一株發(fā)酵乳糖不產(chǎn)氣大腸埃希氏菌的分離與鑒定

摘 要：為了準(zhǔn)確鑒定1株分離自餐飲具的大腸埃希氏菌非典型菌株（發(fā)酵乳糖不產(chǎn)氣），通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、常規(guī)生化試驗、微生物鑒定、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）、多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（multi-PCR）的方法對該菌株進(jìn)行聯(lián)合鑒定。結(jié)果表明：該菌株乳糖發(fā)酵試驗及伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）平板上的菌落形態(tài)均有別于典型大腸埃希氏菌，但微生物鑒定、MALDI-TOF MS、多重PCR鑒定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株一致，均顯示為大腸埃希氏菌。這說明常規(guī)方法檢驗非典型大腸埃希氏菌有誤判風(fēng)險，建議檢驗者遇初發(fā)酵培養(yǎng)物變渾濁時轉(zhuǎn)接EMB瓊脂平板，并輔以微生物自動鑒定儀器或分子生物學(xué)方法對可疑菌落進(jìn)行鑒定，以確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：大腸埃希氏菌；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜；多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

中圖分類號：Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）02-0007-05

Abstract： To accurately identify an atypical Escherichia coli （fermenting lactose without gas production） from catering utensils， traditional isolation and culture， routine biochemical experiments， microbial identification system， matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）， and multiple polymerase chain reaction （multi-PCR） have been jointly used. The results of lactose fermentation experiment and colony morphology of the anaerogenic strain on the eosin-methylene blue agar （EMB） plate have showed its difference from the typical Escherichia coli; however， the results of microbial identification system， MALDI-TOF MS and multi-PCR have consistently confirmed that it is an Escherichia coli. That means the routine method for inspecting atypical Escherichia coli has a risk of misidentification. It is recommended to transfer the primary fermentation culture substance to EMB agar plates when it is becoming turbid， and to supplement the automatic identification system or molecular biology method for the identification of suspicious colonies， ensuring the accuracy of inspection results.

Key words： Escherichia coli; MALDI-TOF MS; multi-PCR

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗（鑒定腸桿菌科細(xì)菌的一組生化試驗的簡稱，包括吲哚、甲基紅、伏-波二氏和檸檬酸鹽4種試驗）顯示其為革蘭氏陰性無芽孢桿菌[1]，普遍存在于人和動物腸道中，并隨宿主糞便排至環(huán)境中，可作為判斷水或食品有無被糞便污染的衛(wèi)生指標(biāo)菌[2-3]。正常情況下，大腸埃希氏菌對宿主不致病，當(dāng)宿主免疫力降低或細(xì)菌侵入腸道以外部位時，可引起感染者產(chǎn)生腹瀉、腹痛，嚴(yán)重者甚至引起菌血癥、敗血癥、肺炎、腦膜炎等臨床癥狀[4]?？芍赂腥菊弋a(chǎn)生以腹瀉為主要癥狀的大腸埃希氏菌被稱為致瀉大腸埃希氏菌（Diarrhe-

ogenic Escherichia coli，DEC）[5]。2012—2015年我國21個省報告的46 721例腹瀉檢測病例中DEC總檢出率為7.7%，2015—2019年北京市采集的27 619例腹瀉病例中DEC檢出率達(dá)9%，2018—2019年江蘇省收集的24 292例食源性疾病患者中DEC檢出率達(dá)2.48%[6-8]。此外，大腸埃希氏菌作為條件致病菌，易引發(fā)泌尿道、呼吸道等部位的感染，是臨床感染中最為常見的病原菌之一[9-10]。由此可知，大腸埃希氏菌感染的防控需引起重視。

