基于SSR標(biāo)記的廣西壯族自治區(qū)柑橘主栽品種遺傳多樣性分析

摘 要：為探明廣西壯族自治區(qū)柑橘主栽品種的遺傳多樣性，利用21對(duì)簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標(biāo)記引物對(duì)7個(gè)柑橘品種的基因組脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）進(jìn)行分析，研究各種間的遺傳親緣關(guān)系及遺傳距離。試驗(yàn)結(jié)果表明：利用21對(duì)SSR引物對(duì)7個(gè)柑橘品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得172條譜帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8.19條譜帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)量為136，多態(tài)性比率為79.07%；7個(gè)柑橘品種間的遺傳相似系數(shù)為0.000～0.786，平均值為0.529；根據(jù)聚類分析結(jié)果，7個(gè)柑橘品種在遺傳相似系數(shù)為0.513處可以分成四大類群。這說明7個(gè)柑橘品種具有豐富的遺傳多樣性，SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以較好地揭示柑橘品種之間的遺傳差異和親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：柑橘；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1674-7909（2023）12-93-4

0 引言

柑橘是我國廣泛種植的一種常見水果，近年來柑橘產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，人們對(duì)其的需求量與日俱增。廣西壯族自治區(qū)（以下簡稱廣西）自然條件優(yōu)越，十分適宜柑橘生長，是我國柑橘的主要產(chǎn)區(qū)之一。通過多年的引種育種，廣西柑橘品種繁多，遺傳多樣性豐富，但這導(dǎo)致品種區(qū)分難，進(jìn)化起源問題極其復(fù)雜。在此背景下，研究柑橘品種的遺傳多樣性對(duì)柑橘品種區(qū)分及種質(zhì)資源的搜集保存、鑒定評(píng)價(jià)具有重要意義。

脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定研究，常用的DNA分子標(biāo)記有簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標(biāo)記、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）標(biāo)記、單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標(biāo)記等。其中，SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有穩(wěn)定性高、操作簡單、方便快捷等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域［1-3］。例如，劉通等［4］利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)廣西野生柑橘品種、地方品種及對(duì)照品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，利用22對(duì)SSR引物對(duì)34份不同的材料進(jìn)行了分析，產(chǎn)生了221條多態(tài)性條帶。吳娟莉等［5］利用23對(duì)SSR引物對(duì)38份金柑及其近緣屬種質(zhì)進(jìn)行分析，擴(kuò)增得到265條有效性條帶、250條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為92.99%。馬麗麗等［6］利用11對(duì)SSR多態(tài)性引物對(duì)17份早花檸檬材料進(jìn)行分析，共檢測出92個(gè)等位變異，平均每對(duì)引物檢測出8.5個(gè)等位變異，同時(shí)在遺傳相關(guān)系數(shù)為0.65處將17份材料分為4個(gè)類群。相關(guān)研究表明，SSR分子標(biāo)記技術(shù)是研究植物遺傳多樣性的有效方法之一［7-11］?；诖耍P者利用21對(duì)具有較好多態(tài)性的SSR引物對(duì)廣西7個(gè)柑橘主栽品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，探討各品種間的遺傳親緣關(guān)系及遺傳距離，以期為柑橘的遺傳育種研究提供更多理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 供試品種

試驗(yàn)共采用7個(gè)柑橘栽培品種，分別為貢柑、沃柑、金橘、砂糖橘、夏橙、沙田柚、茂谷柑。

1.2 SSR引物

試驗(yàn)共選用21對(duì)SSR引物，引物序列由《柑橘屬品種鑒定 SSR分子標(biāo)記法》（NY/T 3436—2019）提供，由金斯瑞生物科技股份有限公司合成（見表1）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取。筆者于2022年10月從廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的柑橘種植基地進(jìn)行取樣，分別從7個(gè)柑橘品種植株上各取3片葉，分別提取各品種葉片DNA：將葉片去除中脈后用剪刀剪取中間部分，剪碎后混勻放入研缽中，加入適量液氮直至研磨成粉末狀，取100 mg置于1.5 mL離心管中，加入1%改良十六烷基三甲基溴化銨（Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide，CTAB）緩沖液750 μL，渦旋振蕩混勻后于65 ℃水浴45～60 min，加入三氯甲烷500 μL，顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液約0.5 mL至新離心管中，加入等體積（0.5 mL）預(yù)冷至4 ℃的無水乙醇，顛倒混勻，-18 ℃冰箱下靜置1 h，12 000 r/min離心3 min，去上清液，于室溫下干燥沉淀，最后加入Tris-EDTA（TE）緩沖液50 μL，于18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）。PCR反應(yīng)體系見表2。

PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃（具體退火溫度由不同的引物決定）退火40 s，72 ℃延伸45 s（根據(jù)擴(kuò)增片段的長度做出適當(dāng)調(diào)整），共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.3 電泳檢測。用8%聚丙烯酰胺混合液制作凝膠，將凝膠固定于電泳槽中，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，最后用掃描儀掃描膠片，保存結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析中，每對(duì)SSR引物檢測1個(gè)位點(diǎn)，視每條多態(tài)性帶為1個(gè)等位基因；將觀測到的每條帶視為1個(gè)性狀，有此帶時(shí)賦值為“1”，無此帶時(shí)賦值為“0”，所有數(shù)據(jù)處理使用NTSYSpc2.02軟件完成。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 7個(gè)柑橘栽培品種基因組DNA的遺傳多樣性

由表3可知，21對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出172條譜帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)量為136，多態(tài)性比率為79.07%，擴(kuò)增出的條帶相對(duì)分子量均小于500 bp，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出8.19條譜帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)量為6.48。這表明7個(gè)柑橘栽培品種間具有豐富的遺傳多樣性，SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以有效揭示供試柑橘品種間的遺傳差異和親緣關(guān)系。

2.2 7個(gè)柑橘栽培品種基因組DNA的遺傳相似性

由表4可知，7個(gè)柑橘栽培品種間的遺傳相似系數(shù)為0.000～0.786，平均值為0.529。其中，金橘與夏橙的遺傳相似系數(shù)最大（0.786），表明金橘與夏橙的遺傳距離相對(duì)較近；貢柑與砂糖橘、貢柑與茂谷柑的遺傳相似系數(shù)最?。ň鶠?），表明貢柑與砂糖橘、貢柑與茂谷柑的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.3 7個(gè)柑橘栽培品種聚類分析

由圖1可知，在遺傳相似系數(shù)為0.513處，可以把7個(gè)柑橘栽培品種分成四大類群。第一類群僅有貢柑，第二類群包括沃柑、沙田柚、金橘、夏橙，第三類群僅有砂糖橘，第四類群僅有茂谷柑。在遺傳相似系數(shù)為0.571時(shí)，第二類群又能分成2個(gè)亞群，第一亞群包括沃柑、沙田柚，第二亞群包括金橘、夏橙。第二類群的各柑橘品種間遺傳相似系數(shù)相對(duì)較大，表明沃柑、沙田柚、金橘、夏橙的遺傳距離較近；其中金橘與夏橙的遺傳相似系數(shù)最大，表明金橘與夏橙的遺傳背景最相似，兩者的親緣關(guān)系最近。

3 結(jié)論與討論

近年來，柑橘作為區(qū)域特色經(jīng)濟(jì)林木在廣西廣泛推廣種植，已成為廣西鄉(xiāng)村振興、農(nóng)民增收致富的重要產(chǎn)業(yè)。目前，廣西栽培的柑橘品種以砂糖橘為主，其他品種有沃柑、臍橙、茂谷柑、貢柑、金橘等。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)廣西柑橘主栽品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，可為柑橘的遺傳育種提供參考。

此次試驗(yàn)結(jié)果表明，21對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出172條譜帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)量為136，多態(tài)性條帶比例為79.07%，表明7個(gè)柑橘品種間具有豐富的遺傳多樣性；7個(gè)柑橘品種間的遺傳相似系數(shù)為0.000～0.786，平均值為0.529。其中，金橘與夏橙的遺傳相似系數(shù)最大（0.786），表明金橘與夏橙的遺傳背景最為相似，親緣關(guān)系最近；貢柑與砂糖橘、貢柑與茂谷柑的遺傳相似系數(shù)相對(duì)較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

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