基于Nox4/NLRP3通路探討桃葉珊瑚苷干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制

摘要 目的：探究桃葉珊瑚苷干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的作用機(jī)制。方法：將SD雄性大鼠采用高脂飼料聯(lián)合維生素D₃腹腔注射的方法建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。頸動(dòng)脈超聲和蘇木精-伊紅（HE）染色評估大鼠建模；建模后分為模型組、辛伐他汀組（20 mg/kg）及桃葉珊瑚苷高劑量（40 mg/kg）組、中劑量（20 mg/kg）組、低劑量（10 mg/kg）組，每組8只；另設(shè)正常組，8只大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)并腹腔注射生理鹽水。分組完成后開始給藥，辛伐他汀組給予辛伐他汀溶液灌胃，桃葉珊瑚苷各劑量組腹腔注射相應(yīng)劑量的桃葉珊瑚苷，正常組和模型組灌胃和注射等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥4周。給藥結(jié)束后，檢測大鼠血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-18、IL-1β水平；HE染色觀察頸動(dòng)脈組織病理學(xué)變化；熒光探針測定頸動(dòng)脈中活性氧（ROS）的生成；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測頸動(dòng)脈組織還原型輔酶Ⅱ氧化酶4（Nox4）/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：造模大鼠管腔內(nèi)出現(xiàn)大量動(dòng)脈粥樣硬化病變，頸動(dòng)脈出現(xiàn)狹窄，局部血管壁上明顯有斑塊形成，頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（IMT）增加，大量炎性因子浸潤。與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平和頸動(dòng)脈ROS熒光強(qiáng)度、Nox4、NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、Cleaved Caspase-1的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），HDL-C水平明顯降低（P＜0.05），頸動(dòng)脈組織內(nèi)膜層增厚，局部有斑塊形成，內(nèi)皮受損，大量炎性因子浸潤；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平和頸動(dòng)脈ROS熒光強(qiáng)度、Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1的表達(dá)明顯下降（P＜0.05），HDL-C水平明顯升高（P＜0.05），大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、炎性因子浸潤程度減少；且桃葉珊瑚苷高劑量組對Nox4/NLRP3通路的抑制作用以及對頸動(dòng)脈組織的改善作用與辛伐他汀組接近。結(jié)論：桃葉珊瑚苷可調(diào)節(jié)血脂異常、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變，其作用機(jī)制可能與抑制Nox4/NLRP3通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞 動(dòng)脈粥樣硬化；桃葉珊瑚苷；內(nèi)皮功能障礙；還原型輔酶Ⅱ氧化酶4/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.13.012

作者單位 襄陽市中心醫(yī)院/湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院（湖北襄陽 441021）

通訊作者 劉娟，E-mail：47892327@qq.com

引用信息 鐘子安，劉娟，楊柳，等.基于Nox4/NLRP3通路探討桃葉珊瑚苷干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（13）：2405-2411.

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，是心腦血管疾病的常見病因，具有多年的進(jìn)行性病程，但可引起急性臨床事件，包括急性冠脈綜合征、心肌梗死和中風(fēng)^[1]。有研究顯示，80%的缺血性中風(fēng)是由動(dòng)脈粥樣硬化造成的動(dòng)脈閉塞或狹窄引起的^[2]，并且通過降脂治療、適當(dāng)?shù)目鼓蚩寡“逯委?、適當(dāng)?shù)难獕嚎刂埔约皩︻i動(dòng)脈狹窄的干預(yù)可以在很大程度上預(yù)防中風(fēng)^[3]。因此，改善動(dòng)脈粥樣硬化對于預(yù)防心腦血管疾病具有重要意義。

