荷丹片中蓮堿的UHPLC測(cè)定方法研究

摘 " " "要：采用UHPLC法建立中藥荷丹片中蓮堿的含量測(cè)定方法。色譜柱為Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm ×150 mm，2.7 μm），流動(dòng)相為水-乙腈-三乙胺-冰乙酸（68.1∶30∶1.6∶0.3），以0.6 mL·min-1流速等度洗脫，波長(zhǎng)272 nm。結(jié)果表明：方法的專(zhuān)屬性良好，蓮堿在0.004～0.04 μg范圍內(nèi)的絕對(duì)進(jìn)樣量與峰面積間具有良好的線性關(guān)系，穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度、加樣回收率的RSD均在3%以內(nèi)。所建立的UHPLC法快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可作為荷丹片中蓮堿的含量測(cè)定方法。

關(guān) "鍵 "詞：荷丹片；蓮堿；含量測(cè)定；超高效液相色譜

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ460.7 " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A " " 文章編號(hào)： 1004-0935（2023）03-0450-04

荷丹片是由荷葉、丹參、補(bǔ)骨脂、山楂、番瀉葉組成中藥復(fù)方片劑，具有較好的降低血脂、降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生率等藥理作用[1-3]。建立合理有效的含量測(cè)定方法以對(duì)其進(jìn)行合理的質(zhì)量控制，一直是荷丹片的研究熱點(diǎn)。在目前已建立的含量測(cè)定方法中，絕大多數(shù)均是圍繞荷丹片中含量較高的一種或幾種的特征性成分（荷葉堿、補(bǔ)骨脂素、丹參酮IIA等）進(jìn)行的[4-5]。荷葉中的蓮堿在1961年被首次發(fā)現(xiàn)，它可以通過(guò)活化5-羥色胺受體，使人體產(chǎn)生厭食感和飽腹感，從而通過(guò)降低食欲達(dá)到減肥降脂的功效，是荷丹片中的特征藥效物質(zhì)成 "分[6-7]。然而，由于荷丹片成分復(fù)雜，且其中蓮堿的含量相對(duì)較低，對(duì)其進(jìn)行色譜分析的難度較大，因此至今未見(jiàn)荷丹片中蓮堿的含量測(cè)定相關(guān)報(bào)道。

超高效液相色譜（UHPLC）是在常規(guī)HPLC的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的色譜新技術(shù)，相對(duì)于HPLC而言，UHPLC具有分析通量高、分離能力強(qiáng)、溶劑用量少，分析時(shí)間短等一系列優(yōu)點(diǎn)，非常適合于中藥等復(fù)雜體系中微量成分的分離分析工作[8-9]。為了對(duì)荷丹片進(jìn)行更全面合理的質(zhì)量控制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種基于UHPLC技術(shù)的荷葉中蓮堿的含量測(cè)定方法，該法具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，且分析時(shí)間短，專(zhuān)屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便。

1 "材料與儀器

1.1 "儀器

安捷倫1290 infinity超高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；XP205電子分析天平，梅特勒-托利多上海儀器公司；SK-5200H超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 "試藥

蓮堿標(biāo)準(zhǔn)品，純度gt;98%，四川省維克奇生物科技有限公司；色譜純乙腈、色譜純甲醇、分析純冰乙酸、分析純?nèi)野?，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；娃哈哈純凈水。三批的荷丹片，批號(hào)20210201、20210305、20210430，薄膜衣片，南昌濟(jì)順制藥有限公司。

2 "方法與結(jié)果

2.1 "色譜條件

色譜柱為Poroshell 120 EC-C18色譜柱（3.0 mm ×150 mm， 2.7 μm，Agilent公司；流動(dòng)相為水-乙 " "腈-三乙胺-冰乙酸（68.1∶30∶1.6∶0.3）；進(jìn)樣量為3 μL；流速為0.6 mL·min-1；柱溫為45 ℃；波長(zhǎng)為272 nm。

2.2 "溶液的制備

空白溶劑的制備：色譜級(jí)甲醇溶液。

對(duì)照品溶液的制備：分析天平精密稱定蓮堿對(duì)照品10.0 mg放入到100 mL容量瓶中，向該容量瓶中加入色譜級(jí)甲醇，定容至刻度后搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.10 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再將該儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋?zhuān)玫降膶?duì)照品溶液質(zhì)量濃度為 " " 8.0 μg·mL-1。

供試品溶液的制備：將去除了薄膜衣的12片荷丹片搗碎，取樣，精密稱定約0.5 g，轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中，加入色譜級(jí)甲醇定容至刻度，超聲提取55 min（40 kHz、300 W），放冷后加入色譜級(jí)甲醇補(bǔ)足損失的重量，4 ℃保存?zhèn)溆?，用前微孔濾膜 " 過(guò)濾。

2.3 "方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 "專(zhuān)屬性

分別將3 μL的空白溶劑、對(duì)照品溶液和供試品溶液注入到UHPLC中，根據(jù)所建立的色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1至圖3所示?？瞻兹軇?duì)蓮堿的檢測(cè)無(wú)干擾，樣品中蓮堿的色譜峰與相鄰峰的分離度大于1.5，以蓮堿峰計(jì)算理論塔板數(shù)不小于 " 12 000，可見(jiàn)該方法具有較好的專(zhuān)屬性。

