櫻桃病毒A實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用

摘要：在櫻桃病毒A（CVA） mp基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了3對(duì)檢測(cè)引物，經(jīng)特異性篩選后，獲得可用于病毒定量研究的引物。制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)驗(yàn)證該方法的靈敏度和特異性，并應(yīng)用于田間果樹樣品CVA定量檢測(cè)。最終成功篩選出1對(duì)檢測(cè)效率高、特異性強(qiáng)的引物（CVA-dF2、CVA-dR2），基于SYBR Green I熒光染料建立反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CVA的方法。該方法重復(fù)性好、靈敏度高，無需借助內(nèi)參基因即可準(zhǔn)確檢測(cè)目的病毒載量，絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.574 6，決定系數(shù)R2為0.998 6，擴(kuò)增效率為0.904 4，比常規(guī)RT-PCR檢測(cè)靈敏度高10倍。該方法的建立為CVA定量研究提供了有力工具，可用于果樹中CVA批量檢測(cè)或低豐度病毒樣品檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：櫻桃病毒A（CVA） ；反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR；快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S432" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）07-0163-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.07.028 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract：Three pairs of detection primers were designed in the conserved region of cherry virus A （CVA） mp gene. After specific screening， primers were obtained that could be used for virus quantitative research. Preparation of plasmid standards， and establishment of standard curves were conducted the sensitivity and specificity of this method， were verified and it is applied to the quantitative detection of CVA in field fruit tree samples. One pair of primers with high detection efficiency and strong specificity （CVA-dF2， CVA-dR2） was successfully screened， and a real-time reverse transcription fluorescence quantitative PCR method for detecting CVA was established based on SYBR Green I fluorescent dye. This method had good repeatability and high sensitivity. It could accurately detect the target viral load without the help of internal reference genes. The slope of the absolute quantitative standard curve was" " " " " "-3.574 6， the coefficient of determination R2 was 0.998 6， and the amplification efficiency was 0.904 4， which was 10 times higher than the sensitivity of conventional RT-PCR detection.The establishment of this method provided a powerful tool for quantitative research on CVA， which could be used for batch detection of CVA in fruit trees or detection of low abundance virus samples.

Key words： cherry virus A （CVA）； reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR； quick detection

櫻桃病毒A（Cherry virus A，CVA）屬于β線性病毒科（Betaflexiviridae）發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）成員［1］，病毒基因組為正義單鏈RNA［2］，包含2個(gè)重疊的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）［3］，ORF1編碼一個(gè)266 ku的多聚蛋白，經(jīng)切割加工后產(chǎn)生與復(fù)制相關(guān)的蛋白和外殼蛋白，ORF2編碼運(yùn)動(dòng)蛋白，大小約52 ku［4］。1995年，CVA首次在德國栽培的甜櫻桃樹中被檢測(cè)到［5］，之后印度［6］、意大利［7］、匈牙利［8］、波蘭［9］、英國［10］、加拿大［11］、澳大利亞［12］、捷克共和國［13］、日本［14］和中國［15，16］相繼檢測(cè)到CVA侵染不同寄主植物。自然狀態(tài)下，CVA主要侵染櫻桃樹。有研究表明，CVA在櫻桃樹中的發(fā)生率一直保持在較高水平。2004年，日本學(xué)者Isogaid等［17］對(duì)5種櫻桃病毒進(jìn)行了分子檢測(cè)，CVA檢出率高達(dá)92%；2015年，印度學(xué)者Noorani等［18］利用ELISA和RT-PCR對(duì)74份櫻桃樣品進(jìn)行CVA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了40份陽性樣品；同年，盧美光等［19］對(duì)中國部分地區(qū)櫻桃病毒病進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果表明，CVA在遼寧省大連市、山東省泰安市和北京市均有分布，綜合發(fā)生率為40%；2020年，曲誠懷等［20］對(duì)山東省煙臺(tái)市牟平區(qū)甜櫻桃病毒病進(jìn)行調(diào)查、檢測(cè)及鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40份樣品中CVA檢出率為45%。此外，杏樹、桃樹、李樹也是該病毒的自然寄主［21，22］。CVA主要依靠果樹枝條嫁接和營養(yǎng)繁殖進(jìn)行傳播，自然界尚未發(fā)現(xiàn)蟲傳介體。由于果樹病毒種類多，復(fù)合侵染嚴(yán)重，CVA往往與其他果樹病毒復(fù)合侵染［23-25］，加之缺少可用于研究CVA的草本模式寄主，因此，對(duì)病毒侵染引起的寄主癥狀尚不明確，也無法評(píng)估對(duì)果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的影響。但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CVA為潛伏侵染，不會(huì)表現(xiàn)出明顯癥狀［26］。而CVA與其他核果病毒共感染可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重癥狀，并引起產(chǎn)量和質(zhì)量損失［27］。

