DLGAP5作為腎透明細(xì)胞癌的診斷標(biāo)志物及其與CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性

摘要：目的" 探討Discs大同源物關(guān)聯(lián)蛋白5（DLGAP5）表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌（KIRC）中的作用。方法" 基于癌癥基因組圖譜（TCGA）分析KIRC中DLGAP5的表達(dá)情況與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。應(yīng)用比例風(fēng)險(xiǎn)（Cox）回歸模型和Kaplan-Meier（K-M）分析評(píng)估了DLGAP5在KIRC患者中的預(yù)后價(jià)值。CIBERSORT分析DLGAP5和CD8+T細(xì)胞之間的相關(guān)性，基因集富集分析（GSEA）方法篩選和DLGAP5表達(dá)相關(guān)的生物學(xué)途徑。結(jié)果" 與正常腎臟組織比較，KIRC中DLGAP5的表達(dá)呈顯著上調(diào)。其高表達(dá)情況與腫瘤組織的分化程度、病理分期、復(fù)發(fā)和死亡均顯著相關(guān)。K-M分析結(jié)果表明，DLGAP5高表達(dá)與KIRC患者的不良總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS）相關(guān)，且DLGAP5是OS和PFS的獨(dú)立預(yù)后因子。免疫微環(huán)境分析表明，DLGAP5的表達(dá)量與多種腫瘤免疫細(xì)胞相關(guān)，尤其是CD8+T細(xì)胞。DLGAP5表達(dá)在“細(xì)胞周期”“泛素介導(dǎo)的蛋白水解”“蛋白酶體通路”和“T細(xì)胞受體信號(hào)通路”上顯著富集。藥敏分析結(jié)果顯示，高危組患者對(duì)阿昔替尼、舒尼替尼更敏感。結(jié)論" DLGAP5是KIRC的一種潛在生物標(biāo)志物，與KIRC的診斷與預(yù)后顯著相關(guān)，這將為臨床的診斷與治療提供新的研究方向。

關(guān)鍵詞：DLGAP5;CD8+T細(xì)胞;KIRC;TCGA數(shù)據(jù)庫(kù);預(yù)后

中圖分類號(hào)：R737.11" " " " " " " nbsp; " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.07.001

文章編號(hào)：1006-1959（2023）07-0001-08

DLGAP5 as a Diagnostic Marker of Renal Clear Cell Carcinoma and its Correlation with CD8+ T Cells

LI Kun，HAN Na，F(xiàn)AN Zhi-xiang，CHEN Hong-run，JIN Shuang，ZHANG Zhong-mian

（Department of Oncology，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450014，Henan，China）

Abstract：Objective" To investigate the role of discs large homolog associated protein 5 （DLGAP5） expression in renal clear cell carcinoma （KIRC）.Methods" The correlation between the expression of DLGAP5 in KIRC and clinical parameters was analyzed based on The Cancer Genome Atlas （TCGA）. The prognostic value of DLGAP5 in KIRC patients was evaluated by proportional risk （Cox） regression model and Kaplan-Meier （K-M） analysis. CIBERSORT was used to analyze the correlation between DLGAP5 and CD8+ T cells. Gene set enrichment analysis （GSEA） was used to screen the biological pathways related to DLGAP5 expression.Results" Compared with normal kidney tissues， the expression of DLGAP5 in KIRC was significantly up-regulated. Its high expression was significantly correlated with tumor differentiation， pathological stage， recurrence and death. K-M analysis showed that high expression of DLGAP5 was associated with poor overall survival （OS） and progression-free survival （PFS） in KIRC patients， and DLGAP5 was an independent prognostic factor for OS and PFS. Immune microenvironment analysis showed that the expression of DLGAP5 was associated with a variety of tumor immune cells， especially CD8+ T cells. DLGAP5 expression was significantly enriched in “cell cycle” “ubiquitin-mediated proteolysis” “ proteasome pathway”and “T cell receptor signaling pathway”. The results of drug sensitivity analysis showed that patients in the high-risk group were more sensitive to axitinib and sunitinib.Conclusion" DLGAP5 is a potential biomarker of KIRC， which is significantly related to the diagnosis and prognosis of KIRC， and will provide a new research direction for clinical diagnosis and treatment.

