水稻發(fā)芽率測(cè)定中污染性微生物的鑒定及多樣性

摘要：為探明可能影響水稻（Oryza sativa L.）種子發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果的污染性微生物種類，對(duì)來自廣東省種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)工作中抽檢的8份水稻種子樣品在萌芽過程中產(chǎn)生的發(fā)霉?fàn)钗廴疚镞M(jìn)行了高通量測(cè)序與微生物種類鑒定。結(jié)果表明，這些樣品在發(fā)芽率測(cè)定試驗(yàn)中所產(chǎn)生的污染性細(xì)菌來自20個(gè)門35個(gè)綱71個(gè)目104個(gè)科208個(gè)屬，其中變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)門類，其平均相對(duì)豐度為63.2%，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）為綱水平上的優(yōu)勢(shì)類群（占48.2%），而梭菌屬（Clostridium，占20.2%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，占18.0%）、腸桿菌屬（Enterobacter，占7.5%）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella，占5.1%）為平均相對(duì)豐度較高的4個(gè)屬；上述水稻種樣品產(chǎn)生的污染性真菌含有7個(gè)門17個(gè)綱37個(gè)目61個(gè)科85個(gè)屬87個(gè)種，其中子囊菌門（Ascomycota）和毛霉門（Mucoromycota）的平均相對(duì)豐度分別為59.0%和18.5%，散囊菌綱（Eurotiomycetes，占42.0%）、毛霉綱（Mucoromycetes，占18.5%）和糞殼菌綱（Sordariomycetes，占12.9%）為平均相對(duì)豐度較高的3個(gè)綱，曲霉屬（Aspergillus，占38.4%）、根霉屬（Rhizopus，占18.5%）和鐮孢菌屬（Fusarium，占9.0%）為含量較高的3個(gè)屬，黃曲霉（Aspergillus flavus，占31.6%）和小孢根霉（R. microsporus，占16.4%）2個(gè)種約占污染性真菌總量的1/2。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）種子；發(fā)芽率測(cè)定；污染性微生物；多樣性；鑒定

中圖分類號(hào)：S511；S432.4" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）07-0051-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.07.009 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： To understand the diversity of contaminative microorganisms that may affect the result of rice （Oryza sativa L.） seed germination rate test， high-throughput sequencing and taxonomic identification for the moldy pollutants produced during the test were carried out on eight rice seed samples collected from the annual seed quality inspection task in Guangdong Province， China. The results showed that a total of 208 genera， 104 families， 71 orders， 35 classes， and 20 phyla of bacteria were identified from the moldy pollutants， with Proteobacteria as the dominating phylum whose average relative abundance was 63.2%， and Gammaproteobacteria as the dominating class （average relative abundance： 48.2%）. Clostridium， Burkholderia， Enterobacter and Klebsiella were the four most abundant bacterial genera whose average relative abundances were 20.2%， 18.0%， 7.5% and 5.1%， respectively. On the other hand， a total of 87 species， 85 genera， 61 families， 37 orders， 17 classes， and 7 phyla of fungi were identified in the aforementioned moldy pollutants. Ascomycota and Mucoromycota represented 59.0% and 18.5%， respectively， of the fungal community. Eurotiomycetes （42.0%）， Mucoromycetes （18.5%） and Sordariomycetes （12.9%） were the three most abundant fungal classes， whereas Aspergillus （38.4%）， Rhizopus （18.5%） and Fusarium （9.0%） were the three most abundant genera. Furthermore， Aspergillus flavus （average relative abundance： 31.6%） and Rhizopus microsporus （average relative abundance： 16.4%） made up near one half of the fungal abundance.

