HPLC法測定前列地爾注射液中溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺的含量

摘 " " "要：研究了HPLC-ELSD法測定前列地爾注射液中溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺的含量。采用低溫型蒸發(fā)光散射檢測器（霧化氣為氮氣，霧化氣壓力為 25 psi，漂移管溫度為40 ℃），Ultimate Diol色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85∶15∶0.5∶0.05）為流動相A，以正己烷-異丙醇-流動相A（20∶48∶32）為流動相B，柱溫為40 ℃，梯度洗脫。結(jié)果表明：溶血磷脂酰膽堿在0.02～0.20 mg·mL-1（R=0.999 9，n=6），溶血磷脂酰乙醇胺在0.01～0. 1 mg·mL-1 （r=0.999 8，n=6）成良好線性關(guān)系；定量限分別0.02 mg·mL-1和0.01 mg·mL-1，檢測限分別為0.006 mg·mL-1和 " " 0.003 mg·mL-1；平均回收率（n=9）分別為101.4%（RSD=2.4%）和98.8%（RSD=1.9%）。所建立的HPLC方法可用于前列地爾注射液中溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺含量的測定。

關(guān) "鍵 "詞：HPLC；前列地爾注射液；溶血磷脂酰膽堿；溶血磷脂酰乙醇胺；含量

中圖分類號：O657 " " 文獻標識碼： A " " 文章編號： 1004-0935（2023）03-0457-04

前列地爾，又叫前列腺素E1，化學(xué)名 （1R， 2R， 3R）-3-羥基-2（E）-（3S）-3-羥基-1-辛烯基-5-氧代環(huán)戊烷庚酸，是一種前列腺素。前列腺素的生理活性非常廣泛，可以擴張血管、起到緩解或解除心血管平滑肌痙攣的作用，另外還可以增加機體供氧供血[1-2]。同時對于治療慢性動脈閉塞、臟器移植術(shù)后的抗栓有一定療效，也可抑制血栓形成。由于其物理性質(zhì)極微溶于水，需要與大豆油、蛋黃卵磷脂等制成乳狀注射液。其中，蛋黃卵磷脂的作用為乳化、分散和助滲，是注射液常用的乳化劑 [3-6]。乳劑注射液性質(zhì)不穩(wěn)定，在生產(chǎn)、運輸以及儲存過程當中，蛋黃卵磷脂可能會有一部分發(fā)生水解，水解后會產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，即溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidyl choline，LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidyl ethanolamine，LPE）[7]。溶血磷脂有較強的表面活性，可與溶血磷脂酶D反應(yīng)，產(chǎn)物為溶血磷脂酸，該物質(zhì)可破壞紅細胞膜，使細胞膜溶解后血紅蛋白溢出，即為溶血[8-9]。

由此可見，LPC和LPE的含量對于前列地爾注射液的穩(wěn)定性和安全性尤為重要，而高效液相色譜法靈敏度和專屬性都較高[10]。因此本文在現(xiàn)行質(zhì)量標準YBH05792019基礎(chǔ)上進行方法優(yōu)化，可以同時檢測出LPC和LPE的含量，并進行了方法驗證，結(jié)果準確，能夠有效的控制前列地爾注射液的質(zhì)量。

1 "儀器與試藥

1.1 "儀器設(shè)備

LC-20A型HPLC（SHIMADZU公司）；ELSD- LTⅡ型蒸發(fā)光散射檢測器（SHIMADZU公司）；XS205DU型電子天平（MEELER TOLEDO）。

1.2 "試劑試藥

LPC對照品（USP，批號089F0，純度為99.0%），LPE對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號 190024-202107，純度為93.2%）；前列地爾注射液（批號：2204161，自制）甲醇、異丙醇、正庚烷、正己烷、三乙胺（色譜純，F(xiàn)isher），冰醋酸、三氯甲烷（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），水為屈臣氏純凈水。

2 "實驗方法與結(jié)果

2.1 "色譜條件

色譜柱 （Ultimate Diol 250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：流動相A為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺混合，體積比（85∶15∶0.5∶0.05），流動相B為正己烷-異丙醇-流動相 A混合，體積比（20∶48∶32），蒸發(fā)光散射檢測器（霧化氣為氮氣，霧化氣壓力為 " 25 psi，漂移管溫度為40 ℃），柱溫40 ℃，流速

