地衣芽孢桿菌發(fā)酵雪茄煙葉對香氣成分生成的影響

摘要：以雪茄CX-014煙葉為原料，研究了營養(yǎng)劑和接種地衣芽孢桿菌對雪茄香氣生成效率和煙葉品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，正交優(yōu)化得到營養(yǎng)劑配方為3.0%葡萄糖、0.6%谷氨酸、0.6%磷酸氫二銨。添加營養(yǎng)劑（試驗組）發(fā)酵7 d的香氣物質(zhì)總含量達(dá)到635.2 μg/g，較自然發(fā)酵提高了16.4%；類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、棕色化反應(yīng)產(chǎn)物分別較自然發(fā)酵提高了38.2%、159.6%和75.9%?；谠囼灲M接種地衣芽孢桿菌（2×108 CFU/g，優(yōu)化組）發(fā)酵7 d，與試驗組相比，其香氣物質(zhì)總含量為791.6 μg/g，提高了24.6%；類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量為63.3 μg/g，提高了45.9%；棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量為25.2 μg/g，提高了27.9%。

關(guān)鍵詞：雪茄煙葉；地衣芽孢桿菌；正交優(yōu)化；營養(yǎng)劑；香氣成分

中圖分類號：TS453" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）07-0107-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.07.019 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract：CX-014 cigar leaves as raw materials were used to study the effects of nutrients and Bacillus licheniformis on the aroma components production efficiency and the quality of cigar leaves. The results showed that the nutrient formula obtained by orthogonal optimization experiments was 3.0% glucose， 0.6% glutamate and 0.6% diammonium phosphate. The total content of aroma substances fermented by 7 d with added nutrient （test group） reached 635.2 μg/g， which was 16.4% higher than that of the natural fermentation. The carotenoid transformation products， phenylalanine transformation products and brown reaction products increased by 38.2%， 159.6% and 75.9% compared with natural fermentation， respectively. Then， the test group inoculated with Bacillus licheniformis （2×108 CFU/g， optimized group） had been fermented for 7 days. Compared with the test group， the total content of aroma substances was 791.6 μg/g， which was increased by 24.6%； the content of carotenoid" transformation products （63.3 μg/g） and the brown reaction products" " （25.2 μg/g） was increased by 45.9% and 27.9%， respectively.

Key words：cigar leaves； Bacillus licheniformis； orthogonal optimization； nutrient； aroma components

在適宜溫度和濕度條件下，雪茄煙葉發(fā)酵過程中大分子物質(zhì)分解形成小分子香氣物質(zhì)［1］，如類胡蘿卜素降解產(chǎn)物法尼基丙酮、大馬士酮、巨豆三烯酮等；葉綠素降解產(chǎn)物新植二烯；苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物苯甲醇、苯乙醇、苯乙醛［2］；棕色化反應(yīng)產(chǎn)物糠醛、糠醇等物質(zhì)［3］，從而產(chǎn)生雪茄煙特有的品質(zhì)和風(fēng)味［4］。

微生物的生長代謝貫穿于雪茄煙葉發(fā)酵過程，添加特定微生物可提高煙葉品質(zhì)［5］，如李寧等［6］篩選添加蠟樣芽孢桿菌降低了煙葉含氮化合物含量，減少了刺激性；胡希［7］添加短小芽孢桿菌降低了雪茄煙葉中的青雜氣，香氣更加醇厚飽滿；鄭小嘎等［8］利用真菌制作成菌劑處理煙絲提高了香氣濃度和香氣質(zhì)量。楊培香等［9］將枯草芽孢桿菌添加到煙絲中，提高了煙葉的糖氮比，抽吸口感更加細(xì)膩。