根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.38—2012，大腸埃希氏菌在44.5℃條件下培養(yǎng)能分解EC肉湯中的乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。而大腸埃希氏菌作為大腸菌群的代表菌，按食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.3—2016、GB 14934—2016檢驗，該菌在36℃條件下培養(yǎng)能分解月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）及煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）中的乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。此前，筆者在進(jìn)行一批餐飲具的大腸菌群檢測時，分離到1株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株，其在伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂平板上呈現(xiàn)大腸埃希氏菌可疑菌落形態(tài)，常規(guī)生化結(jié)果符合大腸埃希氏菌生化特征，將該菌株經(jīng)過3次營養(yǎng)瓊脂純化復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)接LST、BGLB、EC肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)后仍然發(fā)酵乳糖不產(chǎn)氣。而后筆者對該菌株進(jìn)行了微生物鑒定、蛋白圖譜鑒定及核酸檢測，結(jié)果均顯示為大腸埃希氏菌。對該菌進(jìn)行生化分型顯示，該菌屬于大腸埃希氏菌發(fā)堿-殊異株生化類型，是一類特殊生化型的大腸埃希氏菌。2012年，姚欣等[11]就報道過在臨床上發(fā)現(xiàn)發(fā)堿-殊異株大腸埃希氏菌。而筆者這是首次在食品檢驗工作中發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌發(fā)堿-殊異株。該研究針對該類菌株提出可行的分離與鑒定方法，旨在為食品中生化非典型大腸埃希氏菌的檢驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 株 大腸埃希氏菌（Escherichia coli）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）

ATCC8739、腸道出血性大腸埃希氏菌（Enterohemorr-hagic Escherichia coli，EHEC）ATCC43889，均由美國典型菌種保藏中心提供。腸道致病性大腸埃希氏菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）CICC24189、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（Enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）CICC24188、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）CICC

10667、腸道集聚性大腸埃希氏菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）CICC24186，均由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。樣本菌株從餐飲具樣品中分離，磁珠-70℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、EC肉湯、營養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯（BHI）5種致瀉大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑盒及生化管（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；API20E腸桿菌和其他革蘭陰性桿菌鑒定試劑條（生物梅里埃法國股份有限公司）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 LRH-250F培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），BIOMIC V3微生物鑒定與藥敏分析儀（美國Giles Scientific公司），梅里?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS，生物梅里埃中國有限公司），S1000梯度PCR儀（美國伯樂Bio-rad公司），DYY-6C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本菌株分離 將發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的餐飲具LST培養(yǎng)物劃線接種至EMB瓊脂平板，36℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果；然后挑取EMB瓊脂平板上的可疑菌落至營養(yǎng)瓊脂平板，36℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 常規(guī)生化鑒定 挑取上述營養(yǎng)瓊脂平板上的單個菌落，接種至靛基質(zhì)（I）、甲基紅（M）、乙二酰試驗（VP）、檸檬酸鹽（C）生化管，36℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，進(jìn)行IMViC試驗。

1.2.3 產(chǎn)氣試驗 挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的單個菌落再次轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)瓊脂平板，36℃培養(yǎng)24 h。在經(jīng)過3次復(fù)蘇培養(yǎng)后，挑取單個菌落分別接種LST、BGLB肉湯置于36℃，同時接種EC肉湯置于44.5℃，均培養(yǎng)48 h后，觀察結(jié)果。

1.2.4 自動生化鑒定儀鑒定 挑取復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌落至0.85%生理鹽水中，制備成約0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海鹨坏渭泳鷳乙褐罙PI20E生化鑒定條的每個生化管孔，36℃培養(yǎng)24 h后，將鑒定條放置BIOMIC V3微生物鑒定與藥敏分析儀器卡槽中進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.2.5 蛋白圖譜鑒定 挑取質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC8739單個菌落均勻涂布至靶板校準(zhǔn)位點，標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離菌株經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后的單個菌落至檢測位點，每個位點加1 μL基質(zhì)液進(jìn)行裂解，待自然晾干后經(jīng)梅里?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）進(jìn)行蛋白圖譜鑒定。

1.2.6 核酸檢測 轉(zhuǎn)接復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌落至BHI肉湯，同時分別接種大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、腸道致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）、腸道出血性大腸埃希氏菌（EHEC）和腸道集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）至BHI肉湯，36℃培養(yǎng)24 h后，提取DNA模板。然后，按5種致瀉大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)體系如下：2 μL DNA模板，23 μL PCR Buffer，總體積25 μL。擴增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，63℃復(fù)性30 s，72℃延伸1.5 min，變性至延伸步驟循環(huán)40次；72℃終止10 min。以5種致瀉大腸埃希氏菌及大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，滅菌去離子水為空白對照，反應(yīng)完成后使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析。

1.2.7 生化分型 將復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌落接種至KCN、動力、苯丙氨酸脫氫酶、葡萄糖（產(chǎn)氣）、乳糖、衛(wèi)矛醇、水楊苷、側(cè)金盞花醇、棉子糖、麥芽糖、木糖、纖維二糖、丙三醇生化管，按要求培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本菌株在EMB瓊脂平板上的菌落形態(tài)

