人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化microRNA表達(dá)變化及其功能分析

［摘要］ 目的

探討人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCB-MSCs）治療肝纖維化microRNA（miRNA）表達(dá)的變化及其功能。

方法 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取肝星形細(xì)胞（LX-2）與hUCB-MSCs共培養(yǎng)后測(cè)序的miRNA表達(dá)矩陣，篩選出差異表達(dá)miRNA（DEMs）；利用miRWalk在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)DEMs的靶基因，并通過(guò)Cytoscape對(duì)miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化；通過(guò)GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建DEMs靶基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)DEMs的靶向基因進(jìn)行功能和通路富集分析。

結(jié)果 差異表達(dá)分析顯示，與hUCB-MSCs共培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞較單獨(dú)培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞存在13個(gè)低表達(dá)DEMs和28個(gè)高表達(dá)DEMs。通過(guò)構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析顯示，hsa-miR-221-3p及hsa-miR-146a-5p同時(shí)靶向ERBB4，hsa-miR-10a-5p及hsa-miR-155-5p同時(shí)靶向RORA。GO分析發(fā)現(xiàn)，這些DEMs靶向基因主要富集的生物過(guò)程包括GDP折疊、蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性及纖維蛋白原連接等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些DEMs靶向基因主要在癌癥miRNA、癌癥蛋白聚糖類(lèi)、肝癌、Rap1信號(hào)通路、胃癌、甲狀腺癌以及膀胱癌方面富集。

結(jié)論 本研究確定了41種DEMs及ERBB4、RORA兩種多miRNA共同靶向基因，它們可能在hUCB-MSC治療肝纖維化的過(guò)程中發(fā)揮作用。

［關(guān)鍵詞］ 胎血；間質(zhì)干細(xì)胞；肝纖維化；微RNA

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R575

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096-5532（2024）05-0658-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.177

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20241128.1039.002;2024-11-28 16：20：37

Changes in the expression of microRNAs and their functions after the treatment of liver fibrosis using human umbilical cord blood me-

senchymal stem cells

XING Yueyi， JING Xue

（Qingdao University Medical College， Qingdao 266003， China）

［Abstract］Objective To investigate the changes in the expression of microRNAs （miRNAs） and their functions after the treatment of liver fibrosis using human umbilical cord blood mesenchymal stem cells （hUCB-MSCs）.

Methods The GEO database was used to obtain the expression matrix of miRNAs sequenced after co-culture of human hepatic stellate cells LX-2 and hUCB-MSCs， and differentially expressed miRNAs （DEMs） were identified. The miRWalk online database was used to predict the target genes of DEMs， and Cytoscape was used to visualize the miRNA-mRNA network. The GeneMANIA database was used to construct a protein-protein interaction network for the target genes of DEMs， and then functional and pathway enrichment analyses were performed for the target genes of DEMs.

Results The differential analysis showed that compared with the LX-2 cells cultured alone， the LX-2 cells co-cultured with hUCB-MSCs had 13 downregulated DEMs and 28 upregulated DEMs. The miRNA-mRNA network analysis showed that both hsa-miR-221-3p and hsa-miR-146a-5p targeted ERBB4， and both hsa-miR-10a-5p and hsa-miR-155-5p targeted RORA. The GO analysis showed that the target genes of the DEMs were mainly enriched in the biological processes such as GDP folding， protein phosphatase regulator activity， nuclear receptor activity， ligand-activated transcription factor activity， and fibrinogen binding， and the KEGG analysis showed that these genes were mainly enriched in the pathways asso-

ciated with cancer miRNAs， cancer proteoglycans， liver cancer， the Rap1 signaling pathway， gastric cancer， thyroid cancer， and bladder cancer.

Conclusion This study identifies 41 DEMs and 2 target genes， ERBB4 and RORA， of multiple miRNAs， which may play a role in the treatment process of liver fibrosis by hUCB-MSCs.