氧化應(yīng)激被證明是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的起始因素之一，與炎癥反應(yīng)和脂蛋白的致動(dòng)脈粥樣硬化修飾有關(guān)。氧化應(yīng)激的標(biāo)志是活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高。還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶4（NADPH oxidase 4，Nox4）是動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中ROS的主要來源^[4]，在血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，ROS產(chǎn)生增多可激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）信號通路，刺激內(nèi)皮細(xì)胞炎癥并最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化^[5-6]。說明Nox4/NLRP3通路在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中具有重要作用。桃葉珊瑚苷（aucubin）是一種環(huán)烯醚萜苷，是杜仲、地黃、車前草等防治動(dòng)脈粥樣硬化傳統(tǒng)中藥中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、降糖、降脂、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用^[7-8]。桃葉珊瑚苷可明顯抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)的致動(dòng)脈粥樣硬化脂肪因子[包括纖溶酶原激活物抑制劑1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、白介素（interleukin，IL）-6]的分泌和mRNA合成^[9]；可促進(jìn)氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）處理的人內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，對血管內(nèi)皮功能障礙發(fā)揮預(yù)防/調(diào)節(jié)作用^[10]；還可通過抑制ROS的產(chǎn)生來下調(diào)Nox4 mRNA表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)化生長因子β₁（TGF-β₁）激活的人肝星形細(xì)胞（LX-2）的活化和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積^[11]。然而，迄今為止，桃葉珊瑚苷是否對動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)作用仍然未知。因此，本研究通過構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，探究桃葉珊瑚苷對動(dòng)脈粥樣硬化的影響，并試圖探索其潛在的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

無特定病原體（SPF）級SD雄性大鼠70只，6～8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證為SCXK（京）2019-0009。將大鼠飼養(yǎng)在溫度（20±2）℃、濕度45%～55%環(huán)境，12 h光照/12 h黑暗周期，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究已由機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑及儀器

桃葉珊瑚苷（高效液相色譜≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號：T-016）；維生素D₃注射液[上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：H31021259，規(guī)格：1 mL（7.5 mg）]；辛伐他汀片（山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號：H20083840）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑、RIPA裂解液和二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）-ROS活性氧檢測試劑盒（超氧化物陰離子熒光探針）購自碧云天生物科技公司；三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；大鼠ox-LDL、TNF-α、IL-18、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔源一抗Nox4（ab133303）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-related speck-like protein containing CARD，ASC）購自英國Abcam公司，兔源一抗NLRP3、Cleaved Caspase-1、β-actin及二抗山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）H＋L購自美國Cell Signaling Technology公司。

Vevo770超高分辨率小動(dòng)物彩色多普勒超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)（加拿大Visualsonics）；iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad公司）；BX61電動(dòng)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 模型制備及分組給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分為正常組（12只）和造模組（58只）。正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠采用高脂飼料（2%膽固醇＋0.5%膽酸鈉＋0.2%丙硫氧嘧啶＋0.012 5%維生素D₃粉劑＋3%豬油＋基礎(chǔ)飼料）連續(xù)喂養(yǎng)12周，同時(shí)每4周給予維生素D₃腹腔注射（350 000 U/kg），建立動(dòng)脈粥樣硬化模型^[12-13]。正常組大鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水。建模后，超聲探測發(fā)現(xiàn)大鼠頸動(dòng)脈有狹窄，管腔內(nèi)有明顯斑塊形成，且頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（intima-media thickness，IMT）增加；從正常組和造模組大鼠中各隨機(jī)選取4只大鼠，處死后取主動(dòng)脈組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色觀察主動(dòng)脈病理變化。造模組可觀察到主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、粥樣斑塊形成，且內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞，說明動(dòng)脈粥樣硬化模型制備成功。造模成功共46只大鼠，模型成功率為79.31%。

取造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組（20 mg/kg）^[14]及桃葉珊瑚苷高劑量（40 mg/kg）組、中劑量（20 mg/kg）組、低劑量（10 mg/kg）組^[8]，每組8只。分組完成后開始給藥，辛伐他汀組給予20 mg/kg的辛伐他汀溶液灌胃，桃葉珊瑚苷各劑量組腹腔注射相應(yīng)劑量的桃葉珊瑚苷，正常組和模型組灌胃和注射等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥4周。

1.4 取材及指標(biāo)檢測

1.4.1 頸動(dòng)脈超聲檢查大鼠建模情況

在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)和造模后，大鼠通過面罩吸入異氟烷（2%）鎮(zhèn)靜麻醉，并置于仰臥位。脫去頸部毛發(fā)，將掃描頭移至頸部，使用40 MHz探頭掃描頸動(dòng)脈，使用長短軸視圖將左頸總動(dòng)脈可視化，獲得超聲圖像，并測量管腔-內(nèi)膜界面和內(nèi)-外膜界面之間的距離即為IMT，測量3次，取其平均值作為IMT值。