晾曬期雪茄煙葉內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)（如碳水化合物、蛋白質(zhì)等）開始轉(zhuǎn)化［10］，但晾曬后煙葉存在酸堿不平衡等問題，使雪茄吃味辛辣、口感苦澀［11］。另外，其糖氮比低也不利于微生物的生長代謝［12］。而添加適宜的營養(yǎng)劑可以改善這一矛盾，如加入獼猴桃添加劑，可以提高雪茄吃味品質(zhì)、豐富香氣［13］；添加牛奶浸提液提高了類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化效率［14］；噴灑水溶冬青膠加強(qiáng)了雪茄煙葉木香特征［15］；添加菊花浸提液提高了中性香氣物質(zhì)含量，余味醇凈、甜感改善［16］。由于雪茄煙葉發(fā)酵過程成分轉(zhuǎn)化存在復(fù)雜性和不確定性，而添加不同來源的營養(yǎng)物（呈香有機(jī)物質(zhì)提取液等）成分復(fù)雜，何種成分最優(yōu)未知，因而難以保障煙葉發(fā)酵品質(zhì)的穩(wěn)定性。

作為雪茄煙葉表面優(yōu)勢菌群，地衣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種活性酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等。本研究以恩施CX-014雪茄煙葉為原料，通過正交優(yōu)化得到成分簡單、明確的營養(yǎng)劑配方，并接種地衣芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，顯著提高了蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物參與的棕色化反應(yīng)效率，促進(jìn)了雪茄煙葉致香成分或小分子香氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，為中式雪茄煙葉特色發(fā)酵提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）由實驗室保藏（從恩施煙葉表面篩選菌株）；CX-014雪茄煙葉為湖北省煙草科學(xué)研究院提供；葡萄糖、谷氨酸、磷酸氫二銨、氯化鈉、二氯甲烷，國藥集團(tuán)上海有限公司。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，121 ℃滅菌20 min。

儀器：HNHWS-11-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津歐諾儀器股份有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7890GC-5973MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 正交試驗設(shè)計 以葡萄糖、谷氨酸、磷酸氫二銨添加量為優(yōu)化因素，以雪茄煙葉發(fā)酵后揮發(fā)性香氣物質(zhì)及棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量為指標(biāo)，采用三因素四水平正交設(shè)計（表1），確定最佳發(fā)酵營養(yǎng)劑組合。

1.2.2 雪茄煙葉發(fā)酵方法 參考覃明娟等［17］的方法，將晾制完畢的雪茄煙葉回潮至適當(dāng)水分后切絲，按照正交試驗設(shè)計的組別，將不同濃度組合的營養(yǎng)物質(zhì)加入無菌水充分溶解制成營養(yǎng)液，并均勻噴灑在煙絲上，等到水分平衡后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，37 ℃、80% RH發(fā)酵14 d。

1.2.3 雪茄煙葉的地衣芽孢桿菌發(fā)酵 地衣芽孢桿菌液體擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，將培養(yǎng)物經(jīng)過離心、清洗等步驟獲得菌體。將菌體與正交最優(yōu)配方組合混合，加入適量無菌水充分溶解制成接種液，將接種液均勻噴灑在煙絲上，等到水分平衡后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，37 ℃、80% RH進(jìn)行發(fā)酵，5、7、9、11、14 d取樣，接種量2×108 CFU/g。同時考察基礎(chǔ)組接種等量地衣芽孢桿菌對煙葉醇化的影響。

1.2.4 樣品處理 將發(fā)酵結(jié)束后的煙絲烘干，用粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，過篩后的樣品4 ℃密封保存。

1.2.5 煙葉中揮發(fā)性香氣成分提取與測定 稱取10 g磨碎后的煙末置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入飽和食鹽水200 mL，同時將60 mL二氯甲烷置于100 mL圓底燒瓶中，分別連接在SDE裝置左右兩側(cè)。有機(jī)相（二氯甲烷）使用55 ℃水浴加熱，水相使用160 ℃油浴加熱。待同時蒸餾萃取裝置達(dá)到液液分層后，繼續(xù)反應(yīng)5 h，收集萃取液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至2 mL，加入1.202 8 mg/mL乙酸苯乙酯（50 μL）作為內(nèi)標(biāo)。加入無水硫酸鈉干燥后，使用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾后放入Agilent進(jìn)樣瓶備用。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)0.300 7 g于250 mL容量瓶中，使用二氯甲烷定容，4 ℃冷藏備用。

