槲皮素通過ERK1/2信號通路對主動脈夾層小鼠血管平滑肌細胞轉化的作用機制研究

摘要 目的：探討槲皮素通過細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）信號通路對主動脈夾層小鼠血管平滑肌細胞轉化的作用機制。方法：取主動脈夾層模型小鼠進行原代血管平滑肌細胞分離、培養(yǎng)、鑒定，分為對照組、槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組、槲皮素高劑量組。檢測4組細胞增殖活性、細胞遷移能力及α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）、骨橋蛋白（OPN）、基質Gla蛋白（MGP）mRNA表達；檢測磷酸化-p38絲裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）蛋白相對表達量。結果：與對照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組各時段細胞增殖活性明顯降低，劃痕寬度百分比明顯升高，α-SMA、SM22α mRNA表達明顯升高，OPN、MGP mRNA表達明顯降低，p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性，槲皮素高劑量組作用效果最優(yōu)。結論：槲皮素可抑制主動脈夾層小鼠血管平滑肌細胞轉化，降低細胞增殖、遷移能力，其作用機制可能與抑制ERK1/2信號通路有關。

關鍵詞 主動脈夾層；槲皮素；血管平滑肌細胞轉化；細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.13.011

基金項目 河北省2021年度醫(yī)學科學研究課題計劃項目（No.20211358）

作者單位 唐山市工人醫(yī)院（河北唐山 063000），E-mail：mugtjb@163.com

引用信息 馬青，劉建成，李春波.槲皮素通過ERK1/2信號通路對主動脈夾層小鼠血管平滑肌細胞轉化的作用機制研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2023，21（13）：2400-2405.

主動脈夾層是一種較嚴重的主動脈疾病，主要是血液經主動脈壁內膜撕裂口進入血管壁中層，引發(fā)夾層血腫形成，且沿主動脈壁延伸剝離的疾病，患病率、病死率均較高^[1]。研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細胞表型轉化為主動脈夾層發(fā)生發(fā)展重要的病理基礎，即自收縮型轉化為合成型，可促進細胞增殖、遷移^[2]。槲皮素是提取自槲皮甙、蕓香甙及金絲桃甙的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、修復腦血管缺血病灶、調控細胞增殖等藥理學作用^[3]。報道顯示，槲皮素可調控腦血管內皮祖細胞增殖、分化，促進細胞存活^[4]，但關于槲皮素對主動脈夾層血管平滑肌細胞轉化的作用及機制尚無明確報道。本研究探討槲皮素對主動脈夾層小鼠血管平滑肌細胞轉化的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選取20只健康昆明雄性小鼠，4周齡，體質量20～28 g，購自北京科興中維生物技術有限公司，使用許可證號：SYXK（京）2019-0052。試驗前將小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±1）℃、濕度55%、明暗交替（12 h/12 h）動物房，自由獲得飲水、飼料。本研究經動物倫理委員會批準。

1.1.2 試劑、儀器

槲皮素（純度≥98%，西安綠天生物技術有限公司），β-氨基丙腈（日本東京化成工業(yè)株式會社），血管緊張素Ⅱ凍干粉（美國Sigma公司），實時熒光定量分析（real-time fluorescence quantitative analysis，RT-PCR）試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），兔抗小鼠骨橋蛋白（osteopontin，OPN）一抗、Alexa Fluor 488標記抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（深圳子科生物科技有限公司），四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法試劑盒（美國Biovision公司），兔抗小鼠磷酸化-p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK）、磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2（phosphorylated extracellular-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun NH2-terminal kinase，p-JNK）一抗及山羊抗兔IgG二抗[安諾倫（北京）生物科技有限公司]。DSX500光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），Image Quant LAS 4000型化學發(fā)光成像分析儀（美國GE Healthcare公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

將20只小鼠構建主動脈夾層模型^[5]：小鼠以β-氨基丙腈1 g/kg灌胃，每日1次，給藥4周。4周后經腹部皮下植入藥物緩釋泵，注入血管緊張素Ⅱ溶液（以滅菌注射用水將血管緊張素Ⅱ凍干粉制備成1 mg/mL的血管緊張素Ⅱ溶液），注入速度為每分鐘1 μg/kg，給藥1周。實驗結束后剔除建模失敗小鼠。建模成功標準：給藥期間無死亡，給藥后麻醉，斷頸處死，取主動脈進行病理檢查，可見巨大假腔形成，假腔內充盈大量紅細胞，確認主動脈夾層形成（見圖1）。20只小鼠建模成功16只，成功率80.00%。