［Key words］ fetal blood; mesenchymal stem cells; hepatic fibrosis; microRNAs

肝纖維化可演變?yōu)楦斡不?。?dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞（HSC）釋放炎癥介質(zhì)，刺激造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，過(guò)度產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）導(dǎo)致肝功能受損［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在肝病治療中具有潛力［2］，能夠抑制免疫細(xì)胞活性［3］，并具有多向分化及擴(kuò)增能力，為理想的肝病治療候選方法。人臍帶血（hUCB）含有更多MSCs，相比骨髓或外周血，可能是更好的細(xì)胞來(lái)源［4-5］。目前，hUCB在肝纖維化中的治療潛力尚未明晰。microRNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼 RNA，可以調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的活化，影響肝纖維化的進(jìn)展［6-9］。然而，MSCs如何通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)來(lái)緩解HSC活化的機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探究hUCB治療肝纖維化時(shí)miRNA的表達(dá)變化，以了解hUCB-MSCs治療肝纖維化的潛力。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及獲取

miRNA表達(dá)矩陣（GSE151098）從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索獲得。該研究將TGFβ1激活的人肝星形細(xì)胞（LX-2）與hUCB-MSCs共培養(yǎng)48 h，并通過(guò)高通量測(cè)序比較其與單獨(dú)培養(yǎng)LX-2細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA（DEMs）。

1.2 DEMs分析

使用R軟件（v.4.4.0）DESeq2包篩選DEMs，以Plt;0.05和|log2FC|≥0.5作為臨界標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用ggplot2包繪制火山圖。

1.3 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)和miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用miRWalk在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html）預(yù)測(cè)DEMs的靶基因，該在線數(shù)據(jù)庫(kù)包括5個(gè)不同的數(shù)據(jù)庫(kù)（miRanda、miRDB、Targetscan、RNA22和miRWalk）。至少擬合3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)基因被認(rèn)為是DEMs的靶基因。并利用Cytoscape軟件（v 3.9.0）可視化miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將DEMs的靶基因輸入GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//genemania.org/）中，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 功能和通路富集分析

應(yīng)用R軟件（v.4.4.0）中clusterProfiler包進(jìn)行DEMs靶基因的GO及KEGG富集分析。

2 結(jié) "果

2.1 與hUCB-MSCs共培養(yǎng)的LX-2中DEMs

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)集GSE151098中共獲得6個(gè)樣本，其中3個(gè)樣本為與hUCB-MSCs共培養(yǎng)的LX-2，另外3個(gè)為不與hUCB-MSCs共培養(yǎng)的LX-2。差異表達(dá)分析顯示，兩組細(xì)胞中共有41種miRNA表達(dá)存在差異，其中28個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，13個(gè)miRNA低表達(dá)，見(jiàn)圖1。

2.2 DEMs靶基因預(yù)測(cè)和miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)miRWalk在線數(shù)據(jù)庫(kù)，找到2個(gè)高表達(dá)miRNA及6個(gè)低表達(dá)miRNA的靶基因，其表達(dá)序列及靶向mRNA見(jiàn)表1。為了進(jìn)一步鑒定其調(diào)控的重要miRNA/mRNA，應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，hsa-miR-221-3p及hsa-miR-146a-5p同時(shí)靶向基因人表皮生長(zhǎng)因子4（ERBB4），hsa-miR-10a-5p及hsa-miR-155-5p同時(shí)靶向基因視黃酸受體相關(guān)孤兒受體α（RORA）。見(jiàn)圖2。

2.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)高表達(dá)及低表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析，結(jié)果顯示靶基因蛋白質(zhì)之間存在相互作用關(guān)系（圖3）。

2.4 DEMs的靶基因功能和通路富集分析

GO分析顯示，DEMs的靶基因主要富集的生物過(guò)程包括GDP折疊、蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性及纖維蛋白原連接等，其中以GDP折疊、蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)活性、核受體活性這3種生物過(guò)程富集的基因最多（圖4A）。KEGG通路富集分析顯示，DEMs的靶基因主要在癌癥蛋白聚糖類(lèi)、癌癥miRNA、肝癌、Rap1信號(hào)通路、胃癌、甲狀腺癌以及膀胱癌方面富集，其中以癌癥蛋白聚糖類(lèi)及癌癥miRNA相關(guān)通路富集的基因最多（圖4B）。

