膽汁酸對水產(chǎn)養(yǎng)殖的影響及其檢測技術(shù)研究進展

席靜 韓雨軒 謝婧荷 王敏 曹晨 郭德華*

（1.廣州海關(guān)技術(shù)中心 廣東廣州 510623；2.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心）

0 引言

膽汁酸（bile acid）是人和動物肝臟中的膽固醇代謝中產(chǎn)生的多種醇類物質(zhì)的統(tǒng)稱，具有弱酸性[1]，屬于兩性分子，既有親水性，也有疏水性，在生理條件下以鹽形式存在，具有較強的表面活性，能降低甘油三酯水平[2-3]。 目前，膽汁酸作為生長添加劑已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物中，以提高脂肪吸收率，促進生長，提高養(yǎng)殖類水產(chǎn)品品質(zhì)。 色譜質(zhì)譜技術(shù)可以同時進行定性和定量分析，因其具有較好的靈敏度和特異性，已成為檢測膽汁酸的主流方法。 本文綜述了膽汁酸對水產(chǎn)養(yǎng)殖的影響及其檢測技術(shù)研究進展，旨在為膽汁酸在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供科學依據(jù)，并為監(jiān)管部門及檢測機構(gòu)制訂水產(chǎn)品中膽汁酸殘留檢測技術(shù)標準提供參考。

1 膽汁酸的化學結(jié)構(gòu)及生理功能

1.1 膽汁酸的化學結(jié)構(gòu)

膽汁酸主要存在于哺乳動物和其他脊椎動物的膽汁中，是一類具有藥理活性的天然產(chǎn)物。 膽汁酸按照代謝途徑分為初級膽汁酸和次級膽汁酸。 初級膽汁酸在肝臟部位合成，涉及一系列膽固醇的甾醇環(huán)和側(cè)鏈中的酶性修飾，產(chǎn)物為膽酸（cholic acid，CA）和鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）。初級膽汁酸合成后進入腸肝循環(huán)， 在腸道細菌的作用下去羥基化，產(chǎn)生次級膽汁酸，包括石膽酸（litho cholic Acid，LCA）、脫氧膽酸（deoxycholic Acid，DCA）及熊脫氧膽酸（ursodeoxycholic Acid，UDCA），其結(jié)構(gòu)如圖1 所示。此外，膽汁酸按照結(jié)構(gòu)還分為游離型膽汁酸和結(jié)合型膽汁酸， 初級和次級膽汁酸屬于游離型膽汁酸，游離型膽汁酸可與?；撬峄蚋拾彼岬冉Y(jié)合，形成結(jié)合型膽汁酸，包括甘氨膽酸、?；悄懰岬萚4-5]。

圖1 膽汁酸化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of bile acids

在成人體內(nèi)，每天大約有500mg 的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸。 目前，生物學界從動物體內(nèi)提取到的膽汁酸多達14 種， 不同物種間膽汁中含有不同種類的膽汁酸， 初級膽汁酸中的CA、CDCA， 次級膽汁酸中的LCA、DCA 及UDCA 在人、鼠、豬、魚等多種物種中共同存在[6-8]。

1.2 膽汁酸的生理功能

膽汁酸的肝腸循環(huán)促進了脂類及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的乳化和吸收， 肝臟內(nèi)膽汁酸的合成和小腸內(nèi)膽汁酸的重吸收協(xié)同作用， 共同維持機體膽汁酸及膽固醇的代謝平衡。研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸具有促進脂肪消化吸收[9-10]、保肝利膽[11-12]、提高生長性能[13-14]、抗炎抗癌抗病毒[15-18]和免疫調(diào)節(jié)[19]等多種生物功能。 SERFATY L 等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸能夠抑制膽汁淤積性肝疾病和大腸癌的發(fā)展。 ELKIHEL L 等[22-23]研究熊去氧膽酸、 鵝去氧膽酸和石膽酸的衍生物的抗癌效果， 發(fā)現(xiàn)這3 種膽汁酸能夠選擇性抑制多種腫瘤細胞的增殖和誘導細胞凋亡。 脫氧膽酸可抑制大鼠胰腺腺泡細胞AR42J 增殖并誘導AR42J 細胞凋亡[24]。