CVA多依靠血清學(xué)和基因擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR應(yīng)用較普遍，該方法準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)。在果樹生長季節(jié)也可用ELISA［28］和斑點(diǎn)雜交［29］技術(shù)對(duì)田間大量果樹葉片樣本進(jìn)行檢測(cè)，具有耗時(shí)少、處理樣本多的優(yōu)點(diǎn)，適合統(tǒng)計(jì)某個(gè)地區(qū)果樹中CVA的發(fā)生情況。近年來，中國學(xué)者陳玲等［30］建立了基于重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)的CVA檢測(cè)方法，配合側(cè)向流試紙條，實(shí)現(xiàn)了CVA的可視化檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）具有高靈敏度、高特異性、可對(duì)植物特定組織部位進(jìn)行病毒定量研究等優(yōu)點(diǎn)［31］，已成為分子植物病毒學(xué)常用的檢測(cè)方法之一，同時(shí)也可作為植物病毒致病機(jī)制研究的重要工具。運(yùn)用TaqMan探針技術(shù)檢測(cè)CVA［32］的成本較高。利用RT-qPCR檢測(cè)CVA，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究針對(duì)CVA mp基因設(shè)計(jì)了3對(duì)RT-qPCR檢測(cè)引物，篩選出1對(duì)靈敏度高、重復(fù)性好的引物，基于SYBR Green I熒光染料建立RT-qPCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料收集

2019年10月至2021年12月，在陜西省安康市櫻桃園采集癥狀表現(xiàn)為褪綠、斑駁、花葉和畸形的櫻桃葉片樣品21份，采集無癥狀葉片83份，保存于安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室的-80 ℃超低溫冰箱，備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已公布的CVA mp基因序列信息，使用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)用于RT-qPCR檢測(cè)CVA的引物和CVA mp基因全長擴(kuò)增引物，所有引物序列見表1，引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

1.3 櫻桃葉片總RNA提取與cDNA合成

稱取0.2 g櫻桃葉片樣本，置于液氮中充分研磨，迅速轉(zhuǎn)入1.5 mL RNA free eppendorf管中。按照OmniPlant RNA Kit（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）說明書的操作步驟提取RNA。最終將獲得的RNA溶液保存至-80 ℃冰箱，備用。取1 μL的RNA溶液，使用HiFi-MMLV cDNA Kit（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）合成病毒cDNA第一鏈，并置于" " -20 ℃保存，備用。

1.4 CVA陽性植株檢測(cè)、mp基因擴(kuò)增與克隆

使用CVA-F、CVA-R引物，通過RT-PCR篩選CVA陽性植株，以感染CVA植株的cDNA為模板，使用CVA-MP-F、CVA-MP-R引物擴(kuò)增mp基因全長，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收，將純化的mp基因片段連接至pBM16A載體（博邁德生物），轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆培養(yǎng)后，將PCR鑒定為陽性的菌液送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

50 μL PCR反應(yīng)體系：25 μL 2×Taq MasterMix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、2 μL上游引物、2 μL下游引物、2 μL cDNA模板、19 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)數(shù)為35；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 CVA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

選取經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無誤后的陽性菌液，提取質(zhì)粒，使用Nanodrop測(cè)定質(zhì)粒濃度后根據(jù)式（1）計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，將其作為CVA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算公式如下：

質(zhì)?？截悢?shù)=（質(zhì)粒濃度/質(zhì)粒總堿基數(shù)）×9.12×1011" " " （1）

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

經(jīng)測(cè)定，質(zhì)粒起始濃度為105 ng/μL，起始拷貝數(shù)為2.94×1010 copies/μL，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋，最終獲得2.94×102～2.94×108 copies/μL的7個(gè)質(zhì)粒模板。20 μL RT-qPCR反應(yīng)體系：10 μL 2×UltraSYBR Mixture（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、1 μL質(zhì)粒模板、8 μL ddH2O。使用LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR，每對(duì)引物、每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)，利用Excel 2016軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算擴(kuò)增效率（E）。擴(kuò)增效率的計(jì)算公式如下：

式中，K為曲線斜率。

1.7 RT-qPCR和RT-PCR靈敏度比較

以最終獲得的7個(gè)不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分別進(jìn)行RT-qPCR和RT-PCR，比較2種方法的檢測(cè)靈敏度。