3 討 "論

肝纖維化是不可逆的，這種被動(dòng)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性肝硬化和肝衰竭。然而，肝纖維化的分子和細(xì)胞機(jī)制仍在探索中。目前，尚無(wú)特定的抗纖維化藥物可用于預(yù)防或治愈肝硬化。因此，制定一種安全、有效和臨床上可行的策略來(lái)預(yù)防肝纖維化和改善肝功能具有重要意義。

KAKINUMA等［10］研究顯示，臍帶血單個(gè)核細(xì)

胞具有橫向分化能力，在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞并表達(dá)肝細(xì)胞表面標(biāo)志如ALB、CK18、Thy-1、c-kit等。LEE等［11］研究顯示，肝纖維化病人正常功能的肝細(xì)胞數(shù)量顯著減少，hUCB單個(gè)核細(xì)胞可隨血循環(huán)植入肝臟增殖分化為肝細(xì)胞，從而改善肝功能。干細(xì)胞以MSCs為主，能夠通過(guò)遷移和轉(zhuǎn)化替代肝細(xì)胞行使功能；通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗凋亡和抗氧化能力，促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制肝巨噬細(xì)胞中炎癥因子的分泌，抑制HSC的活化，促進(jìn)活化細(xì)胞的凋亡，并且能夠降解ECM從而延緩肝纖維化的過(guò)程［12］。MSCs還能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，抑制炎癥反應(yīng)，減少肝臟損傷［13］。目前，hUCB治療肝纖維化已經(jīng)在臨床上得到初步應(yīng)用，并取得了一定的效果。但仍需要更多大規(guī)模臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證其安全性和有效性。

多種miRNA被認(rèn)為可以促纖維化，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)信號(hào)通路來(lái)激活HSC［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-103、miR-105、miR-125、miR-146、miR-150、miR-181、miR-194、miR-195、miR-199、miR-214、miR-221、miR-222、miR-542等miRNA具有明確的促纖維化潛力，并且在慢性損傷肝臟的HSC激活過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［14］。miR-214（miR-214-3p）表達(dá)在HSC激活過(guò)程中顯著上調(diào)，并通過(guò)抑制

LX-2細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路負(fù)調(diào)節(jié)因子Sufu

的表達(dá)而引起ECM積累。在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化

的實(shí)驗(yàn)中，也觀察到miR-214表達(dá)顯著上調(diào)。敲低小鼠體內(nèi)miR-214可增加Sufu的表達(dá)，減少促纖維化標(biāo)記基因的表達(dá)，抑制纖維化［15］。此外，也有多項(xiàng)研究表明，miRNA可以抑制纖維化的進(jìn)程。其中miR-690可以直接抑制HSC中的纖維化過(guò)程，調(diào)節(jié)肝巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并抑制肝細(xì)胞中的de novo脂肪合成［16］。miR-96-5p的表達(dá)上調(diào)可以通過(guò)抑制FN1/ECM受體相互作用途徑減少HSC的活化，從而緩解肝纖維化［17］；MSCs來(lái)源的外泌體miR-27b-3p通過(guò)下調(diào)YAP/LOXL2通路緩解肝纖維化［18］。HSC也具有某些抗纖維化miRNA，其中miR-16、miR-19b、miR-29、miR-30、miR-101、miR-122、miR-133a、miR-144、miR-146a、miR-150-5p、miR-155、miR-195、miR-200a、miR-214、miR-335、miR-370、miR-454、miR-483等負(fù)責(zé)維持正常HSC的靜止表型，活化HSC的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)和表型逆轉(zhuǎn)，抑制HSC增殖，抑制ECM相關(guān)基因表達(dá)［19］。