1.4.2 血清脂質(zhì)水平測定

給藥結(jié)束后，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，靜置后以3 000 r/min離心15 min，分離血清，并使用生化試劑盒定量分析TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。

1.4.3 血清ox-LDL和炎性因子指標(biāo)測定

采用ELISA試劑盒測定血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平。

1.4.4 HE染色觀察頸動(dòng)脈組織病理學(xué)變化

采血完成后處死大鼠，分離頸動(dòng)脈組織，生理鹽水沖洗殘留血液后等分為3份，一份用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋并切成4 μm切片，二甲苯脫蠟，不同濃度的乙醇水化，用蘇木精和伊紅染色10 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片后在顯微鏡下觀察頸動(dòng)脈的病理特征并拍照。

1.4.5 熒光探針測定頸動(dòng)脈中ROS的生成

取上述分離的部分頸動(dòng)脈組織，包埋在OCT化合物中并冷凍在－20 ℃下。冰凍切片機(jī)上切片（厚度為10 μm），采用DHE染色液將組織切片在37 ℃避光條件下孵育30 min，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗去多余的DHE，抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察紅色熒光標(biāo)記的ROS并拍照，并使用Image J軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

1.4.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測頸動(dòng)脈組織Nox4/NLRP3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

取上述分離的部分頸動(dòng)脈組織，加入RIPA裂解液研磨后，離心取上清液；BCA法測量蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)樣品（每孔30 μg）在10%聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，然后將膜與一抗（Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1按1∶1 000稀釋，β-actin按1∶5 000稀釋）在4 ℃下孵育過夜，第2天，洗滌膜并用二抗[辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG，1∶5 000]室溫孵育1 h，隨后，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）溶液顯色觀察條帶。Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行量化，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值作為各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0、GraphPad Prism 9.0和Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間差異進(jìn)一步采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型的建立

造模前，大鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)膜很光滑。造模后，造模組大鼠管腔內(nèi)出現(xiàn)大量動(dòng)脈粥樣硬化病變：頸動(dòng)脈出現(xiàn)狹窄，在長軸水平上探測到狹窄局部血管壁上明顯有斑塊形成，短軸將縮窄處局部放大，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)管腔內(nèi)有斑塊形成，且與正常組大鼠比較，造模組大鼠的頸動(dòng)脈IMT明顯增加[（0.15±0.02）mm與（0.27±0.03）mm，P＜0.05]。HE染色結(jié)果也顯示，頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，且內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞，并伴有斑塊沉積，大量炎性因子浸潤；組織病理學(xué)評估結(jié)果與超聲檢查結(jié)果一致。說明動(dòng)脈粥樣硬化模型制備成功。詳見圖1。

2.2 各組大鼠血清脂質(zhì)水平比較

與正常組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高（P＜0.05），HDL-C水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組血清TC、TG、LDL-C水平明顯下降（P＜0.05），HDL-C水平明顯升高（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，桃葉珊瑚苷高劑量組大鼠血清脂質(zhì)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.3 各組血清ox-LDL和炎性因子水平比較

與正常組比較，模型組血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平明顯降低（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，桃葉珊瑚苷高劑量組血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-18水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.4 各組大鼠頸動(dòng)脈組織病理學(xué)變化

正常組大鼠頸動(dòng)脈組織內(nèi)膜、中膜、外膜結(jié)構(gòu)完整，層次分界清楚，內(nèi)膜層薄，未見斑塊；模型組大鼠頸動(dòng)脈組織內(nèi)膜層增厚，局部有斑塊形成，內(nèi)皮受損，大量炎性因子浸潤，可見泡沫細(xì)胞；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷各劑量組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、炎性因子浸潤程度依次減少，且辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組頸動(dòng)脈組織病理形態(tài)接近。詳見圖2。

2.5 各組大鼠頸動(dòng)脈ROS水平比較

與正常組比較，模型組大鼠頸動(dòng)脈組織ROS熒光強(qiáng)度明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組大鼠頸動(dòng)脈組織ROS熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，桃葉珊瑚苷高劑量組大鼠頸動(dòng)脈組織ROS熒光強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖3、表3。