Key words：DLGAP5;CD8+ T cells;KIRC;TCGA database;Prognosis

腎透明細(xì)胞癌（KIRC）的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)。30%的患者在確診為KIRC時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，60%的KIRC患者在確診后會(huì)在1～2年內(nèi)死亡[1]。據(jù)此，需進(jìn)一步加強(qiáng)探索對(duì)KIRC早期診斷和預(yù)后有價(jià)值的生物標(biāo)志物。目前已經(jīng)證實(shí)，KIRC的發(fā)生和發(fā)展是由決定腫瘤生物學(xué)行為的基因的異常表達(dá)觸發(fā)的[2]。因此，鑒定出具有潛在臨床意義的失調(diào)基因有助于改善KIRC的診斷和治療。既往研究表明[3]，癌細(xì)胞的分裂通常伴隨著有絲分裂相關(guān)因子和蛋白質(zhì)的異常表達(dá)。機(jī)體調(diào)節(jié)胞內(nèi)有絲分裂的相關(guān)因子和蛋白質(zhì)水平及功能的一種重要機(jī)制是依賴于泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)[4]。泛素及其起始酶系統(tǒng)和蛋白酶體系統(tǒng)成為了負(fù)責(zé)該調(diào)節(jié)過程的重要組成[5]。泛素-蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)DLGAP5，而后者是被磷酸化參與有絲分裂過程的蛋白。在有絲分裂過程中位于紡錘體中，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而發(fā)揮作用[6]，作為細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞惡變中也起著重要作用，例如在結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌中作為潛在的致癌蛋白起作用[7，8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9，10]，DLGAP5表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌的總生存期（OS）和無復(fù)發(fā)生存（RFS）呈負(fù)相關(guān)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DLGAP5沉默后，癌細(xì)胞的遷移和增殖能力被顯著抑制。據(jù)此，推測(cè)DLGAP5在KIRC的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色。然而關(guān)于DLGAP5在KIRC中發(fā)揮作用的研究卻很少。本研究分析了KIRC中DLGAP5的表達(dá)譜及其在該疾病中的臨床意義，探討了DLGAP5與癌癥免疫浸潤(rùn)之間的相關(guān)性，以及DLGAP5在KIRC中的生物學(xué)功能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1數(shù)據(jù)與方法

1.1數(shù)據(jù)來源" 從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov）-KIRC數(shù)據(jù)集中獲取了539個(gè)KIRC組織和72個(gè)正常對(duì)照樣本相關(guān)的mRNA-seq。于UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//xenabrowser.net/）中搜索與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中患者對(duì)應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。去除沒有完整TNM分期和生存數(shù)據(jù)的樣本后，獲得了939組臨床數(shù)據(jù)。在獲得的信息中，527份完整包含了mRNA-seq 數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。采用R軟件中的edgeR包，通過設(shè)置Plt;0.05和|log2FoldChange|gt;2為閾值，鑒定正常組織與KIRC樣本之間的差異基因。此外，還使用基因表達(dá)譜交互分析（GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/）數(shù)據(jù)庫(kù)。檢索了不同正常組織和癌組織之間的DLGAP5表達(dá)水平[11]。

1.2 CIBERSORT 算法" CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu）是一個(gè)基于線性支持向量回歸原理的免疫細(xì)胞亞型表達(dá)矩陣反卷積的網(wǎng)絡(luò)工具，可用RNA-seq數(shù)據(jù)來估計(jì)相關(guān)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況[12]。為了評(píng)估DLGAP5的表達(dá)對(duì)免疫細(xì)胞的影響，從TCGA下載了539個(gè)KIRC樣本的mRNA-seq。然后，根據(jù)DLGAP5表達(dá)量的中位數(shù)將539個(gè)腫瘤樣本分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，并利用分析結(jié)果分別評(píng)估 DLGAP5和CD8+T細(xì)胞之間的相關(guān)性。