本研究采用生物信息學(xué)的方法篩選出hUCB-MSCs治療肝纖維化后的DEMs，其中包括13個(gè)低表達(dá)miRNA和28個(gè)高表達(dá)miRNA；通過(guò)構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-221-3p及hsa-miR-146a-5p同時(shí)靶向ERBB4，hsa-miR-10a-5p及hsa-miR-155-5p同時(shí)靶向RORA。ERBB4是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一，也被稱為HER4。研究表明，肝纖維化過(guò)程中ERBB4的表達(dá)可能上調(diào)，尤其是在HSC中。ERBB4受體的激活可能通過(guò)與表皮生長(zhǎng)因子（EGF）或者類(lèi)似的配體結(jié)合，啟動(dòng)下游的信號(hào)通路，如PI3K/Akt通路和MAPK通路，從而促進(jìn)HSC的增殖、遷移和膠原合成［20］。此外，肝纖維化的發(fā)生通常伴隨著慢性炎癥反應(yīng)。ERBB4在炎癥反應(yīng)中也可能發(fā)揮重要作用，它通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的功能或調(diào)控免疫反應(yīng)，間接影響纖維化過(guò)程。有研究顯示，將小鼠肝臟中ERBB4敲除后，炎癥反應(yīng)和纖維化反應(yīng)減輕［21］。RORA是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族的一員，參與調(diào)節(jié)多個(gè)生理過(guò)程，包括免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖、分化、代謝等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，RORA在肝臟疾病，尤其是肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展中扮演著重要的角色。研究顯示，日本血吸蟲(chóng)卵外泌體的miRNA-30可能通過(guò)在宿主HSC中靶向RORA4來(lái)增強(qiáng)RORA4的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，從而促進(jìn)日本血吸蟲(chóng)感染后的肝纖維化［22］。本研究GO分析顯示， DEMs靶向基因主要富集的生物過(guò)程包括GDP折疊、蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性及纖維蛋白原連接等；KEGG分析顯示，這些基因主要在癌癥miRNA、癌癥蛋白聚糖類(lèi)、肝癌、Rap1信號(hào)通路、胃癌、甲狀腺癌以及膀胱癌方面富集。但本研究仍存在一定的局限性：目前關(guān)于hUBC-MSCs治療肝纖維化DEMs表達(dá)的研究較少，因此本研究?jī)H采用單一數(shù)據(jù)庫(kù)，且樣本量較少。后續(xù)工作中將進(jìn)一步在細(xì)胞水平及動(dòng)物模型中驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá)情況和功能作用；通過(guò)開(kāi)展大規(guī)模臨床試驗(yàn)，探討本文研究結(jié)果的臨床意義，以提高研究的臨床適用性和證據(jù)水平。

綜上所述，本研究確定了41種DEMs及兩種多miRNA共同靶向基因（ERBB4、RORA），這些基因及miRNA可能在hUCB-MSCs治療肝纖維化的過(guò)程中發(fā)揮作用。

［參考文獻(xiàn)］

［1］DEWIDAR B， MEYER C， DOOLEY S， et al. TGF-β in hepatic stellate cell activation and liver fibrogenesis-updated 2019［J］. Cells， 2019，8（11）：1419.

［2］SHI X Y， ZHANG K， QI Q， et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells attenuate hepatic stellate cells activation and liver fibrosis［J］. Molecular Biology Reports， 2024，51（1）：734.

［3］BAI L P， LI D T， LI J， et al. Bioactive molecules derived from umbilical cord mesenchymal stem cells［J］. Acta Histochemica， 2016，118（8）：761-769.

［4］NONOME K， LI X K， TAKAHARA T， et al. Human umbilical cord blood-derived cells differentiate into hepatocyte-like cells in the Fas-mediated liver injury model［J］. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology， 2005， 289（6）：G1091-G1099.

［5］YOSHIDA Y， SHIMOMURA T， SAKABE T， et al. A role of Wnt/beta-catenin signals in hepatic fate specification of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells［J］. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology， 2007， 293（5）：G1089-G1098.

［6］YOU K， LI S Y， GONG J， et al. MicroRNA-125b promotes hepatic stellate cell activation and liver fibrosis by activating RhoA signaling［J］. Molecular Therapy Nucleic Acids， 2018，12：57-66.

