墨蘭AP3基因過表達載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化鐵皮石斛

摘要：為探討墨蘭（Cymbidium sinense）AP3基因在蘭花唇瓣中的功能，基于前期從墨蘭轉(zhuǎn)錄組中得到的AP3基因序列，通過PCR技術(shù)構(gòu)建墨蘭AP3基因過表達載體，利用農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化鐵皮石斛（Dendrobium officinale）原球莖，建立遺傳轉(zhuǎn)化體系。經(jīng)PCR驗證，20棵抗性苗中獲得9棵陽性苗，其陽性苗率達45%，成功將墨蘭AP3 基因?qū)腓F皮石斛。

關(guān)鍵詞：墨蘭（Cymbidium sinense）；AP3基因；過表達載體；鐵皮石斛（Dendrobium officinale）；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：S682.31" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）07-0157-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.07.027 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： In order to explore the function of the Cymbidium sinense AP3 gene in the orchid lip， based on the AP3 gene sequence obtained from the Cymbidium sinense transcriptome in the earlier stage， the overexpression vector of the Cymbidium sinense AP3 gene through PCR technology was constructed， and the protocorm of Dendrobium officinale was transformed using Agrobacterium EHA105 to establish a genetic transformation system. After PCR verification， 9 out of 20 resistant seedlings were found to be positive， with a positive seedling rate of 45%. The Cymbidium sinense AP3 gene was successfully introduced into Dendrobium officinale.

Key words： Cymbidium sinense； AP3 gene； overexpression vector； Dendrobium officinale； genetic transformation

蘭科（Orchidaceae）作為被子植物第二大科，其花型特異、品種眾多、分布廣泛，深受民眾喜愛，是中國最大的花卉資源之一［1］。墨蘭（Cymbidium sinense）又名“報歲蘭”，蘭科蘭屬地生植物，多分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，因獨特的花型、花色及花香，具有較高的觀賞性。近年來，墨蘭出口量不斷上升，經(jīng)濟價值也越來越高 ［2，3］。然而，墨蘭花發(fā)育機理仍不清晰，探索其花器官形成的分子機理，對推動蘭科植物分子育種及中國蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義［4］。

近年來，為了揭示蘭科植物花發(fā)育的遺傳機理，研究人員從多種蘭科植物中分離得到與花發(fā)育相關(guān)的功能基因，即 MADS-box基因家族成員［5］。在“ABCDE”花器官發(fā)育的模型中，B類基因最受關(guān)注，其相關(guān)研究也最廣泛［6，7］。AP3基因為MADS-box基因家族B類基因，在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，主要參與調(diào)控花瓣及雄蕊的發(fā)育，而且在整個發(fā)育變化進程中都有表達［8，9］。大量研究表明，在不同的植物中，AP3基因的表達模式各不相同［10，11］，尤其是蘭科植物花型復(fù)雜，其表達模式差異較大。在文心蘭（Oncidium hybridum）中，AP3基因主要作用于萼片及合蕊柱［12］；在大花蕙蘭（Cymbidium hybrid）中，AP3基因在子房、花等器官中均有表達［13］；在蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）中，AP3基因在營養(yǎng)及花器官中均有較高的表達量［14］；在木石斛（Dendrobium crumenatum）中，AP3基因僅在花瓣中表達量較高［15，16］。然而，有關(guān)墨蘭AP3基因的表達模式及功能研究報道較少。