同時，有學者認為，膽汁酸本身也是一種“有效毒素”，一旦它在機體內(nèi)含量過高，會直接影響膽汁酸池的大小， 對細菌細胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞，引發(fā)各類肝腸膽相關(guān)疾病[25]。許多研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸對癌細胞具有雙重性，既有促癌作用，也有抗癌作用。 BAYERDORFFER E 等[26]研究發(fā)現(xiàn)患有結(jié)直腸腺瘤的男性患者血清脫氧膽酸水平顯著提高。 BERNSTEIN C[27]在18 只野生小鼠的飲食中添加0.2%的脫氫膽酸，10 個月后17 只小鼠出現(xiàn)了結(jié)腸腫瘤，其中10 只為結(jié)腸癌。

2 膽汁酸對水產(chǎn)養(yǎng)殖的影響

2.1 膽汁酸在淡水魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖密度增加，養(yǎng)殖病害時有爆發(fā)。國內(nèi)重要淡水經(jīng)濟魚類如草魚、鯉魚、鯽魚、團頭魴、羅非魚等，在養(yǎng)殖過程中受到各種病害的威脅，其中肝膽綜合癥是目前危害較為嚴重的一種疾病， 表現(xiàn)為患病魚肝臟顏色發(fā)白或發(fā)黃，膽囊腫大。該病發(fā)病機理尚不清楚， 有學者認為發(fā)病原因是高能高蛋白飼料的使用導致魚類肝臟負擔加重[28]。 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)， 魚類肝膽疾病的發(fā)生常伴隨著膽汁酸的代謝異常， 在飼料中添加適量的膽汁酸可解決魚類肝膽疾病的困擾[29]，并提升飼料的利用率[30]。

大量科學研究顯示， 在飼料中添加適量的膽汁酸在提高水產(chǎn)動物對飼料脂質(zhì)的利用率、抗脂肪肝、促進水產(chǎn)動物的生長、增強免疫力、改善養(yǎng)殖魚類品質(zhì)等方面有顯著效果。 張國安等[30]研究發(fā)現(xiàn)，紅魚粉型飼料中添加150 mg/kg 膽汁酸能夠顯著提高大菱鲆的特定生長率和肥滿度， 添加300 mg/kg 膽汁酸能顯著降低血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性， 起到保護大菱鲆肝臟功能的作用。 PENG 等[31]研究顯示，膽汁酸添加劑能夠顯著改善草魚的增重率、 特定生長率、 攝食率，并能提高飼料效率。 張晶等[32]研究發(fā)現(xiàn)，草魚的肥滿度與膽囊中的膽汁酸含量呈負相關(guān)關(guān)系， 說明膽汁酸可以減少脂肪在草魚肝臟的積累。 向梟等[33]在高脂飼料中添加膽汁酸投食喂養(yǎng)齊口裂腹魚幼魚70 天后， 發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚幼魚的增重率、 特定生長率、蛋白質(zhì)效率、肝胰臟中蛋白酶的活性，均隨著膽汁酸添加水平的升高而呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，且均在膽汁酸添加量為150 mg/kg 時最大；齊口裂腹魚幼魚肌肉中粗蛋白質(zhì)的含量呈先上升后趨于穩(wěn)定的變化趨勢， 在膽汁酸添加量為300 mg/kg時最大。JIANG 等[34]研究表明，飼料中添加0.15 g/kg 膽汁酸可以提升羅非魚的增重率和特定生長率等。胡田恩等[35]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中適量添加膽汁酸（100 mg/kg或200 mg/kg）能夠顯著提升牛蛙肝臟活力，保護肝臟功能；降低牛蛙的體脂含量。 日本學者研究發(fā)現(xiàn)[36]，在鰻魚飼料中添加膽汁酸6.5 mg/kg，喂養(yǎng)32 天后，喂養(yǎng)膽汁酸飼料的鰻魚體重較不用膽汁酸的鰻魚增加了16.7%，飼料系數(shù)下降了19.7%，將含有6 mg/kg的膽汁酸飼料喂養(yǎng)鯉魚苗，喂養(yǎng)62 天后，實驗組鯉魚體重較對照組鯉魚體重增加了10.9%， 飼料系數(shù)下降了17.7%。此外，有日本學者在真鯛的飼料中加入膽汁酸，經(jīng)過一個生長周期后，真鯛的外觀顏色更加鮮亮[36]。