在EMB瓊脂平板上，標(biāo)準(zhǔn)菌株為中等大小的紫黑色濕潤菌落，有金屬光澤（圖1A）；分離到的樣本菌株為中等大小的深紫紅色濕潤菌落，無金屬光澤（圖1B）。樣本菌株在EMB平板上的形態(tài)雖有別于標(biāo)準(zhǔn)菌株，但根據(jù)GB/T 5750.12—2006，其菌落形態(tài)可被認(rèn)為是可疑菌落，應(yīng)繼續(xù)生化鑒定。

2.2 樣本菌株的常規(guī)生化鑒定結(jié)果

如表1所示，樣本菌株的靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽4項生化結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株一致，符合大腸埃希氏菌生化特征。但按常規(guī)檢驗方法，樣本菌株在LST肉湯培養(yǎng)基中未產(chǎn)氣，不能以此鑒定該菌為大腸埃希氏菌。

2.3 樣本菌株的產(chǎn)氣試驗

將樣本菌株經(jīng)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3次復(fù)蘇培養(yǎng)后，接種到3種肉湯培養(yǎng)基中在相應(yīng)溫度條件下培養(yǎng)48 h，結(jié)果如圖2所示，樣本菌株均可發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，而標(biāo)準(zhǔn)菌株在相同培養(yǎng)條件下均可發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。這表明樣本菌株并非之前的生長環(huán)境不適而導(dǎo)致乳糖發(fā)酵試驗不典型，因此，按常規(guī)檢驗方法仍無法鑒定該菌為大腸埃希氏菌。

2.4 樣本菌株的自動生化鑒定儀鑒定結(jié)果

樣本菌株在API20E生化鑒定系統(tǒng)的鑒定結(jié)果顯示：靛基質(zhì)、VP試驗、檸檬酸鹽結(jié)果與常規(guī)生化結(jié)果一致，儀器判讀為大腸埃希菌，結(jié)果概率為99.9%，典型度為1，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比均無異。這說明樣本菌株在API20E生化鑒定系統(tǒng)包含的20項生化結(jié)果均符合典型大腸埃希氏菌的生化特征，且儀器根據(jù)數(shù)據(jù)庫比對分析，鑒定該菌為大腸埃希氏菌。

2.5 樣本菌株的蛋白圖譜鑒定結(jié)果

MALDI-TOF MS可收集肽指紋圖譜，再與儀器數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌微生物圖譜進(jìn)行比對分析，從而準(zhǔn)確快速地鑒定菌株類型[12-13]。由圖3可知，樣本菌株經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定為大腸埃希氏菌，概率為99.9%，且儀器數(shù)據(jù)比對的主要波峰與大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922的主要波峰位置一致，這與自動生化鑒定儀的鑒定結(jié)果相符。

2.6 樣本菌株的核酸檢測結(jié)果

樣本菌株的多重PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果如圖4所示，樣本菌株具有大腸埃希氏菌種特異性uidA基因的條帶，但未見有致瀉大腸埃希氏菌毒力基因條帶（泳道1～5中uidA條帶以外的基因條帶），核酸鑒定結(jié)果為大腸埃希氏菌，但并非5種常見的致瀉大腸埃希氏菌。核酸檢測結(jié)果與自動生化鑒定儀及MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果一致。

2.7 樣本菌株生化分型結(jié)果

經(jīng)自動生化鑒定儀、MALDI-TOF MS和分子生物學(xué)方法鑒定，樣本菌株確定為大腸埃希氏菌。其生化試驗結(jié)果（表2）顯示，該大腸埃希氏菌可發(fā)酵乳糖和葡萄糖，其中發(fā)酵葡萄糖可產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，根據(jù)《腸桿菌科的鑒定》[14]一書描述，該生化類型屬于發(fā)堿-殊異株生化類型。