Key words： rice （Oryza sativa L.） seed； germination rate test； contaminative microorganisms； diversity； identification

水稻（Oryza sativa L.）是中國種植面積最廣的糧食作物，為了確保使用優(yōu)良的水稻種子，實(shí)現(xiàn)優(yōu)產(chǎn)、高產(chǎn)，用種前需對(duì)其進(jìn)行種子質(zhì)量檢驗(yàn)。發(fā)芽率是反映種子質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，在種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)工作中是必檢的項(xiàng)目。根據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 發(fā)芽試驗(yàn)》（GB/T 3543.4—1995），水稻種子發(fā)芽率測(cè)定歷時(shí)14 d。在此過程中，常出現(xiàn)受檢種子和/或幼苗因本身攜帶各類病原菌［1，2］或受環(huán)境中的微生物污染而出現(xiàn)發(fā)霉、腐爛的現(xiàn)象，可能對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生較大影響，需重做測(cè)定。探明水稻種子樣品萌芽過程中可能出現(xiàn)的污染性微生物的種類，對(duì)于在發(fā)芽率測(cè)定前對(duì)種子樣品進(jìn)行適宜的預(yù)處理（如消毒、滅菌等），提高種子質(zhì)量檢驗(yàn)的結(jié)果準(zhǔn)確性和工作效率，以及篩選健康種子、預(yù)先避免水稻種傳病害的發(fā)生，均具有參考價(jià)值。本研究挑選廣東省種子質(zhì)量監(jiān)督抽檢的8份水稻種子樣品，采用微生物培養(yǎng)與高通量測(cè)序分析等方法，對(duì)其在發(fā)芽率測(cè)定過程中產(chǎn)生的污染性微生物的種類進(jìn)行了鑒定，以期為水稻種子質(zhì)量控制及種傳病害預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子樣品

供試水稻種子8份，來自2021年廣東省種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中的抽檢樣品，其編號(hào)分別為sd1（華航48號(hào)）、sd2（軟華優(yōu)1179）、sd3（富兩優(yōu)236）、sd4（深優(yōu)9516）、sd5（廣泰優(yōu)華占）、sd6（泰豐優(yōu)208）、sd7（恒豐優(yōu)華占）、sd8（裕優(yōu)9822）。上述種子樣品均來自市售的小包裝（每包500 g）商品，包裝完好，種子無包衣，開始本試驗(yàn)時(shí)保質(zhì)期限均大于6個(gè)月，抽樣后于20 ℃下干燥保存。

1.2 種子萌發(fā)及污染性微生物樣品采集

對(duì)上述種子樣品按照農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程（GB/T 3543—1995）中的要求進(jìn)行凈種子分離和發(fā)芽率試驗(yàn)。對(duì)每份樣品隨機(jī)選取400粒凈種子（100?！?個(gè)重復(fù)），置于1張濕潤的濾紙上，放入發(fā)芽盒中，在光照培養(yǎng)箱（30 ℃，12 h光照∶12 h黑暗）內(nèi)保濕培養(yǎng)14 d后，按GB/T 3543.4—1995中的方法測(cè)定發(fā)芽率（正常幼苗數(shù)/置床種子總數(shù)×100%），并觀察幼苗的污染情況。萌芽結(jié)束后，在生物安全柜中用滅過菌的金屬樣品勺將發(fā)芽盒中幼苗根部和/或發(fā)芽紙上出現(xiàn)的發(fā)霉樣污染物刮下，每份種子樣品（4個(gè)發(fā)芽盒）中的污染物合并溶解于20 mL滅菌雙蒸水中，所得溶液保存于-20 ℃?zhèn)溆?。在本研究中，把sd1～sd8在萌芽過程中產(chǎn)生的污染性微生物分別命名為樣品SD1～SD8。

