在真菌一小分支中，暴馬桑黃LSD 蛋白和靈芝LSD 蛋白同源性最高，主要由于二者均屬于多孔藥用真菌，親緣關系較近，以上結果符合生物進化關系。

2.3 重組質粒的獲得

將線性化的pET-32a 質粒和SbLSD基因片段重組后，得到pET-32a-SbLSD重組質粒，以pET-32a-F、pET-32a-R（表1）為引物進行PCR擴增檢測。結果顯示在2 000 bp 附近出現(xiàn)特異性條帶，與預測目的片段大小一致（圖8）。陽性質粒在哈爾濱擎科生物公司測序后得到電子序列，序列分析結果表明重組質粒pET-32a-SbLSD構建成功。

圖7 暴馬桑黃LSD 蛋白和其他生物LSD 蛋白的同源性分析Fig.7 Homology analysis of LSD protein of S.baumii and LSD protein of other species

圖8 重組質粒pET-32a-SbLSD PCR 檢測結果Fig.8 Results of PCR detection for recombinant plasmid pET-32a-SbLSD

2.4 SbLSD 基因原核表達

將測序結果正確的重組質粒pET-32a-SbLSD轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3) 后，用1 mmol·L-1IPTG 誘導重組蛋白表達。SDS-PAGE結果顯示，在IPTG 誘導2、4、6、8 和10 h 后，轉入重組質粒的菌體均表達出一條與目的蛋白分子量（62.26 kDa）大小相近的條帶，結果如圖9所示。進一步說明重組質粒pET-32a-SbLSD構建成功，通過IPTG 誘導成功表達出目的蛋白，且總體處于較高表達水平。

2.5 SbLSD 基因在不同發(fā)育階段轉錄水平變化

分別提取不同發(fā)育階段暴馬桑黃材料的總RNA，以反轉錄后得到的cDNA 為模板，采用qRT-PCR 檢測SbLSD基因的轉錄水平。由圖10可以看出，SbLSD基因轉錄水平在不同發(fā)育階段呈動態(tài)變化。在子實體階段SbLSD基因的轉錄水平最高，其次是原基階段，在菌絲階段，該基因轉錄水平相對較低，并且在菌絲階段培養(yǎng)14 d 時轉錄水平達到最低，僅為子實體階段SbLSD基因轉錄水平的1/3 左右。

圖9 SDS-PAGE 分析SbLSD 基因誘導表達產(chǎn)物Fig.9 Results of the expression of SbLSD gene in E.coli BL21(DE3) by SDS-PAGE analysis

圖10 不同發(fā)育階段SbLSD 基因的轉錄水平Fig.10 The transcript level of SbLSD gene in S.baumii under different developmental stages

3 結論與討論

3.1 討 論

近年來，P450 家族基因在復雜的真菌生物轉化過程中所起的作用越來越受到人們關注，羊毛甾醇14α-脫甲基化酶基因作為P450 家族成員之一，被認為是羊毛甾醇轉化成三萜過程中的一個關鍵催化酶[23]。本研究通過PCR 克隆得到SbLSD基因cDNA 序列全長，并進行生物信息學分析，結果表明SbLSD 蛋白包含P450 超家族的保守結構域，在31～53 位氨基酸之間含有一個跨膜螺旋結構，并且該蛋白是親水的穩(wěn)定蛋白，這些結構都是SbLSD基因發(fā)揮功能不可或缺的組成單位[24-25]。亞細胞定位顯示SbLSD 蛋白主要存在于內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體，推測該蛋白主要在內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體對蛋白質進行加工修飾。系統(tǒng)進化分析顯示，暴馬桑黃與靈芝聚為一支，親緣關系較近，相似性可達57.87%，符合生物進化關系，推測暴馬桑黃LSD 蛋白與靈芝等物種的LSD 蛋白在三萜合成過程中具有相似的功能。