2.6 各組大鼠頸動(dòng)脈組織Nox4/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，模型組大鼠頸動(dòng)脈組織Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和桃葉珊瑚苷高劑量組、桃葉珊瑚苷中劑量組大鼠頸動(dòng)脈組織Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，桃葉珊瑚苷高劑量組大鼠頸動(dòng)脈組織上述蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖4、表4。

3 討 論

高血壓、高膽固醇血癥和其他持續(xù)效應(yīng)或血流剪切力可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)。血液中的脂質(zhì)（主要是膽固醇和膽固醇酯）以脂蛋白的形式從受損的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈壁，引起血管局部炎癥。炎性因子可刺激單核細(xì)胞向血管壁趨化并分化為巨噬細(xì)胞，并通過吞噬修飾的脂蛋白（如ox-LDL）而形成泡沫細(xì)胞。在動(dòng)脈粥樣硬化晚期，炎性細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）可以降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，使斑塊容易破裂，導(dǎo)致管腔血栓形成、血栓栓塞和血管閉塞，最終導(dǎo)致心肌梗死或中風(fēng)^[15]。

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的兩個(gè)重要因素；ROS水平升高是氧化應(yīng)激的標(biāo)志；血脂異常（血液中TG、TC和LDL-C升高，HDL-C降低）是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素^[16]。血脂水平升高會(huì)導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加，而血液中升高的低密度脂蛋白（LDL）則沉積在內(nèi)皮下基質(zhì)中，通過增加的ROS而被氧化形成ox-LDL，導(dǎo)致ox-LDL水平升高。ox-LDL的過表達(dá)可破壞內(nèi)皮細(xì)胞，并通過過表達(dá)凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（LOX-1）導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)一步升高^[17]。Shen等^[7]研究發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷可通過降低TC、TG、LDL、極低密度脂蛋白（VLDL）、TNF-α、IL-1β和血液中IL-6含量來抑制脂質(zhì)積累、氧化應(yīng)激和炎癥，發(fā)揮降血脂作用；還可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙^[10]。本研究結(jié)果顯示，桃葉珊瑚苷能明顯降低動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠血清TG、TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平，說明桃葉珊瑚苷可改善血脂異常，這與以往的研究結(jié)果一致^[7，10]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷性腦損傷中，桃葉珊瑚苷可激活抗氧化酶，抑制ROS的過度生成，減少細(xì)胞凋亡^[8]。本研究在經(jīng)桃葉珊瑚苷干預(yù)的動(dòng)脈粥樣硬化大鼠中，通過DCFH-DA熒光探針法檢測到頸動(dòng)脈ROS以及血清ox-LDL水平降低，再次證實(shí)桃葉珊瑚苷的抗氧化和調(diào)血脂特性，這可能是桃葉珊瑚苷改善內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制。

動(dòng)脈粥樣硬化的氧化應(yīng)激和炎癥之間存在惡性循環(huán)。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，炎癥反應(yīng)是斑塊易損過程中的主要驅(qū)動(dòng)力，貫穿動(dòng)脈粥樣硬化始終。Nox4是一種組成型活性酶，已被確定為ROS的主要來源之一，在許多心血管疾病中表達(dá)升高，包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭和缺血性中風(fēng)。內(nèi)皮細(xì)胞中Nox4的表達(dá)積極介導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙和損傷，有助于動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展^[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，Nox4介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生促進(jìn)NLRP3炎癥小體激活，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中具有重要作用^[19]。NLRP3炎癥小體是觸發(fā)炎癥反應(yīng)激活的細(xì)胞質(zhì)多蛋白復(fù)合物，由NLRP3蛋白、ASC與半胱天冬酶1前體（pro-caspase-1）組成，其激活是血管損傷的主要途徑^[20]。NLRP3炎性小體活化后，pro-caspase-1會(huì)裂解為具有活性的Cleaved Caspase-1，進(jìn)而將IL-1β前體（pro-IL-1β）和IL-18前體（pro-IL-18）分別裂解為成熟的IL-1β和IL-18^[21]；IL-18可以通過增加膽固醇水平來促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和斑塊破裂^[22]。高IL-1β通過引發(fā)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌其他炎性因子，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和進(jìn)展中發(fā)揮多重作用^[23]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3在患有高血壓、糖尿病和高膽固醇血癥的吸煙病人的主動(dòng)脈中過度表達(dá)；主動(dòng)脈中NLRP3表達(dá)與LDL-C、TC呈正相關(guān)，與HDL-C水平呈負(fù)相關(guān)^[24-25]。本研究結(jié)果顯示，桃葉珊瑚苷可降低動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平，提示桃葉珊瑚苷可能對NLRP3炎性小體的激活具有抑制作用。