GC條件。色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持2 min，以2 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，然后10 ℃/min升至280 ℃；載氣（He）流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10∶1。

質(zhì)譜條件。電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：35～550 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)為3組平行試驗均值，采用SPSS 26和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用Origin 2019b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果及分析

為提升煙葉香氣整體含量，研究基于雪茄煙葉營養(yǎng)成分特征發(fā)酵對特定香氣產(chǎn)物的影響，按照L16（43）的設(shè)計完成正交試驗，記錄每個組合發(fā)酵14 d萃取后的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量及總致香物質(zhì)含量，結(jié)果見表2?？傁銡馕镔|(zhì)總含量方差分析不顯著，棕色化反應(yīng)產(chǎn)物方差分析結(jié)果見表3。

由表2可知，試驗濃度范圍內(nèi)，影響棕色化反應(yīng)產(chǎn)物與香氣物質(zhì)總含量的3個因素主次順序均為磷酸氫二銨添加量、葡萄糖添加量、谷氨酸添加量，綜合考慮棕色化反應(yīng)產(chǎn)物與香氣物質(zhì)總含量以及添加營養(yǎng)物質(zhì)的成本因素，選取營養(yǎng)劑最優(yōu)組合為A4B1C4（葡萄糖3.0%、谷氨酸0.6%，磷酸氫二銨0.6%），這也驗證了煙葉營養(yǎng)成分種類及含量對雪茄發(fā)酵香氣生成有著重要影響這一論述［18］。由表3可知，磷酸氫二銨添加量與葡萄糖添加量對棕色化反應(yīng)產(chǎn)物具有極顯著影響，而谷氨酸添加量對棕色化反應(yīng)產(chǎn)物具有顯著影響。

正交試驗同時平行進(jìn)行了自然發(fā)酵對照試驗，煙葉自然發(fā)酵與最優(yōu)組合（正交表13號）發(fā)酵14 d后主要4類香氣成分及含量如表4所示。

最優(yōu)組合（正交表13號）發(fā)酵14 d香氣物質(zhì)總含量為451.1 μg/g，較自然發(fā)酵提高了56.1%。其中新植二烯含量最高，達(dá)到了270.1 μg/g，占香氣物質(zhì)總含量的59.9 %。棕色化反應(yīng)產(chǎn)物和類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量分別為6.8 μg/g和32.8 μg/g，分別較自然發(fā)酵提高了21.7倍和36.1%。同時，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與西柏烷類降解產(chǎn)物含量也均比自然發(fā)酵提高了2.1倍和72.8%。

因而確定A4B1C4為優(yōu)化營養(yǎng)劑配方進(jìn)行下一步的雪茄煙葉發(fā)酵試驗。

2.2 添加營養(yǎng)劑（試驗組）及地衣芽孢桿菌（優(yōu)化組）對煙葉發(fā)酵產(chǎn)香的影響

基礎(chǔ)組（不添加營養(yǎng)劑和微生物進(jìn)行發(fā)酵）、試驗組（添加營養(yǎng)劑進(jìn)行發(fā)酵）和優(yōu)化組（添加營養(yǎng)劑和地衣芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵）發(fā)酵14 d過程中，煙葉發(fā)酵后共測得30種香氣物質(zhì)，其中苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3種，棕色化反應(yīng)產(chǎn)物8種，類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物7種，西柏烷類降解產(chǎn)物1種，其他中性致香物質(zhì)11種。香氣成分含量從高到低依次是新植二烯（含量最高，占比45%～60%）、植物醇、茄酮和巨豆三烯酮。

2.2.1 不同處理煙葉發(fā)酵后香氣總含量差異 由圖1可知，發(fā)酵周期內(nèi)各處理組香氣總含量均呈先上升后下降的趨勢?；A(chǔ)組發(fā)酵5 d香氣物質(zhì)總含量為490.8 μg/g，于發(fā)酵7 d達(dá)到峰值（544.9 μg/g，增長11.0%），隨后下降至發(fā)酵14 d的293.3 μg/g，較峰值降低了46.2%。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d香氣總含量分別為510.8 μg/g與538.1 μg/g，高于基礎(chǔ)組4%和10%。兩組香氣總含量也于發(fā)酵7 d達(dá)到峰值，分別為632.5 μg/g和780.9 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了23.8%與45.1%，也比基礎(chǔ)組峰值提高了16.1%與43.3%。

