?湘7920冬芽組織培養(yǎng)體系的初步建立

摘 要：為了豐富湖南地區(qū)桑樹(shù)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，同時(shí)為桑樹(shù)品種改良與多用途利用提供技術(shù)支持，研究以湘7920桑樹(shù)品種的冬芽為外植體材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，初步建立了湘7920桑樹(shù)品種的組織培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：湘7920冬芽的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA，增殖倍數(shù)為3.05，30 d可使冬芽增長(zhǎng)27 mm；側(cè)芽最佳培養(yǎng)基為MS+ 3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L"IBA，15 d可使側(cè)芽增長(zhǎng)22 mm；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L IBA，根系狀態(tài)良好，生根率為73%，移栽成活率為30%。

關(guān)鍵詞：桑樹(shù)；品種；湘7920；冬芽；組織培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)：S888.327 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2023）02-0012-04

Abstract： This paper aims to enrich elite mulberry （Morus alba） germplasm resources in Hunan Province， laying the technical foundation for mulberry cultivar improvement and multiple uses. The experiment used the winter buds of a mulberry cultivar Xiang 7920 as explants and MS medium as basic medium to establish a tissue culture system. The results showed that the optimal medium for the winter buds of Xiang 7920 was MS + 1.0 mg/L 6-BA， resulting in 3.05 multiple shoots from a single shoot tip， and 27 mm growth of winter buds in 30 d. The optimal medium for the lateral buds was MS + 3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA， bringing the lateral buds a 22 mm growth in 15 d. The optimal medium for root induction was 1/2 MS+0.5 mg/L IBA， leading to a 73% rooting rate and a 30% survival rate after transplanting.

Key words： mulberry （Morus alba）; variety; Xiang 7920; winter bud; tissue culture

湘7920是由湖南省蠶桑研究所選育而成的早熟豐產(chǎn)型桑樹(shù)品種，親本為中桑5801×澧桑24號(hào)，適宜在洞庭湖地區(qū)栽培，產(chǎn)葉量可達(dá)55.4 t/hm2，可作為全齡用桑，尤以小蠶用桑效果較好[1]。作為湖南地區(qū)的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，以湘7920為二倍體母本曾育成的品種有湘桑6號(hào)[2]與嘉陵20號(hào)[3]，這2個(gè)品種都表現(xiàn)出長(zhǎng)勢(shì)旺、產(chǎn)葉量高的特點(diǎn)。除了作為養(yǎng)蠶用桑，湘7920葉片中含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，秋季生物堿總含量平均為3.93 mg/g，1-脫氧野尻霉素（是一種天然生物堿，簡(jiǎn)稱DNJ）平均含量可達(dá)1.992 mg/g[4]，具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

湘7920為單雌品種，目前只能通過(guò)嫁接的方式繁育，限制了其推廣與應(yīng)用。桑樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)的研究發(fā)展已有50 a以上的時(shí)間[5]，利用組織培養(yǎng)方式可以對(duì)優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源進(jìn)行定向改良，例如對(duì)品種進(jìn)行染色體加倍，創(chuàng)制多倍體資源[6]以提高其生產(chǎn)性能，也可利用組織培養(yǎng)的方式對(duì)桑樹(shù)的基因進(jìn)行改造，使其產(chǎn)生新的特性[7]。筆者初步建立了湘7920冬芽組織培養(yǎng)體系，以期為湘7920品種改良與多用途開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021年12月，待桑園冬季剪枝后，在湖南省蠶桑科學(xué)研究所桑園中剪取無(wú)蟲(chóng)害、粗細(xì)一致的湘7920枝條，分成上（枝頭）、下2部分，于5℃保存?zhèn)溆?。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其他供試試劑有75%乙醇、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、3-吲哚丁酸（IBA）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 湘7920冬芽生長(zhǎng)的最佳激素濃度篩選試驗(yàn) 分別取湘7920上、下2部分枝條的冬芽作為外植體，放在流水下沖洗30 min，剝掉冬芽鱗片直至露出真葉，在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇振蕩消毒15 s，隨后用0.1%的氯化汞消毒10 min，再用無(wú)菌水清洗4～5次后，將冬芽接種于MS培養(yǎng)基中。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）2種激素，共設(shè)計(jì)15個(gè)濃度組合。6-BA濃度分別為0、1、3、5、7 mg/L，IAA濃度分別為0、0.1、0.3 mg/L，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每瓶接種3個(gè)芽。培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照時(shí)間為14 h/d。15 d后測(cè)量上、下部枝條各組芽長(zhǎng)，對(duì)比不同部位冬芽生長(zhǎng)的差異；30 d后測(cè)量生長(zhǎng)芽的長(zhǎng)度，比較各處理的冬芽增長(zhǎng)長(zhǎng)度（即：生長(zhǎng)芽最終長(zhǎng)度－冬芽初始長(zhǎng)度），篩選最佳激素配方。