1.3基因集富集分析（GSEA）" 在KIRC中，為了探索與DLGAP5表達(dá)相關(guān)的富集通路，使用TCGA-KIRC數(shù)據(jù)集在GSEA中進(jìn)行了探索，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（NES）。當(dāng)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）的p值和q值均在0.05以下時(shí)，則說明基因集呈顯著富集。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" T檢驗(yàn)分析了不同臨床病理組之間DLGAP5表達(dá)量差異。通過ROC曲線計(jì)算曲線下面積（AUC）來判斷DLGAP5對(duì)KIRC的診斷意義。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)分析不同臨床病理參數(shù)與DLGAP5的表達(dá)量水平之間的差異。R軟件（版本 4.0.3）用于統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算最優(yōu)分類點(diǎn)，將樣本分為高、低DLGAP5表達(dá)組。利用K-M分析和Log-rank檢驗(yàn)的方法，對(duì)兩組的OS和PFS情況進(jìn)行了分析。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型確定了OS和PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，同時(shí)還計(jì)算了其95%置信區(qū)間的風(fēng)險(xiǎn)比。當(dāng)雙尾Plt;0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GSEA（版本4.0.1）用于研究DLGAP5富集通路。

2結(jié)果

2.1 DLGAP5差異分析及診斷價(jià)值" 應(yīng)用GEPIA分析方法研究了部分正常人體組織和腫瘤組織中DLGAP5的基因表達(dá)情況。與正常腎臟組織（n=72）相比，KIRC組織中DLGAP5表達(dá)量顯著上調(diào)（n=539）（Plt;0.0001），而正常人體組織中DLGAP5表達(dá)水平極低，見圖1A和1B，ROC曲線（AUC=0.933，Plt;0.0001）。圖1C也證實(shí)了DLGAP5上調(diào)在KIRC中具有相當(dāng)大的診斷價(jià)值。

2.2 DLGAP5過表達(dá)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)" 根據(jù)DLGAP5表達(dá)量，將KIRC樣本分為低DLGAP5表達(dá)組和高DLGAP5表達(dá)組，并根據(jù)OS的最佳閾值檢測(cè)DLGAP5表達(dá)的臨床意義。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表1。然而，DLGAP5高表達(dá)與性別、腫瘤分化程度、晚期TNM分期、生存狀態(tài)和疾病狀態(tài)密切相關(guān)（Plt;0.05）。以DLGAP5 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)為連續(xù)變量，進(jìn)一步證實(shí)了部分臨床病理組之間DLGAP5表達(dá)水平的差異（Plt;0.05），見圖2。

2.3 DLGAP5的高表達(dá)預(yù)測(cè)KIRC患者的OS和無進(jìn)展生存期（PFS）" 根據(jù)最佳閾值生成K-M曲線評(píng)估DLGAP5在KIRC中的預(yù)后價(jià)值。觀察到DLGAP5高表達(dá)的KIRC患者具有相對(duì)較差的OS（HR=2.324， P=1.43E-08）和PFS（HR=2.602，P=5.32E-10），見圖3。此外，還進(jìn)行Cox回歸分析，探討KIRC中影響OS的獨(dú)立因素，單因素分析顯示，年齡、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)和DLGAP5表達(dá)與KIRC的OS顯著相關(guān)（Plt;0.05）。多因素分析證實(shí)，TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、DLGAP5高表達(dá)是不良OS的獨(dú)立指標(biāo)（Plt;0.05），見表2。