1.3 污染性微生物種類鑒定

將污染物樣品SD1～SD8經(jīng)干冰運(yùn)輸交由南京派森諾基因科技有限公司進(jìn)行總DNA提取、PCR 擴(kuò)增與高通量測(cè)序。采用FastDNA Spin Kit for Soil 試劑盒（美國MP Biomedicals）對(duì)污染性微生物菌液進(jìn)行總DNA提取，并以NanoDrop 2000型分光光度計(jì)進(jìn)行純度與濃度檢測(cè)。以所得總DNA為模板，采用真菌ITS1區(qū)通用引物5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′與 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′對(duì)樣品中所含的真菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)通用引物5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′與5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′（H=A/C/T，V=A/C/G，W=A/T）對(duì)樣品中所含的細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增。所得擴(kuò)增產(chǎn)物按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫建庫并經(jīng)Illumina Miseq/Hiseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序完成后，所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)去除接頭及引物序列、paired-end序列拼接，再按barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分各樣品的測(cè)序結(jié)果，最后對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣品的有效測(cè)序數(shù)據(jù)。采用Usearch軟件（http：//drive5.com/usearch/manual/）剔除重復(fù)序列，按相似性≥97%的非重復(fù)序列為一個(gè) OTU（Operational taxonomic units）對(duì)所有非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類，獲得各個(gè)OTU的代表序列。通過GenBank BLAST比對(duì)，按相似度gt;90%且coveragegt;90%的標(biāo)準(zhǔn)篩選用于后續(xù)分類的OTU序列（不滿足該條件的序列被歸為“unclassified”），再采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，鑒別每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息。細(xì)菌16S rDNA片段采用RDP classifier比對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫，真菌ITS片段序列使用Blast比對(duì)UNITE數(shù)據(jù)庫，最終分別在門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）等分類階元上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。采用Mothur軟件計(jì)算各樣品中微生物群體的豐富度指數(shù)（Chao1和ACE）、多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）及測(cè)序文庫覆蓋率（Coverage）。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子樣品的發(fā)芽率及污染率

置床培養(yǎng)14 d后，樣品sd1～sd8的發(fā)芽率為77%～89%，其中2個(gè)樣品（sd3為79%，sd6為77%）發(fā)芽率低于GB 4401.1—1996中規(guī)定的國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（80%），但在使用容許誤差（5%）下可判定為合格。8個(gè)樣品的發(fā)霉率為5%～13%，表現(xiàn)為死種子或腐爛幼苗，表明污染性微生物可對(duì)部分水稻種子樣品的發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大影響。

2.2 污染性細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)

經(jīng)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列優(yōu)化和OTU聚類，從8份水稻種子萌芽過程中產(chǎn)生的污染性微生物樣品（SD1～SD8）中獲得83 282～129 765條細(xì)菌DNA序列，合為717～1 517個(gè)OTU，8個(gè)樣品共獲得5 352個(gè)不同的細(xì)菌OTU（表1）。采用RDP classifier對(duì)這些OTU進(jìn)行分類學(xué)分析，結(jié)果表明，8個(gè)樣品所含有的分類地位明確的細(xì)菌共來自20個(gè)門35個(gè)綱71個(gè)目104個(gè)科208個(gè)屬（表1）。根據(jù)Shannon指數(shù)的計(jì)算結(jié)果，SD4的細(xì)菌群體多樣性最高，SD5的多樣性最低；根據(jù)Chao1及ACE指數(shù)的計(jì)算結(jié)果，SD4的細(xì)菌群落豐富度最高，SD1次之，SD5和SD7的群落豐富度較低，與群體多樣性的比較結(jié)果基本一致（表1）。從群落豐富度最高的樣品SD4中鑒定到明確的門、綱、目、科的數(shù)量并非最多（但鑒定到的明確屬數(shù)量最多），群落豐富度最低的樣品SD5中含有的明確門、綱、目、科、屬數(shù)量也均非最少（表1）。

在8個(gè)樣品（SD1～SD8）中平均相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌有4個(gè)門，分別為變形菌門（Proteobacteria，占63.2%）、厚壁菌門（Firmicutes，占25.2%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，占8.0%）和放線菌門（Actinobacteria，占1.8%）（圖1），其中在SD8中變形菌門占79.3%。在綱水平上，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）在8個(gè)樣品中均為優(yōu)勢(shì)類群（占38.6%～57.6%），α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）在SD3和SD8中（分別占18.8%和21.6%）、梭菌綱（Clostridia）在其他6個(gè)樣品中（占13.4%～41.7%）為相對(duì)豐度次高的類群。在目水平上，β-變形菌目（Betaproteobacteriales）和梭菌目（Clostridiales）各自在4個(gè)樣品中為優(yōu)勢(shì)類群，腸桿菌目（Enterobacteriales）在5個(gè)樣品中為相對(duì)豐度次高的類群，這3個(gè)目的相對(duì)豐度合計(jì)約占細(xì)菌總量的2/3。在科水平上，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）和腸桿菌科（Enterobacteriaceae）依次為平均相對(duì)豐度最高的3個(gè)類群，合計(jì)約占細(xì)菌總量的2/3。在屬水平上，梭菌屬（Clostridium）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）依次為平均相對(duì)豐度排名前4的4個(gè)類群（占5.1%～20.2%），合計(jì)占細(xì)菌總量的1/2以上（圖1）。