由此可見， 膽汁酸可顯著提高對水產(chǎn)動物消化道中脂肪酶活性影響， 適宜的膽汁酸產(chǎn)品能有效地增強水產(chǎn)品抗氧化能力， 在改善水產(chǎn)品品質(zhì)方面有顯著的效果，從而說明膽汁酸是一種良好的水產(chǎn)飼料添加劑。2016 年2 月，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布第2358 號公告，決定將膽汁酸的適用范圍擴大至肉食性淡水魚類，以提高脂肪吸收效率，解決水生動物的代謝問題[37]。

2.2 膽汁酸在河蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用

蝦、蟹等甲殼動物是無膽囊的無脊椎動物，自身無法合成膽固醇和膽汁酸， 但是在其生長的各階段需要攝取一定量的膽固醇和膽汁酸， 用來在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為蛻皮激素，以保證生長過程中的正常蛻皮。從扣蟹到成蟹， 河蟹需要經(jīng)過5 次蛻殼才能達到上市標準，每蛻一次殼，河蟹會翻倍增長，因此河蟹正常蛻殼是成長的關(guān)鍵階段。 但近年來河蟹水癟子病時有爆發(fā)，該病主要癥狀為肝胰腺萎縮，呈灰黃色、灰白色或白色，腹腔積水，腸道受損，附肢空癟，一旦發(fā)病難以治愈，甚至導致河蟹大面積死亡。膽汁酸作為一種固醇類物質(zhì)， 是蝦蟹正常生長中不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，必須從餌料中獲得這些物質(zhì)。

陳晴等[38]研究顯示，添加0.5%、1.0%膽汁酸和?；撬峋娠@著提升中華絨鰲蟹幼蟹肝臟和腸道中的蛋白酶和脂肪酶活性， 同時提高幼蟹體內(nèi)的抗氧化酶活性。劉太亮等[39]在河蟹的養(yǎng)殖期間，實驗組投放添加1 000 mg/kg 膽汁酸的飼料， 投放時間5 個月， 對照組未投放添加膽汁酸的飼料， 試驗結(jié)果顯示，養(yǎng)殖期間對照組出現(xiàn)了水癟子病，而試驗組的河蟹全程未出現(xiàn)肝胰腺方面的疾病， 養(yǎng)殖過程中攝食旺盛，生長速度快，蛻殼及時順利，上市重量較對照組明顯增大，成蟹蟹黃蟹膏飽滿，說明在蟹養(yǎng)殖中添加含有膽汁酸的飼料對于提高蟹存活率及成品品質(zhì)具有一定的優(yōu)勢。

2.3 水產(chǎn)養(yǎng)殖中膽汁酸添加量及存在問題

由于不同動物自身所產(chǎn)生的膽汁酸種類及組成比例存在著一定的差異，其生理作用亦存在差別，因此導致不同來源及含量的膽汁酸在用作水產(chǎn)動物飼料添加劑時，其功效也有所差別。目前的膽汁酸添加劑一般是用豬膽提純， 其膽汁酸的種類及組成可能有別于不同的魚類，豬膽提純的膽汁酸，在提純過程需除去膽囊中變性的脂肪和蛋白等有害成分，如果生產(chǎn)提純工藝不達標， 會對水產(chǎn)動物帶來潛在危害[30]。此外， 外源膽汁酸的添加是否會抑制機體內(nèi)源膽汁酸的分泌， 外源膽汁酸的最佳添加水平和最佳配方均有待進一步研究確定[3]。