1.2.2 原代小鼠血管平滑肌細胞分離、培養(yǎng)

采用貼塊法培養(yǎng)。建模成功小鼠以6%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定在鼠板上，打開胸腔，右心房剪開，分離胸主動脈，長約2 cm。縱向剪開分離出的胸主動脈，剪成3 mm小段，置入培養(yǎng)皿晾干，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察貼塊周圍血管平滑肌細胞爬出后，去除貼塊，胰酶消化，細胞密度1×10⁵個/mL，開始傳代。

1.2.3 血管平滑肌細胞純度鑒定

采用免疫熒光法鑒定。細胞傳代時，細胞密度3×10⁴個/mL，接種在6孔板，加入DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，以4%多聚甲醛固定，加0.1% Triton X-100透化細胞，5%牛血清白蛋白封閉1 h，加兔抗小鼠OPN一抗（1∶100），室溫孵育2 h，洗滌。加Alexa Fluor 488熒光標記二抗（1∶1 500），洗滌，中性樹膠封片。熒光顯微鏡下觀察陽性細胞數(shù)，鑒定細胞純度。

1.2.4 細胞分組及處理

取第3代對數(shù)生長期血管平滑肌細胞，細胞密度1×10⁶個/mL，接種于6孔板。CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37 ℃，體積分數(shù)5%，過夜。觀察細胞生長至80%，開始處理。將實驗細胞分為對照組、槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組、槲皮素高劑量組，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組分別以30、60、120 μmol/L槲皮素處理24 h，對照組以等量生理鹽水處理24 h。

1.2.5 細胞增殖活性檢測

采用MTT法檢測。取4組細胞，細胞密度1.0×10⁴個/mL，在96孔板接種，復孔數(shù)均設為5，另設空白孔（僅加20 μL培養(yǎng)液）。各孔培養(yǎng)24、48、72 h時，分別將5 mg/mL的MTT溶液20 μL加入孔內，CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37 ℃，體積分數(shù)5%，時間4 h。隨后將各孔培養(yǎng)上清液清除，加150 μL二甲基亞砜溶液，振蕩10 min。觀察各組酶標儀490 nm波長處吸光度（optical density，OD）值，評估細胞增殖活性。

1.2.6 細胞遷移能力檢測

采用劃痕實驗法檢測。取4組細胞，在6孔板接種，待細胞覆蓋孔板，以200 μL移液器槍頭刮出直徑約200 μm的垂直劃痕。全盤磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，37 ℃，孵育24 h。鏡下記錄細胞劃痕寬度，計算劃痕寬度百分比＝（24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度）×100%。

1.2.7 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）、OPN、基質Gla蛋白（MGP） mRNA表達檢測

采用RT-PCR法檢測。取4組細胞，總RNA以Trizol試劑盒提取，紫外吸收法檢測總RNA濃度，進一步逆轉錄生成cDNA。采用GeneBank基因庫內小鼠α-SMA、SM22α、OPN、MGP基因序列檢測，引物序列詳見表1。反應體系：cDNA Template 2 μL。正向引物、反向引物各1 μL，5×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，蒸餾水補足至20 μL。反應條件：95 ℃，30 s，預變性。95 ℃，5 s，變性；60 ℃，30 s，退火；72 ℃，20 s，延伸。共20個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶，以2^－△△CT計算α-SMA、SM22α、OPN、MGP mRNA相對表達強度。實驗重復5次。

1.2.8 p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白相對表達量檢測

采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測。取4組細胞，提取總蛋白，加RIPA裂解液1 mL充分裂解，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液。考馬斯亮藍法測定蛋白含量，加等體積上樣緩沖液，沸水浴10 min，變性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，脫脂奶粉封閉60 min，洗膜。4 ℃，加兔抗小鼠 p-p38 MAPK（1∶1 000）、p-ERK1（1∶1 000）、p-ERK2（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）一抗，孵育，過夜，洗膜。室溫下加入山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），孵育2 h，洗膜。Image Quant LAS 4000型化學發(fā)光成像分析儀顯影曝光，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值計算目的蛋白表達。實驗重復5次。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 原代血管平滑肌細胞培養(yǎng)及鑒定結果

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第4天、第5天時，可見血管平滑肌細胞自組織塊邊緣長出。傳代后生長速度迅速，部分相鄰細胞融成片，或多層重疊。免疫熒光鑒定顯示，血管平滑肌細胞表達OPN，細胞純度（95.05±2.85）%。詳見圖2。

