基于COI 基因解析我國茶網(wǎng)蝽種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

摘要：茶網(wǎng)蝽（Stephanitis chinensis）是我國西南茶區(qū)的重要害蟲，近年有入侵成災(zāi)事件發(fā)生。為解析茶網(wǎng)蝽的生態(tài)適應(yīng)機制和成災(zāi)規(guī)律，測定了茶網(wǎng)蝽12 個種群共240 頭成蟲COI 基因序列，利用DnaSP 6.12.03、Arlequin3.5.2.2、MEGA 7.0.26 等軟件進行了遺傳分化程度、基因流（Nm）以及分子變異情況的分析。結(jié)果顯示，茶網(wǎng)蝽12 個地理種群的240 條COI 基因序列共包含75 個變異位點和38 個單倍型，其中僅Hap13 是共享單倍型。茶網(wǎng)蝽總?cè)后w的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）為0.827 79，地理種群的Hd 在0.00～0.85，總?cè)后w的遺傳分化固定系數(shù)（FST）為0.864 26，Nm 為0.039 87，表明我國茶網(wǎng)蝽群體遺傳分化程度較高，基因交流較小。重慶城口、重慶巫溪、湖北恩施、湖北十堰、陜西漢中等5 個種群相互之間遺傳分化程度較低，基因交流頻繁（FST＜0.06，Nm＞4.50），其他種群對之間分化程度較高，基因交流較少（FST＞0.25，Nm＜1.00）。分子變異分析（AMOVA）支持遺傳分化主要來自于不同地理種群之間（86.43%）。Tajima’s D 和Fu’s Fs 中性檢驗支持重慶巴南、湖北恩施種群以及大巴山脈周邊群體發(fā)生過種群擴張事件。本研究分析推測我國茶網(wǎng)蝽兼具入侵種群擴張成災(zāi)和原始種群擴張成災(zāi)的風(fēng)險，建議有茶網(wǎng)蝽發(fā)生的茶區(qū)和大巴山脈周邊茶園加強對該害蟲的監(jiān)測工作。

關(guān)鍵詞：茶網(wǎng)蝽；地理種群；COI 基因；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S571.1；S435.711 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-369X（2023）06-795-11

茶網(wǎng)蝽（Stephanitis chinensis Drake），又名茶脊冠網(wǎng)蝽、茶軍配蟲、白紗娘等，隸屬于半翅目（Hemiptera）網(wǎng)蝽科（Tingidae）。茶網(wǎng)蝽成蟲和若蟲以刺吸式口器刺吸葉片汁液[1]，雌成蟲產(chǎn)卵于葉片組織，均會對茶樹葉片造成直接損傷[2]。此外，茶網(wǎng)蝽在葉片背面留下大量的黑色膠質(zhì)排泄物和蛻殼易滋生霉菌，嚴(yán)重影響茶樹的光合作用[3-4]。茶網(wǎng)蝽為害嚴(yán)重時，會造成茶樹葉片脫落、樹體衰弱、茶芽萌發(fā)緩慢細小甚至發(fā)芽停滯[5-7]，進而影響茶葉的質(zhì)量和產(chǎn)量，導(dǎo)致茶企、茶農(nóng)的收入下降。茶網(wǎng)蝽具有繁殖力強、易擴散和多重危害等特點，但目前對該害蟲最有效的防控措施依然是藥劑防治[5，8-14]。由于氣候影響，重慶茶網(wǎng)蝽田間若蟲孵化期由早期文獻中的4 月上中旬[4，15]提前到3 月中下旬[16]，與春茶生產(chǎn)季的重合期增長，加大了對春茶生產(chǎn)的影響以及田間防治的難度。

茶網(wǎng)蝽一直是我國西南茶區(qū)的重要害蟲[15]，但早年少有其大量發(fā)生為害的報道，在中國知網(wǎng)檢索茶網(wǎng)蝽和茶脊冠網(wǎng)蝽可以發(fā)現(xiàn)2012 年以前僅有3 篇文獻[7，17-18]，2012—2017 年共13篇文獻，其中11 篇有關(guān)于陜西南部地區(qū)茶網(wǎng)蝽的發(fā)生與防治[5-6，9-11]，2018 年之后開始出現(xiàn)恩施及其他地區(qū)發(fā)生與防治技術(shù)的報道[3，8，13-14，16]。茶網(wǎng)蝽近年有明顯的蔓延擴散和暴發(fā)為害的跡象。本研究測定了5 省份下轄共12 個市（區(qū)、縣、州）的茶園的茶網(wǎng)蝽樣本COI 基因序列，并進行種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，有助于從分子水平上解析該害蟲的生態(tài)適應(yīng)機制和成災(zāi)規(guī)律，為各茶區(qū)制定有效的防控策略提供基礎(chǔ)的遺傳學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究測試茶網(wǎng)蝽成蟲和若蟲樣本于2022 年5 月—2023 年10 月采集于重慶、四川、貴州、湖北和陜西5 省份下轄12 個市（區(qū)、縣、州）的茶園（表1）。所采集若蟲均留于原附著枝葉和枝條下端保濕，置于智能人工氣候箱（CX-300h，上海將任實驗設(shè)備有限公司）飼養(yǎng)至羽化。氣候箱溫度為（26±1） ℃，光周期L∶D=14∶10，相對濕度（75±5）%。所有樣本均以成蟲在體視鏡下鑒定種類，浸泡于無水乙醇，置于–20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 提取