［7］YANG L， DONG C B， YANG J J， et al. MicroRNA-26b-5p inhibits mouse liver fibrogenesis and angiogenesis by targeting PDGF receptor-beta［J］. Molecular Therapy Nucleic Acids， 2019，16：206-217.

［8］WEI S， WANG Q， ZHOU H M， et al. MiR-455-3p alleviates hepatic stellate cell activation and liver fibrosis by suppressing HSF1 expression［J］. Molecular Therapy Nucleic Acids， 2019，16：758-769.

［9］SONG J H， LV H N， LIU B B， et al. Let-7 suppresses liver fibrosis by inhibiting hepatocyte apoptosis and TGF-β production［J］. Molecular Metabolism， 2023，78：101828.

［10］KAKINUMA S， TANAKA Y， CHINZEI R， et al. Human umbilical cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells［J］. Stem Cells， 2003，21（2）：217-227.

［11］LEE K D， KUO T K C， WHANG-PENG J， et al. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells［J］. Hepatology， 2004，40（6）：1275-1284.

［12］LIU P Y， MAO Y C， XIE Y， et al. Stem cells for treatment of liver fibrosis/cirrhosis： clinical progress and therapeutic potential［J］. Stem Cell Research amp; Therapy， 2022，13（1）：356.

［13］CAO Y， JI C B， LU L. Mesenchymal stem cell therapy for li-

ver fibrosis/cirrhosis［J］. Annals of Translational Medicine， 2020，8（8）：562.

［14］EZHILARASAN D. Role of microRNAs in hepatic fibrosis progression［J］. Journal of Applied Pharmaceutical Science， 2018，5（8）. DOI：10.7324/JAPS.2018.8524.

［15］MA L P， YANG X X， WEI R， et al. MicroRNA-214 promotes hepatic stellate cell activation and liver fibrosis by suppressing Sufu expression［J］. Cell Death amp; Disease， 2018，9（7）：718.

［16］GAO H， JIN Z M， BANDYOPADHYAY G， et al. MiR-690 treatment causes decreased fibrosis and steatosis and restores specific Kupffer cell functions in NASH［J］. Cell Metabolism， 2022，34（7）：978-990.e4.

［17］ZHANG Y， GU T F， XU S R， et al. Anti-liver fibrosis role of miRNA-96-5p via targeting FN1 and inhibiting ECM-receptor interaction pathway［J］. Applied Biochemistry and Biotechno-

logy， 2023，195（11）：6840-6855.

［18］CHENG F， YANG F J， WANG Y J， et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomal miR-27b-3p alleviates liver fibrosis via downregulating YAP/LOXL2 pathway［J］. Journal of Nanobiotechnology， 2023，21（1）：195.

［19］EZHILARASAN D. MicroRNA interplay between hepatic stellate cell quiescence and activation［J］. European Journal of Pharmacology， 2020，885：173507.

［20］ZHANG D， ZHANG J， JIANG X Y， et al. Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor： a hepatic stellate cell proliferation inducer via ErbB receptors［J］. Journal of Gastroenterology and Hepatology， 2014，29（3）：623-632.

［21］何曉順. ErbB4在肝炎和肝癌中的作用及其初步機(jī)制［D］. 蘇州：蘇州大學(xué)， 2015.

［22］CHEN Y， HU Y， ZHOU H， et al. Induction of hepatic fibrosis in mice with schistosomiasis by extracellular microRNA-30 derived from Schistosoma japonicum eggs［J］. Frontiers in Immunology， 2024，15：1425384.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

［收稿日期］2024-09-04; ［修訂日期］2024-10-12

［基金項(xiàng)目］2021年山東省醫(yī)學(xué)會(huì)臍帶血臨床科研專項(xiàng)資金項(xiàng)目（YXH2021ZX064）

［第一作者］邢月怡（1995-），女，博士研究生。

［通信作者］荊雪（1981-），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：jingxue@qdu.edu.cn。