2.2 4組細胞增殖活性OD值比較

4組細胞增殖活性隨培養(yǎng)時間延長呈升高趨勢（P＜0.05）；4組間24、48、72 h細胞增殖活性差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組24、48、72 h細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，槲皮素高劑量組24、48、72 h細胞增殖活性低于槲皮素低劑量組、中劑量組，槲皮素中劑量組24、48、72 h細胞增殖活性低于槲皮素低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 4組劃痕寬度百分比比較

4組間劃痕寬度百分比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組劃痕寬度百分比升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性，槲皮素高劑量組劃痕寬度百分比高于槲皮素低劑量組、中劑量組，槲皮素中劑量組劃痕寬度百分比高于槲皮素低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖3、表3。

2.4 4組α-SMA、SM22α、OPN、MGP mRNA表達比較

4組間α-SMA、SM22α、OPN、MGP mRNA表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組α-SMA、SM22α mRNA表達明顯升高（P＜0.05），OPN、MGP mRNA表達明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。槲皮素高劑量組α-SMA、SM22α mRNA表達高于槲皮素低劑量組、中劑量組，OPN、MGP mRNA表達低于槲皮素低劑量組、中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；槲皮素中劑量組α-SMA、SM22α mRNA表達高于槲皮素低劑量組，OPN、MGP mRNA表達低于槲皮素低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.5 4組p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白表達比較

4組間p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，槲皮素低劑量組、中劑量組、高劑量組p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，槲皮素高劑量組p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量低于槲皮素低劑量組、中劑量組，槲皮素中劑量組p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量低于槲皮素低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖4、表5。

3 討 論

主動脈夾層起病急，病情兇險，發(fā)病后短時間內就可造成主動脈壁破裂，病死率高。血管平滑肌細胞一直是主動脈夾層發(fā)病機制的研究熱點，其按照功能特性可分為兩種表型，即收縮型、合成型，收縮型可收縮血管，是血管平滑肌細胞成熟類型，合成型則無收縮蛋白，兩種表型在病理條件下可互相轉化。正常情況下機體血管平滑肌細胞多為收縮型，而主動脈夾層組織內血管平滑肌細胞多呈收縮能力弱、增殖及遷移能力較強的合成型^[6]。因此，探尋抑制血管平滑肌細胞表型轉化的有效手段以控制主動脈夾層病變具有重要臨床意義。

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，生物活性強，可促進血管修復，在心血管疾病防治中有較廣闊的應用前景^[7]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可對抗氧化應激造成的內皮細胞凋亡，維持血管內皮細胞生理功能完整性^[8]；槲皮素可抑制高轉移人肝癌細胞（HCCLM3）內基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9表達，控制細胞遷移、侵襲，促進細胞存活^[9]。槲皮素能促進血管平滑肌細胞增殖、遷移，在多種心血管疾病治療中有一定作用^[10]，但有關槲皮素對主動脈夾層血管平滑肌細胞表型轉化的作用尚無相關報道。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素處理后細胞增殖活性降低，劃痕寬度百分比提升，細胞遷移能力減弱，收縮型標志蛋白α-SMA、SM22α mRNA表達升高，合成型標志蛋白OPN、MGP mRNA表達降低，且呈劑量依賴性，提示槲皮素可抑制主動脈夾層小鼠血管平滑肌細胞表型轉化，降低細胞增殖、遷移能力。

ERK1/2信號通路是最早發(fā)現(xiàn)的MAPK信號傳導途徑，在各類細胞因子、生長因子、絲裂原及激素受體活化后信號傳導中發(fā)揮重要作用，所含蛋白包括p38 MAPK、ERK1、ERK2、JNK等^[11]。其中，ERK可經磷酸化多種轉錄因子，對機體各種生命活動進行調控，其表達水平與心血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關。p38 MAPK是一種分子量為38 kD的蛋白，被激活后可轉位入核，特異性調節(jié)JNK蛋白轉錄及表達，最終調控細胞生長、分化及死亡^[12]。有學者提出，抑制ERK1/2信號通路，能減輕高糖誘導的血管平滑肌細胞異常增殖、遷移及凋亡^[13]。趙永波等^[14]研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK/ERK信號通路，可降低血管緊張素Ⅱ刺激的血管平滑肌細胞增殖、遷移能力，抑制主動脈夾層形成。還有報道顯示，槲皮素可經調控ERK1/2信號通路，發(fā)揮血管保護作用^[15]。這些研究均提示，ERK1/2信號通路可能在槲皮素調節(jié)主動脈夾層血管平滑肌細胞轉化中有一定作用。本研究結果顯示，槲皮素處理后p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量降低，效果呈劑量依賴性。而且高劑量槲皮素處理后收縮型標志蛋白α-SMA、SM22α mRNA及合成型標志蛋白OPN、MGP mRNA表達均顯著改變，與ERK1/2信號通路各蛋白表達變化呈良好同步性，說明槲皮素可抑制主動脈夾層小鼠血管平滑肌細胞表型轉化，作用機制可能與抑制ERK1/2信號通路有關。