1.2.2 湘7920側(cè)芽生長(zhǎng)的的最佳激素濃度篩選試驗(yàn) 將培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的側(cè)芽切下，統(tǒng)計(jì)側(cè)芽增殖數(shù)，計(jì)算側(cè)芽增殖倍數(shù)（即：側(cè)芽數(shù)/接種芽數(shù)）。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）、3-吲哚丁酸（IBA）2種激素，共設(shè)計(jì)12個(gè)濃度組合。6-BA濃度分別為0、1、3、5 mg/L，IBA濃度分別為0、0.1、0.3 mg/L，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每瓶接種5個(gè)側(cè)芽。15 d后測(cè)量側(cè)芽長(zhǎng)度，比較各處理的側(cè)芽增長(zhǎng)長(zhǎng)度，篩選最佳激素配方。

1.2.3 湘7920組培苗生根的最佳激素濃度篩選試驗(yàn) 冬芽接種30 d后，選擇長(zhǎng)勢(shì)較好并相對(duì)一致的組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基為1/2 MS，添加激素IBA，設(shè)置0、0.5、1 mg/L 3個(gè)濃度，每個(gè)濃度接種15瓶，每瓶接種1個(gè)芽。30 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，獲得最佳激素濃度。揭開(kāi)瓶蓋適應(yīng)性培養(yǎng)3 d后再將培養(yǎng)苗移栽至育苗基質(zhì)中繼續(xù)培管，統(tǒng)計(jì)移栽成活數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA及IAA濃度對(duì)湘7920冬芽生長(zhǎng)的影響

由表1可知，接種15 d后，添加激素組別的湘7920冬芽長(zhǎng)度均大于無(wú)激素添加的對(duì)照組，此外，枝條下部冬芽平均芽長(zhǎng)為4.7 mm，枝條上部（枝頭部位）冬芽平均芽長(zhǎng)為3.3 mm，表明枝條上部冬芽在體外培養(yǎng)條件下不再具有頂端優(yōu)勢(shì)，生長(zhǎng)較枝條下部冬芽生長(zhǎng)慢。因此，下文所描述的冬芽均指枝條下部冬芽。

在冬芽生長(zhǎng)的過(guò)程中，隨著激素濃度的變化，生長(zhǎng)芽表現(xiàn)出了不同的長(zhǎng)勢(shì)（圖1）。整體上，冬芽在IAA 0 mg/L組別的長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于IAA 0.1 mg/L和IAA 0.3"mg/L的組別。從表2可知，在不同激素組合的MS培養(yǎng)基中接種30 d后，湘7920冬芽的增長(zhǎng)長(zhǎng)度為2.3～27.0 mm。其中，冬芽在 6-BA 1.0 mg/L+ IAA 0 mg/L的激素組合中的增長(zhǎng)長(zhǎng)度最長(zhǎng)，平均達(dá)到了27.0 mm，為對(duì)照組（CK，6-BA 0 mg/L+ IAA 0 mg/L）長(zhǎng)度的7.7倍，為適宜湘7920冬芽生長(zhǎng)的最佳激素組合。