2.3 污染性真菌的群落結(jié)構(gòu)

基于測(cè)序結(jié)果的OTU聚類顯示，從8份水稻種子污染物樣品（SD1～SD8）中分別獲得114 758～129 029條真菌DNA序列，合為24～245個(gè)OTU，8個(gè)樣品共獲得355個(gè)不同的真菌OTU。采用RDP classifier對(duì)這些OTU進(jìn)行分類學(xué)分析，結(jié)果表明，8個(gè)樣品所含有的分類地位明確的真菌共來自7個(gè)門17個(gè)綱37個(gè)目61個(gè)科85個(gè)屬87個(gè)種（表1）。根據(jù)Shannon指數(shù)的計(jì)算結(jié)果，SD1的真菌群體多樣性最高，遠(yuǎn)高于其他7個(gè)樣品，SD2和SD6的多樣性較低；根據(jù)Chao1及ACE指數(shù)的計(jì)算結(jié)果，SD1的真菌群落豐富度最高，遠(yuǎn)高于其他7個(gè)樣品，SD6的真菌群落豐富度最低；從樣品SD1中鑒定到明確的各級(jí)分類階元的數(shù)量也最多（表1）。

在樣品SD1～SD8中平均相對(duì)豐度大于1%的3個(gè)真菌門為子囊菌門（Ascomycota，占59.0%）、毛霉門（Mucoromycota，占18.5%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota，占1.6%）（圖2），其中子囊菌門在SD5和SD6中占比高達(dá)94.4%和96.8%。在綱、目水平上，散囊菌綱（Eurotiomycetes）及其下屬惟一的散囊菌目（Eurotiales）在SD2、SD5和SD6中占比高達(dá)74.0%～83.0%，在SD7中也是優(yōu)勢(shì)類群（占47.0%）；毛霉綱（Mucoromycetes）下惟一的目類毛霉目（Mucorales）在SD4中占66.0%，在SD3和SD8中亦為優(yōu)勢(shì)類群（分別占37.0%、18.0%）；糞殼菌綱（Sordariomycetes）及其下屬的肉座菌目（Hypocreales）為SD1中的優(yōu)勢(shì)類群，分別占12.9%和13.2%。在目以下，散囊菌目下的曲霉科（Aspergillaceae，平均占40.7%）、曲霉屬（Aspergillus，平均占38.4%）、黃曲霉（Aspergillus flavus，平均占31.6%）為優(yōu)勢(shì)類群或種類；毛霉目下的根霉科（Rhizopodaceae，平均占18.5%）、根霉屬（Rhizopus，平均占18.5%）以及后者下屬的小孢根霉（Rhizopus microsporus，平均占16.4%）為優(yōu)勢(shì)類群或種類；肉座菌目下的叢赤殼科（Nectriaceae）、鐮孢菌屬（Fusarium）平均相對(duì)豐度分別為9.3%和9.0%，為優(yōu)勢(shì)類群（圖2）。

3 討論

本研究對(duì)8份市售水稻種子樣品在發(fā)芽率測(cè)定過程中產(chǎn)生的污染性真菌與細(xì)菌群體進(jìn)行了分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了來自20個(gè)門208個(gè)屬的細(xì)菌以及來自7個(gè)門85個(gè)屬的至少87種真菌，表明水稻種子上的污染性微生物具有豐富的多樣性。農(nóng)作物種子的污染性微生物有多種鑒定方法，如保濕培養(yǎng)后對(duì)長出的菌體進(jìn)行鏡檢［2］，將種子洗滌液置于真菌、細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)［1］、PCR或免疫學(xué)檢測(cè)等［3］。這些方法都難以對(duì)種子所攜帶的微生物種類“能檢盡檢”，尤其是豐度較低的種類。本研究首次對(duì)水稻種子和幼苗周圍產(chǎn)生的發(fā)霉?fàn)钗廴疚镞M(jìn)行了高通量測(cè)序，可充分揭示水稻種子所攜帶微生物群體的多樣性，較之前的研究中僅鑒定到數(shù)量較少的微生物種類［4-6］，本研究所得結(jié)果豐富了該方面的成果。此外，本研究鑒定了水稻種子在長達(dá)14 d（從萌發(fā)與幼苗期）的發(fā)芽率測(cè)定過程中產(chǎn)生的污染性微生物，而非僅鑒定種子初始（萌發(fā)前）的污染性微生物，對(duì)探明影響水稻種子發(fā)芽率結(jié)果的因素以及種子檢驗(yàn)制訂質(zhì)控措施更具參考意義。本研究結(jié)果表明，微生物污染有可能影響水稻種子發(fā)芽率的合格性判定，而在測(cè)定試驗(yàn)前先對(duì)種子進(jìn)行消毒能殺滅哪些污染性微生物，對(duì)發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果有何影響，有待進(jìn)一步研究。