發(fā)酵周期內(nèi)，各處理組香氣物質(zhì)總含量積累與降解變化規(guī)律一致，發(fā)酵7 d（峰值）與發(fā)酵14 d（最低值）均可以真實反映試驗結(jié)果的差異，也可以評價發(fā)酵周期內(nèi)3組試驗對煙葉香氣生成效率的影響。

2.2.2 不同處理煙葉發(fā)酵后對苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的影響 苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（如苯乙醇和苯甲醇）具有花香和甜香［19］，對煙葉的呈香有著重要影響。由圖2可知，各處理組苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量均呈先上升后下降的趨勢。基礎(chǔ)組發(fā)酵5 d苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量為4.6 μg/g，發(fā)酵9 d達(dá)到峰值（9.7 μg/g），增長110.9%，隨后其含量下降至發(fā)酵14 d的3.1 μg/g，較峰值降低了68.0%。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量分別為8.4 μg/g與9.9 μg/g，高于基礎(chǔ)組82.6%和115.2%。不同于基礎(chǔ)組，試驗組與優(yōu)化組含量于發(fā)酵7 d達(dá)到峰值，分別為13.5 μg/g和14.7 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了60.7%與48.5%，也比基礎(chǔ)組峰值提高了39.2%與51.5%。

2.2.3 不同處理煙葉發(fā)酵后對類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的影響 類胡蘿卜素降解產(chǎn)物可提高煙葉中性香氣物質(zhì)的含量［20］，增加煙葉中花香、木香等特征［21］。由圖3可知，各處理組的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量均呈先上升后下降的趨勢?；A(chǔ)組發(fā)酵5 d類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量為19.5 μg/g，發(fā)酵9 d達(dá)到峰值（35.1 μg/g），增長80.0%。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量分別為31.7 μg/g與32.2 μg/g，高于基礎(chǔ)組62.6%和65.1%。不同于基礎(chǔ)組，試驗組與優(yōu)化組含量于發(fā)酵7 d達(dá)到峰值，分別為43.4 μg/g和63.3 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了36.9%與96.6%，其含量為基礎(chǔ)組峰值的1.2倍與1.8倍。

2.2.4 不同處理煙葉對西柏烷類降解產(chǎn)物的影響 西柏烷類降解產(chǎn)物茄酮本身具有甜香，可以使煙氣更加溫和，提升甜感［16］。由圖4可知，各處理組的西柏烷類降解產(chǎn)物含量均呈先上升后下降的趨勢?；A(chǔ)組發(fā)酵5 d西柏烷類降解產(chǎn)物含量為18.1 μg/g，發(fā)酵9 d達(dá)到峰值（24.6 μg/g），增長35.9 %。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d西柏烷類降解產(chǎn)物含量分別為21.3 μg/g與24.4 μg/g，高于基礎(chǔ)組17.7%和34.8%。不同于基礎(chǔ)組，試驗組與優(yōu)化組含量于發(fā)酵7 d達(dá)到峰值，分別為28.2 μg/g和37.9 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了32.4%與55.3%，含量為基礎(chǔ)組峰值的1.1倍與1.5倍。

2.2.5 不同處理煙葉發(fā)酵后對棕色化反應(yīng)產(chǎn)物的影響 棕色化反應(yīng)是煙草中生成香氣物質(zhì)的重要反應(yīng)，主要是由氨基化合物與水溶性糖等化合物之間發(fā)生的非酶棕色化反應(yīng)，可以賦予煙草堅果、焦糖等香氣［4］。由圖5可知，各處理組的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量均呈先上升后下降的趨勢?；A(chǔ)組發(fā)酵5 d棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量為4.3 μg/g，發(fā)酵7 d達(dá)到峰值（11.2 μg/g），增長160.5%。試驗組與優(yōu)化組發(fā)酵5 d棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量分別為7.3 μg/g與8.8 μg/g，高于基礎(chǔ)組69.8%和104.7%。兩組含量也于發(fā)酵7 d達(dá)到峰值，分別為19.7 μg/g和25.2 μg/g，較發(fā)酵5 d時分別增長了169.9%與186.4%，含量為基礎(chǔ)組峰值的1.8倍與2.3倍。