2.2 6-BA及IBA濃度對(duì)湘7920側(cè)芽生長(zhǎng)的影響

待冬芽接種30 d后，將生長(zhǎng)芽上的側(cè)芽（圖2）切下接種于MS培養(yǎng)基中，據(jù)統(tǒng)計(jì)，57個(gè)生長(zhǎng)芽共切下了174個(gè)側(cè)芽，增殖倍數(shù)為3.05。從表3可知，在MS培養(yǎng)基中接種15 d后，側(cè)芽增長(zhǎng)長(zhǎng)度為11.0～22.1 mm。隨著6-BA濃度的增加，側(cè)芽的生長(zhǎng)出現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。側(cè)芽在6-BA 3.0 mg/L+ IBA 0.3 mg/L的激素組合中的增長(zhǎng)長(zhǎng)度最長(zhǎng)，平均為22.1 mm，為對(duì)照組（CK）6-BA 0 mg/L+ IBA 0 mg/L長(zhǎng)度的1.65倍。6-BA 3.0 mg/L+ IBA 0.3 mg/L為適宜湘7920側(cè)芽生長(zhǎng)的激素組合。

2.3 IBA濃度對(duì)湘7920組培苗生根的影響

冬芽在MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)一個(gè)月后，將其轉(zhuǎn)入1/2 MS生根培養(yǎng)基中。第16 天時(shí)可從切口處觀察到白色的幼根。添加不同IBA濃度的組別，外植體生根率有所不同（表4），總的來(lái)看，以IBA 0.5 mg/L的處理生根率最高，其次是IBA 1.0 mg/L的處理，不添加TBA激素的處理生根率最低；其中，IBA 0.5 mg/L、IBA 1.0 mg/L組別的生根率分別比對(duì)照高38%和13%。移栽一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)，組培苗成活率為30%（圖3）。

3 結(jié)論與討論

表5中列出了已報(bào)道的桑樹(shù)組培體系。與文獻(xiàn)中的不同，筆者的研究采用易于測(cè)量的生長(zhǎng)芽長(zhǎng)度作為篩選最佳激素組合的指標(biāo)，得到的7920冬芽生長(zhǎng)最佳激素配方分別為MS+1.0 mg/L 6-BA，與文獻(xiàn)中蒙桑、滇桑的冬芽、側(cè)芽培養(yǎng)基配方一致，均為單一的激素配方；湘7920冬芽增殖倍數(shù)為3.05，與四季果桑的增殖系數(shù)最接近，高于藥桑、滇桑、川桑等品種的增殖系數(shù)；篩選出湘7920生長(zhǎng)芽生根最佳激素配方為1/2MS+0.5 mg/L IBA，與文獻(xiàn)中的農(nóng)桑的生長(zhǎng)芽生根培養(yǎng)基配方一致，但其生根率（73%）較農(nóng)桑低，高于川桑、滇桑、雞爪桑等品種；生根后，湘7920移栽成活率僅為30%，低于所列文獻(xiàn)中桑樹(shù)品種的移栽成活率。

冬芽的培養(yǎng)基大多為MS與2種激素的組合，筆者的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，湘7920冬芽在MS培養(yǎng)基只含有1.0 mg/L 6-BA的條件下長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)，在不斷增加的6-BA濃度組別中，冬芽的增長(zhǎng)長(zhǎng)度呈現(xiàn)出了先增后減的趨勢(shì)，表明只有適量的激素才能促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果還表明，側(cè)芽在3.0 mg/L 6-BA+"0.3 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)較好，表明湘7920生長(zhǎng)芽自身產(chǎn)生的生長(zhǎng)激素含量有限，需要額外添加IAA促進(jìn)生長(zhǎng)，而湘7920冬芽外植體在生長(zhǎng)過(guò)程中不需要額外添加IAA，可能是其母株自身含有的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響。植物頂端形成的生長(zhǎng)激素由上至下運(yùn)輸，頂端低濃度的生長(zhǎng)激素促進(jìn)頂端芽的萌發(fā)，生長(zhǎng)芽又不斷產(chǎn)生新的生長(zhǎng)激素向下運(yùn)輸，所以下端不斷積累的生長(zhǎng)素濃度抑制了芽的生長(zhǎng)[18]。因?yàn)橹l不同部位生長(zhǎng)激素分布的濃度不一致，所以枝條不同部位的冬芽外植體的生長(zhǎng)表現(xiàn)不一致。由于下部冬芽外植體中本身含有生長(zhǎng)激素，額外再添加生長(zhǎng)激素反而抑制了其生長(zhǎng)，因此湘7920冬芽在MS培養(yǎng)基只含有1.0 mg/L 6-BA而不含有生長(zhǎng)激素的條件下長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)最好。