1.0 mL·min-1，梯度洗脫程序見表1。

2.2 "溶液配制

2.2.1 "對照品溶液的配制

精密稱取LPC和LPE對照品適量，加三氯甲烷-甲醇（2∶1）適量使溶解，用異丙醇-正庚烷（2∶1）定量稀釋制成LPC質(zhì)量濃度分別為0.02、0.06、0.10、0.20 mg·mL-1和LPE質(zhì)量濃度分別為0.01、0.03、0.05、0.10 mg·mL-1的溶液，即得對照品混合溶液。

2.2.2 "供試品溶液的配制

取本品5支混勻，精密量取2 mL，置 20 mL 量瓶中，加異丙醇-正庚烷（2∶1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 "對照品貯備液的配制

精密稱取LPC對照品約20 mg和LPE對照品約10 mg，置于20 mL量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（2∶1）溶解并定容至刻度，作為對照品貯備液。

2.2.4 "供試品加標溶液

取前列地爾注射液5支混勻，精密量取2 mL，加入對照品貯備液2 mL，用異丙醇-正庚烷（2∶1）定容至20 mL。

2.3 "系統(tǒng)適用性和專屬性試驗

精密量取2.2.4項下供試品加標溶液100 μL，連續(xù)進樣5次，色譜圖見圖1。LPC和LPE的保留時間和峰面積的RSD分別為0.6%、0.3%和0.7%、0.5%，LPC和LPE峰與相鄰各峰分離效果較好，本方法系統(tǒng)適用性良好。

取空白乳劑，按照樣品處方工藝制備（除蛋黃卵磷脂成分以外）量取2 mL，置20 mL量瓶中，加異丙醇-正庚烷（2∶1）溶解并定容至刻度，搖勻，作為空白乳劑；分別取三氯甲烷-甲醇（2∶1）和異丙醇-正庚烷（2∶1）作為空白溶劑，另取2.2.1和2.2.2項下對照品混合溶液和供試品溶液分別進樣，結(jié)果表明，在此色譜條件下，對LPC和LPE的檢測不受干擾。見圖2。

2.4 "重復(fù)性試驗

按照2.2.4平行配制6份樣品加標溶液，按照上述色譜條件測定該6份樣品，結(jié)果表明6份樣品LPC和LPE的含量的RSD分別為1.2%和1.9%，證明此方法的重復(fù)性較好。

2.5 "定量限和檢測限

信噪比為10∶1時，LPC和LPE的定量限分別0.02 mg·mL-1和0.01 mg·mL-1，信噪比為3∶1時，兩者的檢測限為0.006 mg·mL-1和0.003 mg·mL-1。 "6份定量限溶液的峰面積RSD分別為3.8%和4.2%。

2.6 "線性和范圍

精密量取2.2.1項下系列濃度的對照品溶液各100 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以各濃度的對數(shù)與其所對應(yīng)的峰面積的對數(shù)進行線性回歸方程計算。LPC的線性回歸方程為y=1.545 8x +7.214 4（r=0.999 9）；LPE的線性回歸方程為y=1.458 7x + 7.691（r=0.999 8）。結(jié)果表明LPC在 " " " " "0.02～0.20 mg·mL-1、LPE在0.01～0.1 mg·mL-1范圍內(nèi)濃度對數(shù)與峰面積對數(shù)的線性關(guān)系良好。

2.7 "準確度

稱取LPC對照品和LPE對照品各適量，分別加三氯甲烷-甲醇（2∶1）適量使溶解，用異丙醇-正庚烷（2∶1）定量稀釋制成LPC質(zhì)量濃度約

1.0 mg·mL-1和LPE質(zhì)量濃度約0.5 mg·mL-1的混合溶液，作為對照品貯備液，分別量取LPC對照品貯備液和LPE胺對照品貯備液0.5 mL、1.0 mg、1.5 mL于10 mL量瓶中，并于每個容量瓶中精密加入前列地爾注射液樣品1 mL，加異丙醇-正庚烷（2∶1）稀釋至刻度，每濃度制備3份。分別精密量取上述溶液各100 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。將實測值與理論值比較，計算回收率，溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺的平均回收率（n=9）分別為101.4%（RSD=2.4%）和98.8%（RSD=1.9%），如 " " 表2、表3所示。