1.8 RT-qPCR特異性檢測(cè)

為了評(píng)估RT-qPCR檢測(cè)的特異性，選擇3種櫻桃樹中常見的植物病毒，即櫻桃小果病毒2（Little cherry virus 2， LchV2）、李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus， PNRSV）和櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherry green ring mottle virus， CGRMV）。提取葉片的總RNA，使用RT-PCR篩選陽性樣品，分別作為RT-qPCR的模板進(jìn)行特異性測(cè)試。LchV2、PNRSV和CRGMV的引物序列信息見表2。

1.9 櫻桃葉片和冬季休眠枝條中CVA病毒的定量檢測(cè)

2021年1月在陜西省安康市收集了12份櫻桃樹休眠枝條，在83份無癥狀櫻桃葉片樣品中隨機(jī)選取32份進(jìn)行檢測(cè)，提取葉片或枝條韌皮部組織的總RNA，統(tǒng)一調(diào)整RNA濃度為100 ng/μL，以無毒植株葉片或枝條為健康對(duì)照，根據(jù)定量結(jié)果計(jì)算病毒含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-qPCR引物質(zhì)量檢測(cè)與CVA mp基因克隆

提取感染病毒的櫻桃葉片總RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄合成病毒第一鏈cDNA，使用CVA-F、CVA-R引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增得到約650 bp條帶（圖1，泳道2），與預(yù)期檢測(cè)的條帶大小吻合，確定為陽性樣本。使用CVA-MP-F、CVA-MP-R引物對(duì)CVA陽性樣本cDNA再次擴(kuò)增，獲得約1.4 kb的mp全長基因片段（圖1，泳道3）。

使用CVA-dF1、CVA-dR1，CVA-dF2、CVA-dR2和CVA-dF3、CVA-dR3引物擴(kuò)增分別得到153、139、360 bp特異性條帶（圖2），與引物設(shè)計(jì)的預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化、連接至pBM16A載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，選擇陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，序列經(jīng)Blast比對(duì)是正確的。從凝膠電泳結(jié)果看來，CVA-dF3、CVA-dR3引物擴(kuò)增出現(xiàn)了非特異性條帶，因此，不建議使用CVA-dF3、CVA-dR3引物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以2.94×102～2.94×108 copies/μL濃度的7個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為RT-qPCR的模板，使用CVA-dF1、CVA-dR1和CVA-dF2、CVA-dR2引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，Ct越低，說明樣本中病毒拷貝數(shù)越高。由圖3可知，在檢測(cè)同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，使用CVA-dF1、CVA-dR1引物檢測(cè)得到的Ct要高于CVA-dF2、CVA-dR2引物檢測(cè)的Ct，說明CVA-dF2、CVA-dR2引物的檢測(cè)效率高，因此，最終篩選出可用于CVA定量研究的引物為CVA-dF2、CVA-dR2，其具有靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。

使用CVA-dF2、CVA-dR2引物建立絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.574 6，決定系數(shù)R2為0.998 6，線性方程為y=-3.574 6x+40.539，擴(kuò)增效率為0.904 4，可用于CVA定量研究。

2.3 RT-qPCR和RT-PCR靈敏度對(duì)比

靈敏度對(duì)比試驗(yàn)（圖5）結(jié)果顯示，RT-qPCR比常規(guī)RT-PCR檢測(cè)靈敏度高10倍，RT-qPCR能準(zhǔn)確檢測(cè)2.94×102 copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，而普通的RT-PCR只能檢測(cè)到2.94×103 copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，而且此時(shí)凝膠電泳檢測(cè)到的CVA特異性條帶亮度較低。

2.4 RT-qPCR特異性檢測(cè)

RT-qPCR特異性結(jié)果顯示，只有感染CVA的樣品出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線（圖6a），而感染其他3種櫻桃病毒的樣品沒有檢測(cè)曲線，但通過RT-PCR驗(yàn)證確定這些樣品帶有病毒（圖6b）。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)櫻桃樹樣品中CVA病毒載量

12份休眠枝條RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果（圖7a）顯示，10份休眠枝條感染CVA，Ct分別為15.02、16.43、16.87、17.22、18.48、19.91、30.51、31、31.21和31.78，且均為單一熔解峰（圖7b）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出CVA病毒量依次為4.05×107、1.63×107、1.23×107、9.81×106、4.36×106、1.74×106、1.88×103、1.37×103、1.20×103、8.29×102 copies/μL。