通過(guò)試驗(yàn)，初步建立了湘7920冬芽組織培養(yǎng)體系，但試驗(yàn)中湘7920的移栽成活率僅為30%，煉苗及移栽技術(shù)有待提高，還需不斷摸索，完善湘7920冬芽的組織培養(yǎng)體系，為之后的品種改良及多用途的利用奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)，并創(chuàng)制豐富的育種材料。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇科技大學(xué). 中國(guó)桑樹(shù)栽培學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2020.

[2] 李章寶，唐匯清，唐翠明，等. 人工三倍體桑樹(shù)新品種湘桑6號(hào)的育成[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2007，33（3）：341-344.

[3] 余茂德，敬成俊，吳存容，等. 人工三倍體桑樹(shù)新品種嘉陵20號(hào)的選育[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2004，30（3）：225-229.

[4] 張 俊，顏新培，李一平，等. 湖南省主栽桑品種桑葉生物堿含量的測(cè)定分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2018，44（6）：916-922.

[5] THOMAS TD. Advances in mulberry tissue culture[J]. Journal of Plant Biology，2002，45（1）：7-21.

[6] 李鎮(zhèn)剛，冉瑞法，劉淑娟，等. 人工四倍體桑樹(shù)新品種云桑6號(hào)的選育[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2020，46（3）：286-294.

[7] UMATE P. Mulberry improvements via plastid transformation and tissue culture engineering[J]. Plant Signaling amp; Behavior，2010，5（7）：785-787.

[8] 彭芳芳，李勛蘭，魏召新，等. 果桑離體冬芽組培快繁和枝條扦插快繁體系的建立[J]. 分子植物育種，2021，19（22）：7547-7555.

[9] 孟鈺程. 蒙桑種質(zhì)資源多倍體誘導(dǎo)及加倍川?？剐缘某醪皆u(píng)價(jià)[D]. 重慶：西南大學(xué)，2019.

[10] 植 爽，任艷紅，唐 星，等. 四倍體果桑嘉陵30號(hào)再生植株的研究[J]. 蠶學(xué)通訊，2018，38（1）：1-9.

[11] 李曉雙，王 青，孟鈺程，等. 野生長(zhǎng)穗桑種質(zhì)資源云7的多倍體誘導(dǎo)和鑒定[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2017，43（3）：369-373.

[12] 李鎮(zhèn)剛，冉瑞法，劉淑娟，等. 利用扦插和組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖特異種質(zhì)資源滇桑（Morus yunnanensis koidz.）[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2016，42（2）：196-202.

[13] 黃 科，唐 婧，劉自震，等. 生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)桑樹(shù)離體繁育的影響[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，37（3）：28-34.

[14] 魏 佳，朱 燕，林天寶，等. 適合4種特殊桑種質(zhì)資源無(wú)菌幼苗莖段繼代和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基篩選[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2015，41（3）：417-422.

[15] 朱 宏. 桑樹(shù)離體培養(yǎng)與多倍體誘導(dǎo)研究[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2014.

[16] 王 琳. 利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁育桑樹(shù)無(wú)毒苗[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇科技大學(xué)，2013.

[17] 王茜齡. 桑樹(shù)多倍體育種材料誘變創(chuàng)制及優(yōu)系選育研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2009.

[18] CLINE M G. The role of hormones in apical dominance. New approaches to an old problem in plant development[J]. Physiologia Plantarum，1994，90（1）：230-237.

（責(zé)任編輯：張煥裕）