2.8 "溶液穩(wěn)定性

精密稱取溶血磷脂酰膽堿對照品約20 mg和溶血磷脂酰乙醇胺對照品約10 mg于20 mL量瓶中加三氯甲烷-甲醇（2∶1）溶解并定容至刻度，作為對照品儲備液，精密量取前列地爾注射液和對照品貯備液各2 mL，置20 mL量瓶中，加異丙醇-正庚烷（2∶1）稀釋至刻度，作為供試品加標溶液。取供試品加標溶液置液相進樣器樣品室（4 ℃）條件下測定?？疾鞓悠吩?、2、4、6、7 h內(nèi)的溶液穩(wěn)定性，以峰面積統(tǒng)計，LPC和LPE的峰面積的相對標準偏差分別為2.7%和3.2%，結(jié)果表明供試品溶液在4 ℃條件下儲存7 h穩(wěn)定。

2.9 "耐用性

分別考察柱溫±5 ℃、漂移管溫度±5 ℃、流速±10%及不同批號色譜柱幾種條件下，供試品溶液中溶血磷脂酰膽堿峰和溶血磷脂酰乙醇胺含量（回收率）范圍在90%～110%之間，各條件下含量的相對標準差均≯5.0%，說明方法耐用性良好。

2.10 "3批樣品測定

取前列地爾注射液2 204 141批、2 204 152批、2 204 162批（蓬萊諾康藥業(yè)有限公司）分別按照本方法測定，溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺均未檢出。

3 "討論

3.1 "色譜柱的篩選

同時考察了kromasilsi（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱和sepax HP-Diol（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱進行考察，發(fā)分離效果及峰型均較差。

3.2 "流動相及色譜條件的優(yōu)化

通過一系列調(diào)整流動相初始比例以及梯度洗脫條件，使LPC和LPE與其他色譜峰達到分離，同時添加三乙胺組分，可以有效的改善峰形[10]。

3.3 "供試品溶液貯存時間的考察

本次研究在溶液穩(wěn)定性考察部分，采用進樣器4 ℃控溫，每1 h進樣1次，累積了供試品溶液持續(xù)放置12 h的峰面積數(shù)據(jù)，結(jié)果可見，12組LPC和LPE峰面積RSD分別為6.5%和8.9%，根據(jù)峰面積的變化趨勢可以看出樣品在第8 h取樣點峰面積明顯下降。因此將供試品溶液需冷藏，且配制后需在7 h內(nèi)進樣完畢。

4 "結(jié) 論

本研究建立了HPLC法同時測定前列地爾注射液中的LPC和LPE含量的方法，該方法經(jīng)過方法驗證，結(jié)果表明此方法專屬性和重復(fù)性較好，準確度較高，為產(chǎn)品的質(zhì)量研究提供了依據(jù)。

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Determination of Lysophosphatidyl Choline and Lysophosphatidyl Ethanolamine in Alprostadil Injection by HPLC

ZHANG Shuo1， FU Yong-hui2， WU Li-hua1， SUN Yin-ling1， CHEN Yang1

（1. Broad Life Science （Liaoning） Co.， Ltd.， Shengyang Liaoning 110171， China;

2. Penglai Nuokang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Penglai Shandong 265600， China）

Abstract： "The content of lysophosphatidyl choline and lysophosphatidyl ethanolamine in alprostadil injection was determined by HPLC-ELSD. "The low temperature evaporative light scattering detector （atomized gas was nitrogen， atomized gas pressure was 25 psi， drift tube temperature was 40 ℃） with Ultimate Diol column （4.6mm×250mm， 5μm） was used. The mobile phase A was methanol， water， glacial acetic acid， triethylamine （85∶15∶0.5∶0.05）， and the mobile phase B was n-hexane， isopropanol， and mobile phase A （20∶48∶32）. The column temperature was 40 ℃， and the gradient elution was performed. "There was a good linear relationship when the mass concentration of lysophosphatidylcholine was 0.02～0.20 mg·mL-1 （r=0.999 9， n=6） and the mass concentration of lysophosphatidyl ethanolamine was 0.01 ～ 0.1 mg·mL-1（ r =0.999 8， n =6）. "Limits of quantitation were 0.02 mg·mL-1 and 0.01 mg·mL-1， and limits of detection were 0.006 mg·mL-1 and 0.003 mg·mL-1， respectively. "The average recoveries （n=9） were 101.4% （RSD=2.4%） and 98.8% （RSD=1.9%）， respectively. "The established HPLC method can accurately determine the content of lysophosphatidylcholine and lysophosphatidylethanolamine in alprostadil injection.

Key words： "HPLC; Alprostadil injection; Lysophosphatidyl choline; Content