本實驗室前期從墨蘭的花蕾轉(zhuǎn)錄組中分離獲得了AP3基因，經(jīng)過熒光定量組織特異性分析發(fā)現(xiàn)，AP3基因在捧瓣、舌瓣中高表達，推測AP3基因可能與捧瓣和舌瓣的形成有關(guān)［17］。為了進一步探索AP3基因?qū)δm花型形成的分子機理，本研究構(gòu)建墨蘭AP3基因的過表達載體，試圖通過過表達植株花型變化探究AP3基因的功能。由于墨蘭組織培養(yǎng)有一定難度，其遺傳轉(zhuǎn)化體系報道較少，構(gòu)建難度較大，而鐵皮石斛（Dendrobium officinale）除組織培養(yǎng)技術(shù)成熟外，還能在瓶內(nèi)開花，能縮短觀察轉(zhuǎn)基因植株開花表型時間，因此，本研究擬通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將墨蘭AP3基因轉(zhuǎn)化到鐵皮石斛原球莖，優(yōu)化鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高遺傳轉(zhuǎn)化效率，獲得陽性植株。研究結(jié)果可為蘭科植物基因工程育種和研究AP3基因的分子機理提供有用信息，為下一步的遺傳操作改變蘭花花型、培育蘭花新品種和蘭花的保育等方面提供參考，在觀賞園藝和資源保護等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

墨蘭花蕾、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、農(nóng)桿菌EHA105及鐵皮石斛原球莖均由本實驗室提供；載體pBWA（V）HU購自武漢伯遠生物科技有限公司，植物總RNA提取試劑盒和Quantscript RT Kit購自天根生化科技（北京）有限公司，凝膠DNA回收試劑盒購自TaKaRa公司，引物合成及測序均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 基于墨蘭AP3基因cDNA序列和pBWA（V）HU-ccdB-GUS載體多克隆位點上的限制性內(nèi)切酶位點信息，應(yīng)用 Premier 5.0軟件，設(shè)計在5′末端帶有EcoR I酶切位點的引物，用于擴增墨蘭AP3基因cDNA編碼區(qū)序列（CDS序列）；基于載體pBWA（V）HU-ccdB-GUS上潮霉素序列，設(shè)計用于轉(zhuǎn)基因鐵皮石斛的PCR檢測引物。引物序列見表1。

1.2.2 墨蘭AP3基因編碼區(qū)的克隆 以墨蘭新鮮花蕾為材料，提取總RNA，用Quantscript RT Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，CsAP3（F）和CsAP3（R）為引物，利用PCR擴增AP3基因編碼區(qū)。反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃下30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸15 min，14 ℃保溫10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收，純化目的片段。

1.2.3 墨蘭AP3基因過表達載體的構(gòu)建 采用EcoR I酶分別對回收的目的基因片段和載體pBWA（V）HU-ccdB-GUS進行酶切，回收酶切產(chǎn)物，將酶切后的目的基因片段用T4連接酶連接到載體上，通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，將菌液涂抹在含Kan抗性的YM平板上，于28 ℃培養(yǎng)后挑選出白色單菌落，菌落PCR驗證，挑選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，使用EcoR I進行酶切檢驗，隨后將質(zhì)粒送往武漢伯遠生物科技有限公司測序，分析獲得正確的pBWA（V）HU-ccdB-GUS-AP3過表達載體，采用熱激法將過表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 EHA105 菌株中，搖菌，保存于-80 ℃，備用。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系建立 取保存的陽性農(nóng)桿菌EHA105菌液600 μL，加入到100 mL的LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L Kan）中，于28 ℃，150 r/min恒溫振蕩過夜培養(yǎng)。待OD600 nm為1.2時，將菌液4 ℃ 4 000 r/min 離心12 min，倒掉上清液，用懸浮液將菌體重懸，分別制備OD600 nm為0.4、0.6、0.8、1.0和1.2的梯度重懸菌液，并加入100 μmol/L乙酰丁香酮（AS），混勻備用；將長勢較好的原球莖切塊分別接到含有10、20、30、40、50、60 mg/L潮霉素B的篩選培養(yǎng)基上，設(shè)置1組對照，切面朝上，用移液槍吸取少量農(nóng)桿菌乙酰丁香酮混合溶液，涂抹到原球莖的切口面上進行侵染，注意盡量不要將菌液擠到原球莖創(chuàng)面以外。隨后將侵染后的原球莖放在光照培養(yǎng)室，白天25 ℃培養(yǎng)16 h，夜間16 ℃培養(yǎng)8 h，培養(yǎng)30～60 d。在此期間，將長有農(nóng)桿菌的原球莖浸泡在含有200 mg/L頭孢（Cefadroxil）、200 mg/L特美?。═imentin）及200 mg/L羧芐青霉素（Carboxybenzylpenicillin）混合溶液中，震蕩30 min，再用無菌去離子水沖洗3～4次，接入新的篩選培養(yǎng)基上。