此外，為了使檢測(cè)方法應(yīng)用更廣泛，在來自陜西省安康市的83份無癥狀櫻桃葉片樣品中隨機(jī)抽取32份進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，對(duì)Ct≥35.00的樣品不統(tǒng)計(jì)病毒定量數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性樣本為22份（表3），檢出率為68.75%，表明CVA在櫻桃樹中發(fā)生普遍，但如此高的病毒發(fā)生率對(duì)櫻桃的品質(zhì)和產(chǎn)量的影響目前尚不明確，需持續(xù)監(jiān)測(cè)研究，以確定有效的病毒病防控措施。

3 討論

CVA在果樹中普遍發(fā)生，植物病毒及其所致病害對(duì)各種農(nóng)林作物的為害日趨嚴(yán)重且防治困難。近年來，人們針對(duì)不同病害進(jìn)行了許多探索，但是，對(duì)大多數(shù)病毒病還很難防治，也沒有一個(gè)或一套通用、有效的方法［36］。為了確保果樹能優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、持續(xù)性地生產(chǎn)與提高，無毒種苗與植物組織脫毒技術(shù)成為控制病毒病的關(guān)鍵，而建立準(zhǔn)確、可靠、靈敏的植物病毒檢測(cè)方法是控制病毒病的必要前提。

果樹和繁殖材料中病毒的早期檢測(cè)是李屬及其核果作物病毒病防控最有效的方法。因果樹病毒多為韌皮部專性寄生，常規(guī)RT-PCR有一定的局限性，對(duì)于病毒滴度低的樣本檢測(cè)比較困難，擴(kuò)增后凝膠成像分辨率低，易導(dǎo)致假陰性。隨著分子植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷完善，RT-qPCR技術(shù)在果樹病毒檢測(cè)方面發(fā)揮重要作用，與標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR相比，其具有更快速、更敏感、更精確、可定量檢測(cè)的特點(diǎn)［37］。雖然果樹病毒RT-qPCR檢測(cè)方法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但有時(shí)缺少不同寄主分離物的病毒基因組序列信息，因此很難建立一套通用的RT-qPCR檢測(cè)技術(shù)［38］。本研究利用不同寄主和不同地理來源的CVA分離物mp基因序列，使用ClustalW軟件進(jìn)行多重比對(duì)，確定病毒基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)3對(duì)用于檢測(cè)CVA的RT-qPCR引物，最終篩選出1對(duì)檢測(cè)效率高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)的CVA檢測(cè)引物，在田間樣品的實(shí)際檢測(cè)中表現(xiàn)優(yōu)異。

有研究表明，基于SYBR Green I 熒光染料的RT-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)品多來自重組質(zhì)粒，因其純度高、單一性好的特點(diǎn)，可最大限度避免熔解曲線雙峰（非特異性擴(kuò)增）。本研究以構(gòu)建的CVA mp重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2為0.998 6，表明CVA質(zhì)?？截悢?shù)與Ct之間有良好的線性關(guān)系，并且在田間樣品的實(shí)際檢測(cè)中，獲得的擴(kuò)增曲線仍具有單一熔解峰，進(jìn)一步確定引物設(shè)計(jì)和檢測(cè)體系是特異的。此外，擴(kuò)增效率（E）也是qPCR的關(guān)鍵參數(shù)，對(duì)于高擴(kuò)增效率的檢測(cè)體系來說，E應(yīng)在0.90～1.05，E低于0.90則表明引物設(shè)計(jì)或反應(yīng)體系不合理，E高于1.05則可能存在模板稀釋問題或非特異性擴(kuò)增，本研究獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線E為0.904 4，證實(shí)建立的CVA檢測(cè)體系符合定量研究標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

基于SYBR Green I 熒光染料的RT-qPCR為CVA檢測(cè)提供了新方法，該方法具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、成本低、可對(duì)病毒進(jìn)行絕對(duì)定量研究等優(yōu)點(diǎn)。尤其是能檢測(cè)低豐度組織樣本（如果樹的休眠枝條），可為CVA的早期預(yù)測(cè)提供技術(shù)支撐，降低果樹產(chǎn)業(yè)中由CVA侵染帶來的潛在威脅或經(jīng)濟(jì)損失，進(jìn)而推動(dòng)果樹病毒病防控。此外，該方法無需瓊脂糖凝膠電泳和染色，節(jié)省了時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度，降低了假陰性風(fēng)險(xiǎn)，可作為CVA高效檢測(cè)的工具，在病毒病鑒定、定量研究方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用前景廣闊。

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