研究發(fā)現(xiàn)， 水產(chǎn)高脂飼料中復合膽汁酸的適宜添加水平為150 mg/kg～200 mg/kg[33-35]。 過量的膽汁酸會損傷水產(chǎn)動物的肝臟功能，使干細胞空泡化，抑制水產(chǎn)動物的生長，影響機體代謝。胡田恩等[35]研究發(fā)現(xiàn)，過量添加膽汁酸（300 mg/kg）會導致牛蛙肝損傷。JIANG 等[34]研究表明，飼料中添加1.35 g/kg 的膽汁酸對羅非魚的生長有抑制作用。 過量的膽汁酸會在水產(chǎn)品體內(nèi)蓄積、殘留，而人類食用含有膽汁酸，如脫氫膽酸的水產(chǎn)品，可有噯氣、打嗝、腹瀉、惡心、肌痙攣、直腸區(qū)周圍皮膚刺激等不良反應(yīng)，如果是長期食用或一時攝入量過多，可導致電解質(zhì)失衡，甚至可出現(xiàn)呼吸困難、心跳驟停、心律紊亂、肌痙攣、極度疲乏無力等嚴重反應(yīng)[20，26]。韓國食品藥品安全部（MFDS）對水產(chǎn)品中的脫氫膽酸制定了殘留限量標準， 規(guī)定水產(chǎn)品中的脫氫膽酸不得超過0.01 mg/kg， 并對來自中國的水產(chǎn)品進行了脫氫膽酸殘留的檢測，2018年1 月—2019 年8 月，我國共有2 個批次的水產(chǎn)品被檢出脫氫膽酸殘留不合格[40]，給相關(guān)企業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟損失。 2021 年，韓國食品藥品安全部發(fā)布2021 上半年進口水產(chǎn)品重點管理對象，其中涉及到中國水產(chǎn)品鱗鲀， 按相關(guān)規(guī)定鱗鲀中不得檢出脫氫膽酸[41]。

3 膽汁酸檢測技術(shù)研究進展

膽汁酸的代謝與肝膽疾病密切相關(guān)， 檢測生物體內(nèi)膽汁酸含量對于肝膽疾病的診斷、 鑒別診斷及發(fā)病機理研究具有重要意義。 但由于膽汁酸的化學多樣性和較大的生物濃度范圍變化， 以及生物樣本如血漿、膽汁的復雜性，研制開發(fā)靈敏準確的分析方法仍在進行之中。

目前， 生物體內(nèi)膽汁酸檢測技術(shù)包括薄層色譜法、分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[40-50]等。葉蓓蓓等[42]采用薄層色譜單波長掃描法測定人工牛黃中的主要膽汁酸類成分中膽酸及豬去氧膽酸的含量， 該方法以環(huán)己烷-乙醚-冰醋酸（2∶1∶1）為展開劑，平均回收率分別為101.3%（RSD=2.6%）和101.6%（RSD=2.5%）。但其樣品前處理步驟較為復雜， 且薄層色譜實驗條件要求較高，受薄層板、展開劑、展開條件、顯色等因素影響較大，較難分離膽汁酸的同分異構(gòu)體[43]。

氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）是一種較為靈敏的檢測方法，可根據(jù)其特有的MS 碎片模式定性膽汁酸，分析膽汁酸結(jié)構(gòu)中不確定的羥基等基團的分布，但所需膽汁酸樣品的量較大且需要通過多個前處理（固相，凝膠和離子交換）方法及衍生化步驟以去除生物基質(zhì)的干擾[45]。 高效液相或超高相液相色譜（HPLC）與MS（或MS /MS）結(jié)合的檢測技術(shù)，能夠改善異構(gòu)體與相同離子片段的分離， 可用于人和嚙齒動物膽汁[16-18]、脂肪組織[18]、肝臟[16-17]中準確的膽汁酸定量檢測，

需要注意的是， 當采用液相色譜技術(shù)檢測膽汁酸時， 由于膽汁酸是一類紫外吸收較弱的固醇類化合物，使用紫外檢測器（UV）檢測靈敏度較低，目前大多采用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）和電霧式檢測器（CAD），而CAD 靈敏度高于ELSD[45]。 與GC-MS相比，LC-MS 具有快速樣品制備方法， 無需衍生化的優(yōu)點[3]在樣品處理方面因水產(chǎn)動物膽汁樣品成分較為復雜，甲醇溶解后不但含有膽汁酸，并含有大量水溶性物質(zhì)及非極性成分， 采用固相萃取可去除水溶性物質(zhì)及非極性成分， 保留并富集中等極性的膽汁酸化合物。

