白果種仁正丁醇萃取部位的化學(xué)成分研究

摘" " " 要：目的：對白果種仁的正丁醇部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究。方法：采用大孔樹脂、MCI、Sephadex-LH凝膠，制備色譜等多種色譜相結(jié)合的方法，對白果正丁醇層萃取物進(jìn)行分離純化，通過多種波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果：從白果的正丁醇層萃取物部位分離并鑒定了6個單體化合物，分別為，adenine （1），adenosine （2），Ginkgolide B （3），Ginkgolide C （4），MPN （5）， MPN-5′-glu （6）。

關(guān)" 鍵" 詞：白果種仁；化學(xué)成分；色譜分離

中圖分類號：TQ201" " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A" " "文章編號： 1004-0935（2023）06-0798-04

白果，為銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥成熟種子，又名銀杏果、鴨腳掌、靈眼等。白果是一味傳統(tǒng)中藥，并被收錄于2020版《中國藥典》，其傳統(tǒng)功效為斂肺定喘、止帶縮尿[1]。白果同時也是藥食兩用中藥，是民間藥膳的常用食品，其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，并具有美容養(yǎng)顏的功效。因此，白果也被國家衛(wèi)計(jì)委規(guī)定為“藥食兩用”中藥。

研究表明，白果中主要含有銀杏酚類[2-3]、銀杏萜內(nèi)酯類[4]、黃酮類[5]、苯丙素和木脂素糖苷[6]類化合物。

由于白果具有的傳統(tǒng)中藥功效的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。為了更深入闡明白果種仁的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對白果的正丁醇部位進(jìn)行了系統(tǒng)分離研究，并從中分離并鑒定出6個單體化合物，分別為 adenine （1），adenosine （2），Ginkgolide B （3），Ginkgolide C （4），MPN （5）， MPN-5′-glu （6）。

1" 儀器與材料

Bruker AVANCE-III（500 MHz）型核磁共振波譜儀；TU-1901 型紫外可見分光光度計(jì)；紫外分光光度計(jì)UV-2450 UV/VIS （Bruker， Germany）；自動旋光測定儀JASCO P-1020 （Tokyo， Japan）；島津 LC-20A型高效液相色譜儀（島津，日本）；MCI gel CHP20P（75～150 μm，三菱化學(xué)有限公司，日本）；凝膠 Sephadex LH-20（25～100 μm，通用電器醫(yī)療集團(tuán)，美國）；乙腈、甲醇（Dikma 公司，色譜級，美國）；柱色譜用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇為江蘇漢邦科技有限公司。白果種仁，購自江蘇徐州，由中國藥科大學(xué)生藥學(xué)教研室張勉教授鑒定，藥材標(biāo)本（No.2014-GGL）存放于中國藥科大學(xué)。

2" 提取與分離

稱取白果種仁5 kg，以適量95％乙醇超聲提取3次，3 h/次，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干浸膏（200 g），并加水混懸。將混懸液依次用石油醚、正丁醇分別萃取2～3次，將各溶劑層萃取液合并，回收溶劑，濃縮至浸膏狀，真空干燥后得正丁醇層84 g。取正丁醇萃取部位，采用大孔樹脂進(jìn)行不同濃度乙醇（20%、40%、60%、80%乙醇）的梯度洗脫。選取20%乙醇部位進(jìn)行MCI柱色譜進(jìn)行下一步分離。MCI柱色譜分離選用不同濃度的甲醇（20%、40%、80%甲醇）分別進(jìn)行洗脫，得到20%甲醇部位產(chǎn)物Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4和Fr.5共5個餾分。將Fr.2餾分進(jìn)行凝膠柱色譜的分離，再結(jié)合制備液相20%甲醇等度洗脫得到化合物1 （3 mg）和化合物2 （4 mg）。將Fr.3餾分進(jìn)行凝膠柱色譜的分離，直接析出晶體化合物3（5 mg）和化合物4 （6 mg）。將Fr.4餾分進(jìn)行凝膠柱色譜的分離，再結(jié)合制備液相25%甲醇等度洗脫得到化合物5 （20 mg）和再結(jié)合制備液相25%甲醇等度洗脫得到化合物5 （20 mg）和化合物6 （10 mg）。

3" 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針晶，碘化鉍鉀反應(yīng)顯陽性，ESI-MS顯示m/z：134 [M-H]-，顯示該化合物的分子量為 135， 1H NMR （500 MHz， DMSO-d6）， δH 8.10 （1H， s， H-8）， 8.08 （1H， s， H-2）， 7.08 （1H， s， NH2）。