2.4 DLGAP5表達(dá)與KIRC免疫浸潤(rùn)之間的相關(guān)性" 現(xiàn)已證實(shí)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是腫瘤患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素，因此試圖探討DLGAP5表達(dá)是否與KIRC 免疫浸潤(rùn)有關(guān)。根據(jù)DLGAP5表達(dá)量的中位數(shù)將KIRC患者分為高、低表達(dá)組。依賴于CIBERSORT計(jì)算方式，分析呈現(xiàn)出兩組中22種不同免疫細(xì)胞亞型的比例。如圖4A所示，DLGAP5表達(dá)水平主要影響CD8+T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、CD4記憶靜息T細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞等。進(jìn)一步分析表明與低表達(dá)組比較，CD8+T細(xì)胞于高表達(dá)組中顯著增加（Plt;0.001）。相反，M2巨噬細(xì)胞、CD4記憶靜息T細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化NK細(xì)胞在高表達(dá)組均顯著降低（Plt;0.05）。如圖4B所示DLGAP5表達(dá)量（N=611）與CD8+T細(xì)胞呈顯著正相關(guān)（cor=0.322，Plt;0.001）。KM分析表明高比例的CD8+T細(xì)胞與KIRC中的不良PFS相關(guān)（Plt;0.05），見圖4C。

2.5基因集富集分析" 通過GSEA研究KIRC中DLGAP5上調(diào)的潛在生物學(xué)功能，并發(fā)現(xiàn)“細(xì)胞周期”“泛素介導(dǎo)的蛋白水解”“蛋白酶體通路”和“T細(xì)胞受體信號(hào)通路”顯著富集（Plt;0.05），見圖5。

2.6免疫與基因表達(dá)" 考慮到基于檢查點(diǎn)抑制劑的免疫治療的重要性，進(jìn)一步探討了高表達(dá)組與低表達(dá)兩組之間免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的差異。37個(gè)檢查點(diǎn)基因在兩組之間存在顯著差異，包括許多已驗(yàn)證的有效免疫治療靶點(diǎn)，如PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）、CTLA4，見圖6。

2.7預(yù)后特征的藥敏分析" 采用“pRRophetic”R包預(yù)測(cè)化療藥物的IC50（指藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，數(shù)值越低能力越強(qiáng)）。除免疫檢查點(diǎn)抑制劑外，多種靶向藥物成為晚期腎癌藥物治療的主要手段，可用于一線及二線選擇。因此，對(duì)需要靶向治療的患者進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)是非常重要的。排除無效藥物，明確有效藥物進(jìn)行治療，一直是腫瘤學(xué)界探討并攻克的難題。本研究中兩組有138種靶向藥物和部分化療藥物的IC50水平。其中選取了6種具有代表性的靶向藥物如圖7A～圖7F所示。發(fā)現(xiàn)替西羅莫司、阿昔替尼、博蘇替尼、索拉非尼、舒尼替尼及達(dá)沙替尼可能是治療高表達(dá)人群的首選藥物。

3討論

隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，KIRC的早期診斷和更個(gè)性化的腫瘤管理得到了推動(dòng)，其中至關(guān)重要的一步是關(guān)鍵生物標(biāo)志物的識(shí)別。通過分析發(fā)現(xiàn)，與正常腎臟組織相比，KIRC組織中DLGAP5表達(dá)水平顯著上調(diào)。通過ROC曲線評(píng)估DLGAP5 mRNA表達(dá)水平對(duì)KIRC的診斷價(jià)值，提示DLGAP5可能是一種有利于KIRC分子和病理診斷的生物標(biāo)志物。此外，本研究還評(píng)估了DLGAP5上調(diào)在KIRC中的臨床意義，并且發(fā)現(xiàn)KIRC的高表達(dá)與低分化腫瘤、晚期TNM分期、復(fù)發(fā)和死亡相關(guān)，提示DLGAP5可能與KIRC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。K-M分析顯示，DLGAP5高表達(dá)的KIRC患者OS和PFS相對(duì)較差（Plt;0.05）。多因素分析也證實(shí)，DLGAP5高表達(dá)是KIRC中不利OS的獨(dú)立預(yù)后因素。上述結(jié)果表明，DLGAP5有望成為改善臨床決策的一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后因素。