本研究選用pET-32a 為表達載體，基于SbLSD基因全長，構建重組質粒pET-32a-SbLSD，在大腸桿菌BL21(DE3)中成功誘導出目的蛋白表達，且目的蛋白含量明顯高于雜蛋白，說明在pET-32a載體中的T7 啟動子作用下，SbLSD基因表達效果良好。此外，在研究不同誘導時間對SbLSD 蛋白產(chǎn)生的影響時，結果發(fā)現(xiàn)該蛋白表達量沒有隨著IPTG 誘導時間的延長而顯著增加，說明在原核系統(tǒng)中，誘導時間長短對該蛋白產(chǎn)量的影響不明顯，而在真核系統(tǒng)中外源誘導對SbLSD基因的表達情況影響，有待于進一步檢測驗證。

在檢測SbLSD基因在暴馬桑黃不同發(fā)育階段轉錄水平的過程中發(fā)現(xiàn)，SbLSD基因轉錄水平在不同發(fā)育階段呈動態(tài)變化，子實體階段轉錄水平較高，菌絲階段轉錄水平相對較低，其變化趨勢與羊毛甾醇合成基因在不同發(fā)育階段變化趨勢相似[12,26]，推測該基因可能對羊毛甾醇起修飾作用，進而增加三萜生物合成，該結果與上述亞細胞定位顯示SbLSD 蛋白主要存在于內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體對蛋白質加工修飾結果相吻合。

目前在植物和真菌中，研究者均發(fā)現(xiàn)有P450基因參與到三萜合成工作中。在植物中，Carelli等[13]在蒺藜苜蓿中鑒定出1 種參與三萜生物合成的P450 基因（CYP716A12），并發(fā)現(xiàn)CYP716A12基因是皂苷生物合成途徑的早期步驟，能夠在C-28位催化β-amyrin 和erythrodiol 產(chǎn)生三萜齊墩果酸；Seki 團隊[27-29]在甘草中鑒定出3 種參與三萜生物合成的P450 基因（CYP88D6，CYP72A154，CYP716A179），其中CYP88D6基因是在C-11位通過兩步氧化催化將β-amyrin 生成11-oxo-βamyrin，而CYP72A154基因和CYP716A179基因被證明是分別負責三萜甘草酸途徑中的C-30 位和C-28 位的氧化。在真菌中，Wang 等[11]將靈芝P450 基因CYP5150L8在釀酒酵母中進行異源過表達研究，結果在釀酒酵母中檢測到靈芝三萜的存在；方星等[30]將CYP51基因在靈芝中過量表達，在靈芝菌絲中發(fā)現(xiàn)三萜含量明顯增加。上述實驗說明P450 家族基因在三萜合成過程中作用重大，但目前在暴馬桑黃中并未見P450 基因的相關報道，本研究通過差異表達分析初步鑒定出可能參與三萜合成的SbLSD基因，但該基因在三萜合成途徑中的功能和調(diào)控機制還不明確。本實驗室已經(jīng)完成暴馬桑黃遺傳轉化體系的初步構建，以期通過轉化試驗對SbLSD基因進行深入研究，探明其具體的功能和調(diào)控作用。

3.2 結 論

以暴馬桑黃轉錄組為基礎，通過反轉錄克隆得到SbLSD基因，該基因cDNA 全長1 662 bp，將其構建到pET-32a 表達載體上，在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達出62.26 kDa 目的蛋白。亞細胞定位顯示，SbLSD 蛋白主要存在于內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體，并且在暴馬桑黃不同發(fā)育階段，SbLSD基因在子實體階段轉錄水平較高，菌絲階段表現(xiàn)不活躍，與MVA 途徑中合成羊毛甾醇基因的變化趨勢相吻合，初步證實該基因參與三萜合成途徑，并推測該基因表達的SbLSD 蛋白主要在內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體對羊毛甾醇進行加工修飾，減少中間產(chǎn)物羊毛甾醇的積累，進而提高下游三萜產(chǎn)物的含量。