本研究從水稻種子污染物中鑒定到梭菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬等細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群。其中梭菌屬為一大厭氧革蘭氏陽性細(xì)菌類群，廣泛分布于自然界，主要存在于土壤、污水和人畜腸道中，有些種類可產(chǎn)生毒素，能引致人或家畜疾病［7，8］。伯克氏菌屬有少數(shù)種可引起人或動(dòng)物鼻疽病，有些種是植物病原物（其中Burkholderia glumae可引致水稻細(xì)菌性穗枯病）或內(nèi)生菌，還有部分種類是有助于植物吸收營養(yǎng)、促進(jìn)生長及拮抗病害的益生菌［9，10］。腸桿菌屬有多個(gè)種可引致植物病害［11］，但也有一些種類可提高植物抗逆性并修復(fù)重金屬污染的土壤［12，13］。克雷伯氏菌屬細(xì)菌廣泛存在于環(huán)境中，可寄生于人和動(dòng)物的上呼吸道和胃腸道，或在植物、土壤和地表水等中生存，有些種類可作為固氮菌促進(jìn)植物生長，有些種類則是食源性致病菌；該屬的模式種肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）既可污染蔬菜、食物并引致人類肺炎及消化道疾病等，也可在玉米、香蕉、高粱等多種農(nóng)作物上引致病害［14，15］；此外也有該屬細(xì)菌幫助植物提高抗逆性的報(bào)道［16］。由于根據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列難以準(zhǔn)確鑒定到種，所以尚不明確本研究中水稻種子可能攜帶的上述各屬細(xì)菌是否為水稻病原菌，但對(duì)種子消毒處理可防止?jié)撛谒静『Φ膫鞑ァ?/p>

本研究從水稻種子污染物中鑒定到曲霉屬、根霉屬和鐮孢菌屬等真菌優(yōu)勢(shì)類群，黃曲霉和小孢根霉這2個(gè)優(yōu)勢(shì)種，其相對(duì)豐度分別為31.6%和16.4%；此外還檢出黑曲霉（Aspergillus niger）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）、草酸青霉（Penicillium oxalicum）、新月彎孢霉（Curvularia lunata）等種，其平均相對(duì)豐度為2.1%～3.1%。由黃曲霉產(chǎn)生的黃曲霉素是糧油作物及制品上常見的強(qiáng)致癌性毒素，黑曲霉是儲(chǔ)藏稻谷中的優(yōu)勢(shì)菌群，其部分株系可產(chǎn)生有害人體健康的赭曲霉毒素A［17，18］；小孢根霉、少根根霉（又稱稻根霉，Rhizopus oryzea）等根霉屬種類廣泛存在于土壤、植物葉脈或食品中，可引致水稻立枯病、玉米根腐病、向日葵爛盤型菌核病等［19-21］；草酸青霉對(duì)馬鈴薯霜霉菌、蘋果鐮孢菌等具有拮抗作用［22，23］；新月彎孢霉可侵染水稻、玉米、小麥等多種作物，可在水稻上引致葉斑?。?4，25］。本研究鑒定到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌及真菌類群中既有植物病原菌也有益生/生防菌，研究它們?cè)谔镩g生境中的共存與互作將有助于深入了解相關(guān)植物病害的流行規(guī)律，為病害防治提供有益參考。

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