腎透明細(xì)胞癌易發(fā)生免疫浸潤(rùn)，腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)強(qiáng)烈影響免疫治療的反應(yīng)[13]。因此，本研究進(jìn)一步探討了DLGAP5與腫瘤微環(huán)境之間是否存在潛在的聯(lián)系。GSEA顯示DLGAP5在T細(xì)胞受體信號(hào)通路中顯著富集。CIBERSORT分析顯示，DLGAP5的表達(dá)與KIRC中多種免疫浸潤(rùn)水平有關(guān)，其中CD8+T細(xì)胞是受DLGAP5表達(dá)影響的主要免疫細(xì)胞。既往研究也發(fā)現(xiàn)，與其他21種免疫細(xì)胞相比，KIRC中CD8+T細(xì)胞的含量更高，且CD8+T細(xì)胞比例高與不良預(yù)后相關(guān)[14]，本研究中圖4A和圖4C的發(fā)現(xiàn)與該研究高度一致，進(jìn)一步證明了DLGAP5與CD8+T細(xì)胞呈正相關(guān)（cor=3.22，Plt;0.01）。DLGAP5有望成為KIRC的免疫治療靶點(diǎn)。

DLGAP5在KIRC中的潛在生物學(xué)功能尚未完全闡明。富集分析表明，KIRC中DLGAP5的高表達(dá)與細(xì)胞周期、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、蛋白酶體和T細(xì)胞受體信號(hào)通路有關(guān)，這些都被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[15，16]。在細(xì)胞癌變過程中，DLGAP5通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期發(fā)揮功能，其表達(dá)水平在細(xì)胞周期中呈循環(huán)性變化[9]。此外，Li Y等[4]還發(fā)現(xiàn)，DLGAP5作為一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的新基因，可以使癌細(xì)胞停滯于G2/M期，顯著提高乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力。因此，DLGAP5的過表達(dá)可能促進(jìn)細(xì)胞周期紊亂和基因組突變的積累。

DLGAP5是一種由泛素-蛋白酶體機(jī)制調(diào)控的有絲分裂磷酸化蛋白，SCF是一種多組份復(fù)合物，是泛素偶聯(lián)物中的一種，其成分包括一些F-box蛋白的共同成分和可變成分[5]。Fbx7是DLGAP5水解酶介導(dǎo)的蛋白水解所必需的F-box蛋白。在SCFFbx7復(fù)合物中，F(xiàn)bx7通過Cdk1-cyclin b磷酸化依賴的方式，招募DLGAP5通過其c端脯氨酸富集區(qū)（SCF核心復(fù)合物），誘導(dǎo)DLGAP5蛋白泛素化，高水平的DLGAP5蛋白導(dǎo)致有絲分裂相關(guān)因子的異常表達(dá)，而有絲分裂成分和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)異常，創(chuàng)造了腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖所需環(huán)境。

綜上所述，基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究結(jié)果證明了預(yù)后標(biāo)志物DLGAP5對(duì)KIRC的生存預(yù)后、腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞、免疫治療反應(yīng)和藥物敏感性的預(yù)測(cè)價(jià)值。同時(shí)，還需要臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)本研究的觀察結(jié)果和DLGAP5預(yù)后價(jià)值的機(jī)制。

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收稿日期：2022-08-24;修回日期：2022-09-15

編輯/肖婷婷

基金項(xiàng)目：鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2020年度科技創(chuàng)新人才培育基金拔尖人才項(xiàng)目（編號(hào)：2020BJRCB04）

作者簡(jiǎn)介：李坤（1990.5-），男，湖北仙桃人，碩士研究生，主要從事腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究

通訊作者：張中冕（1964.12-），男，河南鄭州人，碩士，主任醫(yī)師，教授，主要從事腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究