1.2.5 鐵皮石斛陽性植株檢測 鐵皮石斛原球莖經(jīng)過60 d的培養(yǎng)，將生長良好的植株進行陽性檢測，使用T5 Direct PCR Kit試劑盒，采用Hyg-B （F）和Hyg-B（R）進行引物PCR擴增，檢測潮霉素基因片段，將檢測后的陽性苗轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基中，30 d后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中。

2 結(jié)果與分析

2.1 墨蘭AP3基因編碼區(qū)的克隆

以墨蘭AP3基因cDNA為模板，利用CsAP3（F）和CsAP3（R）引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小約1 000 bp的條帶（圖1），符合預(yù)期結(jié)果；獲得帶有EcoR I酶切位點的墨蘭AP3基因cDNA編碼區(qū)序列（CDS序列）；回收目的片段可用于后續(xù)墨蘭AP3基因過表達載體的構(gòu)建。

2.2 墨蘭AP3基因過表達載體的構(gòu)建

PCR擴增目的基因，酶切目的基因和載體，將目的基因連接到載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)Kan篩選后隨機挑取克隆單菌落，菌落PCR擴增出約1 000 bp的目的基因片段（圖2），與目的基因片段大小一致；陽性克隆菌液的質(zhì)粒經(jīng)酶切檢驗，條帶大小分別為1 283、2 567、5 324 bp（圖3），符合預(yù)期結(jié)果；對重組質(zhì)粒測序比對分析，序列正確，表明目的基因片段已插入到載體pBWA（V）HU-ccdB-GUS上，載體圖譜見圖4。

2.2.1 農(nóng)桿菌侵染菌液在不同OD600 nm下鐵皮石斛原球莖死亡情況 由圖5可知，當農(nóng)桿菌侵染菌液的OD600 nm為0.4時，鐵皮石斛原球莖死亡率為87.5%；當農(nóng)桿菌侵染菌液的OD600 nm為0.6時，死亡率達92.8%；當農(nóng)桿菌侵染菌液的OD600 nm為0.8時，死亡率為95.6%；之后，隨著農(nóng)桿菌侵染菌液的OD600 nm增大，鐵皮石斛原球莖的死亡率也隨之增高，當農(nóng)桿菌侵染菌液的OD600 nm達1.2時，鐵皮石斛原球莖死亡率達100%。原球莖死亡率過低，不利于陽性苗的篩選，易產(chǎn)生假陽性和嵌合體，死亡率過高，不易獲得陽性苗，因此，當農(nóng)桿菌侵染菌液的OD600 nm為0.6～0.8時，有利于鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化。原球莖生長情況見圖6。

2.2.2 不同篩選濃度潮霉素B對鐵皮石斛原球莖生長的影響 設(shè)置6個潮霉素B的篩選濃度梯度，由圖7可知，隨著潮霉素B篩選濃度升高，鐵皮石斛原球莖死亡率升高。當潮霉素B的篩選濃度為10 mg/L時，大部分原球莖能夠存活，死亡率較低，僅為26.8%；當潮霉素B的篩選濃度為20 mg/L時，原球莖出現(xiàn)大量死亡，死亡率為73.5%；當潮霉素B的篩選濃度持續(xù)升高，到達30 mg/L時，死亡率高達85.6%；當潮霉素B的篩選濃度超過40 mg/L，死亡率達100%。因此，區(qū)分轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化原球莖的潮霉素B有效篩選濃度為10 mg/L，潮霉素B適宜篩選濃度為30 mg/L。原球莖在不同篩選濃度潮霉素B的生長情況見圖8。