Zhou等^[26]研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化中Nox4上調(diào)，在Nox4敲除小鼠中動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展減少；并且Nox4缺陷小鼠顯示NLRP3炎癥小體的激活減少，以及Caspase-1激活和IL-1β、IL-18產(chǎn)生明顯減少^[27]。桃葉珊瑚苷在TGF-β₁誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化中，可下調(diào)Nox4 mRNA表達(dá)，并抑制ROS的產(chǎn)生^[11]。由此，推測桃葉珊瑚苷對動(dòng)脈粥樣硬化的改善作用可能與Nox4/NLRP3通路有關(guān)。辛伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是一種已知的保護(hù)內(nèi)皮功能的藥物，可通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶（Nox4、Nox2、p22phox等）表達(dá)，以減少ROS生成從而達(dá)到抗氧化損傷作用^[28]；還可通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體激活抑制動(dòng)脈粥樣硬化^[29]。本研究結(jié)果顯示，桃葉珊瑚苷可降低動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠頸動(dòng)脈組織Nox4、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1的蛋白表達(dá)，且高劑量桃葉珊瑚苷對Nox4/NLRP3通路的抑制作用以及對頸動(dòng)脈組織的改善作用與辛伐他汀接近，提示桃葉珊瑚苷對動(dòng)脈粥樣硬化的改善作用可能與抑制Nox4/NLRP3通路的激活有關(guān)。

綜上所述，桃葉珊瑚苷可調(diào)節(jié)血脂異常、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變，其作用機(jī)制可能與抑制Nox4/NLRP3通路的激活有關(guān)。本研究初步探究了桃葉珊瑚苷對動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用及潛在機(jī)制，未對Nox4/NLRP3通路進(jìn)行干預(yù)，后續(xù)將采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證桃葉珊瑚苷抗動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)機(jī)制；此外，桃葉珊瑚苷是否還能通過其他途徑發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] LI B W，XIA Y P，HU B.Infection and atherosclerosis：TLR-dependent pathways[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2020，77（14）：2751-2769.

[2] 于玲，曹麗娟，孫靜，等.蘇木乙酸乙酯提取液靶向調(diào)控miRNA-99a抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制研究[J].中國中醫(yī)急癥，2019，28（4）：585-589.

[3] SPENCE J D，AZARPAZHOOH M R，LARSSON S C，et al.Stroke prevention in older adults：recent advances[J].Stroke，2020，51（12）：3770-3777.

[4] POZNYAK A V，GRECHKO A V，OREKHOVA V A，et al.NADPH oxidases and their role in atherosclerosis[J].Biomedicines，2020，8（7）：206.

[5] LOZHKIN A，VENDROV A E，PAN H，et al.NADPH oxidase 4 regulates vascular inflammation in aging and atherosclerosis[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2017，102：10-21.

[6] 李慧丹，趙文鴿，王學(xué)惠.Nox4在同型半胱氨酸介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化中作用的研究[J].醫(yī)學(xué)信息，2019，32（15）：45-47.

[7] SHEN B Y，ZHAO C X，WANG Y，et al.Aucubin inhibited lipid accumulation and oxidative stress via Nrf2/HO-1 and AMPK signalling pathways[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2019，23（6）：4063-4075.

[8] WANG H，ZHOU X M，WU L Y，et al.Aucubin alleviates oxidative stress and inflammation via Nrf2-mediated signaling activity in experimental traumatic brain injury[J].Journal of Neuroinflammation，2020，17（1）：1-18.

[9] PARK K S.Aucubin，a naturally occurring iridoid glycoside inhibits TNF-α-induced inflammatory responses through suppression of NF-κB activation in 3T3-L1 adipocytes[J].Cytokine，2013，62（3）：407-412.

[10] LEE G H，LEE H Y，CHOI M K，et al.Eucommia ulmoides leaf （EUL） extract enhances NO production in ox-LDL-treated human endothelial cells[J].Biomed Pharmacother，2018，97（1）：1164-1172.