3 結(jié) 論

筆者前期從餐飲具中分離到1株樣本菌株，因乳糖發(fā)酵試驗結(jié)果不典型，按常規(guī)檢驗方法難以準(zhǔn)確鑒定，于是借助自動生化鑒定儀、MALDI-TOF MS及分子生物學(xué)等儀器和方法，明確鑒定其為大腸埃希氏菌，且根據(jù)生化分型結(jié)果，該菌屬于大腸埃希氏菌發(fā)堿-殊異株生化類型。這類大腸埃希氏菌最初因部分生理生化特性與志賀氏菌屬極為相似而被歸于志賀氏菌屬。但Chattaway等[15]的研究表明，此類菌株的O抗原及K抗原在血清學(xué)上與埃希氏菌屬更相近，故而將這類菌株歸屬于埃希氏菌不產(chǎn)氣、無動力的特殊生化型，而其不產(chǎn)氣可能是與缺少葡萄糖發(fā)酵所需的某種酶類有關(guān)[16]。

此次檢驗是食品檢驗中首次遇到乳糖發(fā)酵不典型的大腸埃希氏菌株，但近年來硫化氫試驗不典型的大腸埃希氏菌在臨床也有過相關(guān)報道[17]，因此在日常檢驗工作中，應(yīng)關(guān)注非典型大腸埃希氏菌的存在。針對食品中非典型大腸埃希氏菌的檢驗，按常規(guī)檢驗方法，可能會導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，建議工作人員在實際檢驗過程中如遇初發(fā)酵培養(yǎng)物變渾濁現(xiàn)象，可轉(zhuǎn)接EMB瓊脂平板，若平板上出現(xiàn)可疑菌落形態(tài)，可利用自動生化鑒定儀、MALDI-TOF MS、分子生物學(xué)等儀器和方法進(jìn)行輔助鑒定，以確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌計數(shù)：GB 4789.38—2012[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[2] 劉云國. 食品衛(wèi)生微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒定圖譜[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009.

[3] FOSTER-NYARKO E，PALLEN M J. The microbial ecology of Escherichia coli in the vertebrate gut[J]. FEMS Microbiology Reviews，2022，46（3）：fuac008.

[4] 陳東科，孫長貴. 實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

[5] GOMES T A T，ELIAS W P，SCALETSKY I C A，et al. Diarrheagenic Escherichia coli[J]. Brazilian Journal of Microbiology，2016，47：3-30.

[6] 張子科，賴圣杰，余建興，等. 我國2012—2015年門診腹瀉患者中致瀉性大腸埃希菌流行特征分析[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2017，38（4）：419-423.

[7] 王 超，王同瑜，姜金茹，等. 2015—2019年北京市食源性致瀉大腸埃希氏菌感染病例流行特征分析[J]. 實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2022，29（6）：689-692.

[8] 秦 思，沈 赟，馬 愷，等. 2018—2019年江蘇省食源性疾病中致瀉大腸埃希氏菌流行特征及耐藥性分析[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2020，47（21）：3884-3888.

[9] GARCíA A，F(xiàn)OX J G. A one health perspective for defining and deciphering Escherichia coli pathogenic potential in multiple hosts[J]. Comparative Medicine，2021，71（1）：3-45.

[10] 劉 宏，李 樂. 180株大腸埃希氏菌的分布及耐藥分析[J]. 藥品評價，2018，15（13）：55-57，64.

[11] 姚 欣，馮 莉，王 雪，等. 2012年重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院耐藥性監(jiān)測[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，35（3）：362-365.

[12] 戰(zhàn)曉微，杜 影，王宏偉，等. MALDI-TOF MS方法快速鑒定大腸桿菌及ESBLs菌株檢測探索研究[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015，6（1）：99-106.

[13] 李濱洲，陳 飛，郭珍珍，等. 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分離鑒定生鮮豬肉中沙門氏菌/大腸桿菌類似菌[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（4）：717-722.

[14] 愛德華P R，愛文W H. 腸桿菌科的鑒定[M]. 南昌：江西新華印刷廠，1978.

[15] CHATTAWAY M A，SCHAEFER U，TEWOLDE R，et al. Identification of Escherichia coli and Shigella species from whole-genome sequences[J]. Journal of Clinical Microbiology，2017，55（2）：616-623.

[16] 黃秀梨，辛明秀. 微生物學(xué)（3版）[M]. 北京：高等教育出版社，2009.

[17] 張曉玲，嚴(yán) 謹(jǐn)，張 群. 產(chǎn)硫化氫大腸埃希菌的分離與鑒定[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2021，37（16）：2779-2783.

（責(zé)任編輯：成 平）