2.3.2 "線性和范圍

取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋得到1.333、2.666、5.332、8.000、10.664、13.333 μg·mL-1的系列溶液，各吸取3 μL注入到UHPLC進(jìn)行分析。對(duì)所得的色譜圖進(jìn)行積分，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以蓮堿的絕對(duì)含量X（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性擬合方程為Y = 3 624X + 10.3，r = 0.999 8，表明所建立方法線性關(guān)系較好。

2.3.3 "檢出限和定量限

取蓮堿對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e以蓮堿色譜峰的信噪比S/N≥3和S/N≥10確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果表明，以蓮堿的絕對(duì)進(jìn)樣量計(jì)，LOD = 0.081 ng，LOQ = 0.220 ng，方法靈敏度較好。

2.3.4 "精密度

按照2.2項(xiàng)下要求制備對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為8.0 μg·mL-1），連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定保留時(shí)間和面積，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。結(jié)果可知，方法精密度較好。

2.3.5 "重復(fù)性

取同一批次荷丹片（批號(hào)20210201），按照2.2項(xiàng)下中供試品溶液的制備方法制備平行的供試品溶液6份，注入到UHPLC檢測(cè)蓮堿的含量，具體結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 "穩(wěn)定性

將依2.2項(xiàng)下要求制備的供試品溶液，分別于第0、4、16、24、36、48 h，注入到UHPLC中進(jìn)行色譜分析，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。結(jié)果表明，樣品溶液能穩(wěn)定至少48 h。

2.3.7 "加樣回收率

取同一批次荷丹片（批號(hào)20210201），粉碎后平行稱取6份，每份約0.5 g，分別轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，各組精密加入蓮堿對(duì)照品溶液，分別制備樣品溶液，依所建立的色譜條件進(jìn)行分析，具體數(shù)據(jù)如表4所示。結(jié)果顯示，該方法加樣回收率滿足分析測(cè)試要求。

2.4 "樣品測(cè)定

按所建立的樣品制備方法，制備3批次荷丹片進(jìn)樣溶液，依所建立的色譜條件，取3 μL注入U(xiǎn)HPLC分析，按積分峰面積計(jì)算各批次荷丹片中蓮堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.052～0.062 mg·g-1范圍內(nèi)，詳情見(jiàn)表5。

3 "結(jié)果與討論

文獻(xiàn)表明，蓮堿屬于生物堿類(lèi)物質(zhì)，具有一定的極性，在甲醇、乙醇等極性質(zhì)子性溶劑中溶解性較好[10-11]，因此本實(shí)驗(yàn)分別考察了用100%甲醇、100%乙醇以及不同比例的甲醇/水和乙醇/水作為提取溶劑時(shí)蓮堿的提取效率，最終發(fā)現(xiàn)用100%甲醇超聲提取荷丹片中的蓮堿提取率最高。在提取時(shí)間方面，分別考察了提取35、45、55、65 min時(shí)的蓮堿含量，發(fā)現(xiàn)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸升高，但當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)55 min后，提取率不再增加，因此決定超聲55 min。

在固定相的選擇方面，本實(shí)驗(yàn)所使用的色譜柱（prorshell 120 EC-C18）采用了2.7 μm粒徑的核殼型填料，該填料采用Fused-Core（熔融）技術(shù)，將多孔硅殼熔融到實(shí)心的硅核上制備而成。相對(duì)于同粒徑的傳統(tǒng)全多孔硅膠填料而言，核殼型填料可以同時(shí)減小被分析物的軸向和縱向擴(kuò)散，因此具有柱效高、分離快速、背壓低等一系列優(yōu)點(diǎn)[12-13]，非常適合于中藥等復(fù)雜基質(zhì)的快速高效分析。

4 "結(jié) 論

本研究所建立的分析方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的微量蓮堿成分進(jìn)行快速的色譜分離。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、可靠性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，系統(tǒng)適用性良好。綜上，本法可用于中藥荷丹片中蓮堿含量的快速分析檢測(cè)，能夠?yàn)楹傻て妗⒑侠淼馁|(zhì)量評(píng)價(jià)提供有效的依據(jù)。

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Determination of Roemerine in Hedan Tablet by UHPLC

WU Jia-ni1，2， DENG Shi-ren1， CHEN Xiao-xia1， ZHANG Wen-hui1，2， BIAN Xing1， SUN Lu， XIA Lin-bo1

（1. College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian Liaoning 116600， China;

2. Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Dalian Liaoning 116600， China）

Abstract： "The method to determine the roemerine content in Hedan tablet was established by UHPLC. Poroshell 120 EC-C18 " "（3.0 mm ×150 mm， 2.7 μm） was used as the stationary phase， and the mobile phase was water-acetonitrile-triethylamine-glacial acetic acid （68.1∶30∶1.6∶0.3） ， equal elution was carried out with the flow rate of 0.6 mL·min-1，and the detection wavelength was 272 nm. The results show that， the specificity of the method was good， the absolute sample mass of roemerine from 0.004～0.04 μg had a good linear relationship with the peak area. The RSD of stability， repeatability， precision and recovery were within 3%. The established UHPLC method is fast， accurate， stable and reliable， and can be used as a method for measuring roemerine content in Hedan tablet.

Key words： "Hedan tablet; Roemerine; Determination; UHPLC