[11] LV P Y，F(xiàn)ENG H，HUANG W H，et al.Aucubin and its hydrolytic derivative attenuate activation of hepatic stellate cells via modulation of TGF-β stimulation[J].Environmental Toxicology and Pharmacology，2017，50：234-239.

[12] 陳昌國，李易，王建飛，等.健脾化濁方通過NOX4/ROS/NF-κB通路調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究[J].中藥藥理與臨床，2019，35（6）：134-139.

[13] ZHANG Y M，LIU Z，ZHOU M，et al.Therapeutic effects of fibroblast growth factor-21 against atherosclerosis via the NF-κB pathway[J].Mol Med Rep，2018，17（1）：1453-1460.

[14] 周麗程，劉先發(fā)，李強(qiáng)，等.小檗堿聯(lián)合辛伐他汀對動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，45（4）：849-854.

[15] VAISAR T，HU J H，AIRHART N，et al.Parallel murine and human plaque proteomics reveals pathways of plaque rupture[J].Circulation Research，2020，127（8）：997-1022.

[16] FARKHONDEH T，AFSHARI R，MEHRPOUR O，et al.Mercury and atherosclerosis：cell biology，pathophysiology，and epidemiological studies[J].Biological Trace Element Research，2020，196（1）：27-36.

[17] YAN L，JIA Q L，CAO H，et al.Fisetin ameliorates atherosclerosis by regulating PCSK9 and LOX-1 in ApoE^-/- mice[J].Experimental and Therapeutic Medicine，2021，21（1）：25.

[18] GUO S H，CHEN X P.The human Nox4：gene，structure，physiological function and pathological significance[J].Journal of Drug Targeting，2015，23（10）：888-896.

[19] SILVIS M J M，DEMKES E J，F(xiàn)IOLET A T L，et al.Immunomodulation of the NLRP3 inflammasome in atherosclerosis，coronary artery disease，and acute myocardial infarction[J].Journal of Cardiovascular Translational Research，2021，14（1）：23-34.

[20] WANG X，HUANG H L，SU C，et al.Cilostazol ameliorates high free fatty acid （FFA）-induced activation of NLRP3 inflammasome in human vascular endothelial cells[J].Artificial Cells，Nanomedicine，and Biotechnology，2019，47（1）：3704-3710.

[21] 張林玲，石偉林.基于NLRP3/caspase-1通路研究黃芩苷對大鼠動(dòng)脈硬化模型的保護(hù)作用[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2020，20（11）：1405-1409.

[22] BHAT O M，KUMAR P U，GIRIDHARAN N V，et al.Interleukin-18-induced atherosclerosis involves CD36 and NF-κB crosstalk in Apo E^–/–mice[J].Journal of Cardiology，2015，66（1）：28-35.

[23] BHASKAR V，YIN J，MIRZA A M，et al.Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice[J].Atherosclerosis，2011，216（2）：313-320.

[24] BALDRIGHI M，MALLAT Z，LI X.NLRP3 inflammasome pathways in atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2017，267（1）：127-138.

[25] POZNYAK A V，MELNICHENKO A A，WETZKER R，et al.NLPR3 inflammasomes and their significance for atherosclerosis[J].Biomedicines，2020，8（7）：205.

[26] ZHOU T，LI S N，YANG L H，et al.Correction for：microRNA-363-3p reduces endothelial cell inflammatory responses in coronary heart disease via inactivation of the NOX4-dependent p38 MAPK axis[J].Aging，2022，14（3）：1589.

[27] MOON J S，NAKAHIRA K，CHUNG K P，et al.NOX4-dependent fatty acid oxidation promotes NLRP3 inflammasome activation in macrophages[J].Nature Medicine，2016，22（9）：1002-1012.

[28] 王蕾，舒旭，伍世揮，等.辛伐他汀對內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶表達(dá)和活性氧生成的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（9）：1276-1278.

[29] ZHUANG T，LIU J，CHEN X L，et al.Endothelial Foxp1 suppresses atherosclerosis via modulation of Nlrp3 inflammasome activation[J].Circulation Research，2019，125（6）：590-605.

（收稿日期：2022-03-03）

（本文編輯郭懷?。?/p>