2.3 最佳發(fā)酵周期下各處理組香氣物質(zhì)含量

由上述內(nèi)容可知，試驗組與優(yōu)化組香氣總含量均高于基礎(chǔ)組，且各類香氣物質(zhì)均在7 d達(dá)到峰值，確定試驗條件下最佳醇化周期為7 d。為確定營養(yǎng)劑及地衣芽孢桿菌對雪茄煙葉香氣的影響，在37 ℃、80% RH發(fā)酵7 d并比較了試驗組（基礎(chǔ)組+營養(yǎng)劑）和基礎(chǔ)組+地衣芽孢桿菌發(fā)酵后的香氣含量差異，如表5所示。

由表5可知，基礎(chǔ)組接種地衣芽孢桿菌發(fā)酵后香氣物質(zhì)總含量為628.8 μg/g，較基礎(chǔ)組提高了15.2%。與其他處理組一致，其中含量最高物質(zhì)為新植二烯，含量340.7 μg/g，較基礎(chǔ)組提高了20.9%。同時，基礎(chǔ)組接種地衣芽孢桿菌發(fā)酵后棕色化反應(yīng)產(chǎn)物與苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量為14.2 μg/g與15.6 μg/g，是基礎(chǔ)組含量的1.3倍與3.0倍。類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量與西柏烷類降解產(chǎn)物含量分別為57.6 μg/g與37.9 μg/g，較基礎(chǔ)組分別提高了83.4%與86.7%。

此外，基礎(chǔ)組接種地衣芽孢桿菌發(fā)酵后香氣總含量略低于試驗組（635.2 μg/g）。其苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與西柏烷類降解產(chǎn)物與新植二烯含量較試驗組分別提高了15.6%、32.7%、34.4%、6.3%。但棕色化反應(yīng)產(chǎn)物與植物醇含量較試驗組分別降低了27.9%與23.0%。

基礎(chǔ)組接種地衣芽孢桿菌與試驗組各類香氣物質(zhì)含量均高于基礎(chǔ)組，即添加營養(yǎng)成分與接種微生物均可以提高發(fā)酵后煙葉香氣物質(zhì)的含量。同時，優(yōu)化組中棕色化反應(yīng)產(chǎn)物、類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、新植二烯、植物醇及香氣物質(zhì)總含量明顯優(yōu)于上述兩組，說明營養(yǎng)劑與添加地衣芽孢桿菌的效能有疊加作用，能夠更好地豐富煙葉的香氣量，提高煙葉品質(zhì)。

3 結(jié)論

國產(chǎn)雪茄原料存在理化成分不協(xié)調(diào)（糖氮比低），缺乏濃郁的特征香氣等問題，利用外源物料提升煙葉的品質(zhì)可以在一定程度上彌補(bǔ)以上不足。但外源營養(yǎng)物成分復(fù)雜，影響其提高發(fā)酵品質(zhì)作用的穩(wěn)定性。本研究以雪茄CX-014煙葉為原料，研究了營養(yǎng)劑和接種地衣芽孢桿菌對雪茄香氣成分生成效率和煙葉品質(zhì)的影響。通過正交設(shè)計優(yōu)化得到成分簡單的營養(yǎng)劑配方，添加營養(yǎng)劑后（試驗組）發(fā)酵，香氣物質(zhì)總含量達(dá)到635.2 μg/g，較基礎(chǔ)組提高了16.4%?；谠囼灲M接種地衣芽孢桿菌發(fā)酵，顯著提高了香氣物質(zhì)總含量（791.6 μg/g），較試驗組提高24.6%，香氣成分間更加協(xié)調(diào)，煙葉品質(zhì)得到改善，為中式雪茄發(fā)酵技術(shù)提供了重要參考。

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