據(jù)此，斯日古楞等[44]建立了固相萃取C18小柱凈化， 液相色譜—二極管陣列檢測器檢測不同哺乳動物膽汁中13 種膽汁酸的技術(shù)，將C18小柱預先用1 mL甲醇和1 mL 0.05%甲酸溶液活化，再用2 mL 0.05%甲酸，1 mL 甲醇+水溶液（45+55）依次淋洗小柱，最后用3 mL 甲醇洗脫膽汁酸，13 種膽汁酸檢出限在0.2～0.6 ng/μL 之間， 該方法可使游離膽汁酸和結(jié)合膽汁酸達到良好的基線分離。 王一博等[45]建立了高效液相色譜—電霧式檢測器同時測定豬、熊、牛、羊膽粉中5 種膽汁酸的檢測方法， 選擇對極性化合物具有較強保留的T3 色譜柱， 使用冰醋酸-乙腈-水梯度洗脫方式實現(xiàn)了5 種膽汁酸的完全分離， 定量限為30 ng/μL。 張晶等[32]采用乙醇萃取草魚腸道和肝臟樣品， 萃取液吹干后復溶于甲醇并用固相萃取C18小柱凈化；血清中的膽汁酸用冰乙腈沉淀法萃取固相萃取C18小柱凈化， 通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測草魚不同組織中膽汁酸含量。 這些方法均說明固相萃取作為樣品預處理技術(shù)， 與傳統(tǒng)的液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率， 更有效地將分析物與干擾組分分離，減少樣品預處理過程，操作簡單、省時、省力。

此外， 針對采用膽汁酸飼料喂養(yǎng)的水產(chǎn)動物肌肉組織中膽汁酸殘留量檢測研究較少的情況， 曹晨等[51]使用液液萃取聯(lián)合固相萃取凈化技術(shù)，以WATERS C18色譜柱為固定相，不同體積比的水和甲醇的混合液為流動相進行梯度洗脫， 采用串聯(lián)質(zhì)譜儀在電噴霧離子（ESI）源，負離子掃描方式；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下，內(nèi)標法定量，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中膽汁酸殘留量的檢測方法，該方法對于3 種膽汁酸（膽酸、脫氧膽酸、脫氫膽酸） 的定量限均達到0.01 mg/kg， 回收率為84.4%～115.3%，相對標準偏差為2.6%～13.3%，符合韓國食藥監(jiān)局對進口水產(chǎn)品中脫氫膽酸殘留的限量要求，可為水產(chǎn)動物肌肉中膽汁酸的快速篩選和確證提供技術(shù)手段。

4 結(jié)語

膽汁酸作為一種新型的飼料添加劑， 能有效改善水產(chǎn)動物對脂肪的利用，提高飼料轉(zhuǎn)化率，維護水產(chǎn)動物肝臟健康，具有良好的市場應(yīng)用前景。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展和進步， 具有較好的靈敏度和特異性的液相色譜質(zhì)譜技術(shù)已成為檢測膽汁酸的主流方法。 然而，針對復雜的膽汁酸類型及生物基質(zhì)仍存在一些問題，如外源性膽汁酸的添加是否會抑制內(nèi)源性膽汁酸的分泌，外源性膽汁酸的最適合添加量以及所帶來的安全問題，以及如何針對膽汁酸的多種類型在水產(chǎn)動物組織中進行膽汁酸殘留檢測技術(shù)的優(yōu)化等。

目前， 我國尚未出臺食用水生動物或者食品中膽汁酸類物質(zhì)殘留的檢測標準， 建議監(jiān)管部門和檢測機構(gòu)加快食用水生動物或食品中膽汁酸類物質(zhì)殘留的檢測技術(shù)標準制定工作， 指導企業(yè)科學合理地使用膽汁酸添加劑，嚴控過度使用，以促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，保障食用安全。