2.3 抗性植株鑒定

經(jīng)潮霉素B篩選60 d后，獲得抗性植株（陽性苗），以Hyg-B（F）和Hyg-B（R）為引物，通過T5 Direct PCR Kit試劑盒驗證其中20顆苗，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖9，20棵抗性苗中有9顆苗擴增出潮霉素基因（650 bp），初步鑒定這9顆苗為陽性苗。最后，將陽性苗轉(zhuǎn)入增殖及分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 d后，陽性苗株高為3～5 cm（圖10）。

3 小結(jié)與討論

墨蘭花型獨特、花香濃郁、葉枝挺拔［18］，在蘭花中備受關(guān)注，其獨特花形具有較高的經(jīng)濟價值及觀賞價值［19］。由于蘭花花型復(fù)雜，越來越多的研究者致力于蘭花的花發(fā)育研究，但有關(guān)墨蘭奇花產(chǎn)生的遺傳機制報道較少。有研究表明，AP3基因?qū)μm花的花發(fā)育起到至關(guān)重要的作用［20］。為了揭示墨蘭奇花的形成機理，本研究基于實驗室前期轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)AP3基因在捧瓣和唇瓣上高表達，因此將研究重點放在AP3基因上，擬探討AP3基因在墨蘭的捧瓣和唇瓣形成中發(fā)揮的作用。

由于蘭科的遺傳轉(zhuǎn)化起步較晚，加之墨蘭的組織培養(yǎng)困難及遺傳轉(zhuǎn)化再生體系沒有建立［21］，目前只能通過異源轉(zhuǎn)化研究其基因功能。1997年，Nan等［22］采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將外源基因?qū)胧?，獲得轉(zhuǎn)化植物，使得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在蘭科植物中成為可能，然而，蘭花遺傳轉(zhuǎn)化率仍然較低。本研究構(gòu)建了墨蘭AP3基因過表達載體并導(dǎo)入鐵皮石斛，結(jié)果表明，原球莖死亡率過低，不利于陽性苗的篩選，易產(chǎn)生假陽性和嵌合體，死亡率過高，不易獲得陽性苗，當農(nóng)桿菌侵染菌液的OD600 nm為0.8時，抗性篩選效果最好，鐵皮石斛原球莖死亡率相對較高，與馮瑩［23］在石斛蘭的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果一致；當潮霉素B的篩選濃度為30 mg/L時，鐵皮石斛抗性篩選效果較好，原球莖存活率為14.4%，當潮霉素B篩選濃度超過40 mg/L時， 原球莖全部死亡。因此，當潮霉素B的篩選濃度為30 mg/L時，有利于鐵皮石斛原球莖的篩選，與陳之林等［24］研究選定的石斛品種‘紫蝶’的潮霉素B篩選濃度相同；尤超［25］發(fā)現(xiàn)潮霉素B篩選濃度超過10 mg/L時，石斛的類原球莖全部白化死亡，而本研究中，大部分鐵皮石斛原球莖能夠在篩選濃度為10 mg/L的潮霉素B下存活；陳璐等［26］將篩選濃度為55 mg/L的潮霉素B作為鐵皮石斛最適篩選劑，其轉(zhuǎn)化苗存活率為12.5%。

本研究成功將墨蘭AP3基因?qū)腓F皮石斛原球莖中，經(jīng)分化培養(yǎng)和PCR驗證，20棵抗性苗中獲得9棵陽性苗，其陽性苗率達45%。后續(xù)將進行陽性植株瓶內(nèi)開花的研究，觀察其花型變化。本研究可為研究蘭花花發(fā)育相關(guān)基因的生物學功能驗證提供前期試驗條件，也為蘭花分子育種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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