1H NMR譜中有一組嘌呤雜環(huán)上的質(zhì)子信號δH 8.10 （1H， s， H-8），8.08 （1H， s， H-2），7.08 （1H， s， NH2），并通過對照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[7]，鑒定該化合物1為腺嘌呤（adenine），化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

化合物2：白色結(jié)晶性粉末，易溶于二甲基亞砜；ESI-MS m/z： 268 [M+H]+，提示分子量為267。1H-NMR （DMSO-d6， 500 MHz）：δH 8.34 （1H， s， H-2），8.13 （1H， s， H-8），7.33 （2H， s， NH2），5.87 （1H， d， J = 6.2 Hz， H-1′），5.42 （2H， m， 2′，5′-OH），5.17 （1H， d， J = 4.6 Hz， 3′-OH），4.61 （1H， dd， J =11.3， 6.0 Hz， H-2′），4.14 （1H， dd， J = 7.7， 4.6 Hz， H-3′），3.96 （1H， q， J = 3.3 Hz， H-4′），3.67 （1H， m， 5′-Ha），3.55 （1H， m， 5′-Hb）。

1H-NMR 譜中顯示 δH 8.34 （1H， s， H-2）， 8.13 （1H， s， H-8）， 7.33 （2H， s， NH2）， 推測為嘌呤雜環(huán)上的質(zhì)子信號， δH 5.87 （1H， d， J = 6.2 Hz， H-1′），5.42 （2H， m， 2′，5′-OH），5.17 （1H， d， J = 4.6 Hz， 3′-OH），4.61 （1H， dd， J = 11.3， 6.0 Hz， H-2′），4.14 （1H， dd，J = 7.7， 4.6 Hz， H-3′），3.96 （1H， q， J = 3.3 Hz H-4′），3.67 （1H， m， 5′-Ha），3.55 （1H， m， 5′-Hb）為一組核糖氫質(zhì)子信號。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[7]，故鑒定化合物2為腺苷（adenosine），其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

化合物3：白色針晶，易溶于丙酮、乙酸乙酯，難溶于水，硫酸不顯色，碘顯黃色；1H-NMR （DMSO-d6， 500 MHz）：δH 7.45 （1H， br d， 10-OH），6.45 （1H， s， 3-OH）， 6.07 （1H， s， H-12）， 5.31 （1H， d， J = 3.9 Hz， H-6）， 5.03 （1H， br s， H-10 ）， 4.64 （1H， d， J = 7.4 Hz， H-2）， 4.05 （1H， br d， H-1β）， 2.85 （1H， qua， J = 7.0 Hz ，H-14）， 2.14 （1H， dd， J =13.6， 4.6 Hz， H-7β），1.94 （1H， m， H-7α），1.73 （1H， dd， J = 14.2， 4.5 Hz， H-8）， 1.11 （3H， d， J= 7.0 Hz， H-16）， 1.03 （9H， s， H-18～20）。

ESI-MS 顯示m/z：423 [M-H]-，提示化合物3的分子量為424。1H NMR氫質(zhì)子信號 δH 1.03 （9H， s， H-18～20），提示可能有銀杏內(nèi)酯的特征基團(tuán)叔丁基。一個甲基質(zhì)子信號 δH 1.11 （3H， d， J = 7.0 Hz， H-16）， δH 7.45 （1H， br d，10-OH），6.45 （1H， s， 3-OH）提示為兩個羥基質(zhì)子信號；δH 6.07 （1H， s， H-12）， 5.31 （1H， d， J = 3.9 Hz， H-6）， 5.03 （1H， br s， H-10 ）， 4.64 （1H， d， J = 7.4 Hz， H-2）， 4.05 （1H， br d， H-1β） 提示為三個內(nèi)酯環(huán)的氫質(zhì)子信號。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]基本一致，故鑒定化合物3為銀杏內(nèi)酯B （Ginkgolide B），其結(jié)構(gòu)如圖3所示。

化合物4： 白色針晶，易溶于丙酮、乙酸乙酯，難溶于水。硫酸不顯色，碘顯黃色。ESI-MS 顯示m/z：475 [M+Cl]-，提示分子量為440。1H NMR （DMSO-d6， 500 MHz） δH 7.30 （1H， s，10-OH）， 6.60 （1H， s， 3-OH）， 5.80 （1H， s， H-12）， 5.58 （1H， d， J = 4.3 Hz， 7-OH）， 5.11 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-10），4.77 （1H， m， H-6），4.65 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-2），3.76 （1H， m， H-7α），3.47 （1H， q， J = 7.1 Hz，H-14），2.77 （1H， d， J = 12.4 Hz， H-8），1.72 （9H， s， H-18～20）。