綜上所述，槲皮素可抑制主動脈夾層血管平滑肌細胞表型轉化，減弱細胞增殖、遷移能力，作用機制可能與抑制ERK1/2信號通路有關。本研究局限之處在于僅對ERK1/2信號通路做出初步分析，尚未明確其他通路的影響，今后仍需進一步深入研究。

參考文獻：

[1] WATANABE K，TAKETOMI Y，MIKI Y，et al.Group V secreted phospholipase A2 plays a protective role against aortic dissection[J].Journal of Biological Chemistry，2020，295（30）：10092-10111.

[2] XU H，DU S N，F(xiàn)ANG B Y，et al.VSMC-specific EP4 deletion exacerbates angiotensin Ⅱ-induced aortic dissection by increasing vascular inflammation and blood pressure[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2019，116（17）：8457-8462.

[3] CHEN K T J，ANANTHA M，LEUNG A W Y，et al.Characterization of a liposomal copper（Ⅱ）-quercetin formulation suitable for parenteral use[J].Drug Delivery and Translational Research，2020，10（1）：202-215.

[4] 孫軍，溫昌明，張保朝，等.槲皮素通過調控PI3K/Akt信號通路對血管內皮祖細胞發(fā)揮保護作用[J].中國藥理學通報，2019，35（1）：85-90.

[5] AICHER B O，ZHANG J，MURATOGLU S C，et al.Moderate aerobic exercise prevents matrix degradation and death in a mouse model of aortic dissection and aneurysm[J].American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology，2021，320（5）：H1786-H1801.

[6] NIEVES-CINTRóN M，F(xiàn)LORES-TAMEZ V A，LE T，et al.Cellular and molecular effects of hyperglycemia on ion channels in vascular smooth muscle[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2021，78（1）：31-61.

[7] 楊榮培，劉增長.槲皮素通過調節(jié)SIRT1/NF-κB通路抑制壓力超負荷大鼠左心室肥厚[J].重慶醫(yī)科大學學報，2020，45（4）：429-435.

[8] XU D，HU M J，WANG Y Q，et al.Antioxidant activities of quercetin and its complexes for medicinal application[J].Molecules，2019，24（6）：1123.

[9] LU J，WANG Z Q，LI S Y，et al.Quercetin inhibits the migration and invasion of HCCLM3 cells by suppressing the expression of p-Akt1，matrix metalloproteinase （MMP） MMP-2，and MMP-9[J].Medical Science Monitor：International Medical Journal of Experimental and Clinical Research，2018，24：2583-2589.

[10] KIM S G，SUNG J Y，KIM J R，et al.Quercetin-induced apoptosis ameliorates vascular smooth muscle cell senescence through AMP-activated protein kinase signaling pathway[J].The Korean Journal of Physiology amp; Pharmacology，2020，24（1）：69.

[11] SIPIETER F，CAPPE B，LERAY A，et al.Characteristic ERK1/2 signaling dynamics distinguishes necroptosis from apoptosis[J].iScience，2021，24（9）：103074.

[12] BENGAL E，AVIRAM S，HAYEK T.p38 MAPK in glucose metabolism of skeletal muscle：beneficial or harmful？[J].International Journal of Molecular Sciences，2020，21（18）：6480.

[13] SHI L L，JI Y，JIANG X Y，et al.Liraglutide attenuates high glucose-induced abnormal cell migration，proliferation，and apoptosis of vascular smooth muscle cells by activating the GLP-1 receptor，and inhibiting ERK1/2 and PI3K/Akt signaling pathways[J].Cardiovascular Diabetology，2015，14：18.

[14] 趙永波，岳月紅，王彥芝，等.miR-4306通過MAPK/ERK信號通路抑制血管緊張素Ⅱ誘導的主動脈夾層的形成[J].華中科技大學學報（醫(yī)學版），2018，47（4）：405-409.

[15] ZUBCIC K，RADOVANOVIC V，VLAINIC J，et al.PI3K/Akt and ERK1/2 signalling are involved in quercetin-mediated neuroprotection against copper-induced injury[J].Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2020，2020：9834742.

（收稿日期：2022-01-06）

（本文編輯郭懷印）