1H-NMR 譜中顯示具有銀杏內(nèi)酯特征的叔丁基氫信號 δH 1.72 （9H， s， H-18～20），三個羥基氫信號 δH 7.30 （1H， s， 10-OH），6.60 （1H， s， 3-OH），5.58 （1H， d， J = 4.3 Hz， 7-OH），三個內(nèi)酯環(huán)氫質(zhì)子信號 δH 5.80 （1H， s， H-12），5.11（1H， d， J = 7.8 Hz， H-10），4.77 （1H， m， H-6），4.65 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-2），3.76 （1H， m，H-7α），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]基本一致，故鑒定化合物4為銀杏內(nèi)酯C（Ginkgolide C），其結(jié)構(gòu)如圖4所示。

化合物5：黃色油狀物，易溶于甲醇和二氯甲烷，紫外顯藍(lán)紫色熒光，香草醛濃硫酸顯紫紅色，ESI-MS顯示m/z：184 [M+H]+，提示其分子量為183，推測其可能為含氮的化合物。1H-NMR （500MHz， CD3OD）： δH 2.42 （3H， s， 2-CH3）， 3.44 （3H， s， 4-OCH3）， 4.63 （2H， s， 4-CH2O）， 4.77 （2H， s 5-CH2O）， 7.90 （1H， s，H-6）。

1H NMR 譜中顯示一個甲氧基信號 δH 3.44 （3H， s， 4-OCH3），一個甲基質(zhì)子信號 δH 2.42 （3H， s， 2-CH3），一個連有雜原子N的芳香質(zhì)子信號 δH 7.90 （1H， s， H-6），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]基本一致，故鑒定化合物5為4′-O-甲基吡哆醇（MPN）。

化合物6：黃色油狀物，易溶于甲醇和二氯甲烷，紫外顯藍(lán)紫色熒光，香草醛濃硫酸顯紫紅色，ESI-MS顯示m/z：346 [M+H]+，提示其分子量為345。與化合物 5 相比增加了162的分子量，推測與化合物5 相比，有可能多了一分子葡萄糖。1H NMR （500MHz， CD3OD）： δH 2.43 （3H， s， 2-CH3），3.20～3.69 （4H， m， Glc H-2， H-3， H-4， H-5），3.45 （3H， s， 4-OCH3），4.13 （1H， d， J = 7.8 Hz， Glc H-1），4.68， 4.97 （2H， AB， J = 11.9 Hz， 4-CH2O）， 4.79， 4.82 （2H， AB， J = 12.5， 5-CH2O）。

1H NMR譜中提示含有一個甲氧基質(zhì)子信號δH 3.45 （3H， s， 4-OCH3）和一個甲基質(zhì)子信號δH 2.43 （3H， s， 2-CH3）， δH 4.68， 4.97 （2H， AB， J=11.9 Hz， 4-CH2O）， 4.79， 4.82 （2H， AB， J = 12.5， 5-CH2O）提示含有兩組連氧亞甲基結(jié)構(gòu)片段，以上信息顯示其與化合物5 具有相同的母核結(jié)構(gòu)，δH 4.13 （1H， d， J = 7.8 Hz， Glc H-1）， 3.20～3.69 （6H， m， Glc H-2， H-3， H-4， H-5，H-6）為一組葡萄糖氫信號。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[10]一致，故鑒定化合物 6為 MPN-5′-glu。

4" 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)對白果種仁的正丁醇部位進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從中分離并鑒定了6個化合物，包括2個銀杏內(nèi)酯類化合物，2個腺苷類化合物，2個銀杏毒素類化合物。前期文獻(xiàn)多集中于白果的黃酮類化合物，故本研究豐富了白果種仁的化合物類型，并為后期的活性篩選和藥理研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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Abstract： In order to study the chemical constituents of n-butanol fraction of Ginkgo biloba seeds， macroporous resin， MCI， Sephadex-LH gel， preparative chromatography and other chromatographic methods were used to separate and purify the n-butanol layer extract of Ginkgo biloba seeds. The structure was identified by various spectral data. The results showed that， 6 compounds were isolated and identified as adenine （1）， adenosine （2）， Ginkgolide B （3）， Ginkgolide C （4）， MPN （5）， MPN-5′-glu （6）.

Key words：" Ginkgo biloba seeds; Chemical constituents; Chromatography seperation