取茶網(wǎng)蝽成蟲單頭置于1.5 mL 離心管中，使用滅菌研磨棒研磨至粉末，采用DNeasyBlood amp; Tissue Kit 試劑盒（德國Qiagen 公司）進行基因組DNA 提取。提取產(chǎn)物用NanoVue超微量分光光度計（英國GE Healthcare 公司）檢測質(zhì)量和濃度后置于–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 擴增、測序及拼接

茶網(wǎng)蝽線粒體COI 基因序列的擴增引物參照懸鈴木方翅網(wǎng)蝽（Corythucha ciliata），上下游引物分別為5'-ATTTGGATTATGAGC AGGAATAGT-3'和5'-ATGTAAAATAAGCTCGTGTATCTAC-3'[19]。取2 μL PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序得到的序列使用DNAMAN 軟件進行拼接，拼接完成后的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn 比對，驗證序列的準(zhǔn)確性。

1.4 數(shù)據(jù)整理與分析

利用DnaSP 6.12.03 軟件[20-21]計算茶網(wǎng)蝽不同地理種群的單倍型多樣性指數(shù)（Haplotypediversity，Hd）、核苷酸多樣性（Nucleotidediversity，π）、核苷酸平均差異數(shù)（Averagenumber of nucleotide difference，k）、種群間的遺傳分化固定系數(shù)（FST）等遺傳多樣性指標(biāo)。基因流（Nm）依據(jù)公式Nm=（1－FST）/4FST計算[22]。在Arlequin 3.5.2.2 軟件[23]中使用Tajima’s D[24]和Fu’s Fs[25]統(tǒng)計進行中性檢驗，并進行種群的分子方差分析（ Analysis ofmolecular variance，AMOVA）?；贙imura2-Parameter 模型使用MEGA 7.0.26 軟件計算種群間的遺傳距離[26]。采用Network 10.2 軟件繪制單倍型之間的進化網(wǎng)絡(luò)圖，單倍型的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹使用PhyML 3.0（www.atgc-montpellier.fr/phyml）構(gòu)建[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶網(wǎng)蝽COI 基因序列特征及變異情況

本研究對茶網(wǎng)蝽12 個地理種群共240 頭成蟲進行了DNA 提取，均完成擴增、測試和比對。240 條序列均為808 bp，A+T 含量約為67%，具有明顯的A、T 偏向性，符合昆蟲線粒體核苷酸組成特征。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，COI序列在供試的240 個樣本中保守位點（C）733個，變異位點（V）75 個，約占全長的9.28%，無堿基缺失或插入現(xiàn)象。75 個變異位點中自裔位點（Si）21 個，簡約信息位點（Pi）54個，兩堿基變異（Two variants）位點72 個，三堿基變異（Three variants）位點3 個，共含有38 個單倍型：Hap1～Hap38（圖1）。

2.2 茶網(wǎng)蝽COI 基因序列單倍型及網(wǎng)絡(luò)進化關(guān)系

分析茶網(wǎng)蝽COI 基因序列的38 個單倍型，僅有1 個共享單倍型（Hap13），其出現(xiàn)頻率最高（92 次），占所有個體的38.3%，被城口、巫溪、恩施、十堰和漢中5 個種群共享（表2）。37 個單倍型為獨享單倍型，表明茶網(wǎng)蝽出現(xiàn)了較大程度的遺傳分化。從種群來看，巫溪、廣元、貴陽、六盤水、漢中種群內(nèi)部無突變位點，各自僅有1 種單倍型，其他地理種群的單倍型在2～9 個范圍。利用中介鄰接網(wǎng)絡(luò)算法（Median joining network）構(gòu)建38 個單倍型的進化網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示（圖2），茶網(wǎng)蝽單倍型的進化網(wǎng)絡(luò)呈散射狀，以中介點mv10 為中心，主要分為4 枝向外發(fā)展。由上而下，第1 枝包含11 個單倍型，涵蓋巴南和貴陽的所有單倍型及永川的2 個單倍型；第2 枝僅有3 個單倍型，涵蓋六盤水所有個體及永川剩余的2 個單倍型；第3 枝包含8 個單倍型，以共享單倍型Hap13為中心向外發(fā)展，涵蓋了城口、巫溪、廣元、恩施、十堰和漢中等位于大巴山脈周邊的6 個地理種群的所有單倍型，也是樣本量最大的一枝（共120 頭）；第4 枝包含有最多的單倍型（16個），但地理種群僅包含四川省的宜賓和樂山（圖2A）。單倍型進化網(wǎng)絡(luò)圖沒有顯示出較為明顯的祖先單倍型，也支持了我國茶網(wǎng)蝽遺傳分化程度較大的觀點。38 個單倍型的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，進化網(wǎng)絡(luò)圖中的第2、3、4 枝上的單倍型均以較高的支持率各自聚為同一發(fā)育枝，并互為姊妹群，進化關(guān)系與進化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖對應(yīng)（圖2B）。

2.3 茶網(wǎng)蝽地理種群遺傳多樣性

茶網(wǎng)蝽總?cè)后w的COI 序列單倍型多樣性指數(shù)為0.827 79，核苷酸多樣性指數(shù)為0.017 69，核苷酸平均差異數(shù)為14.290 66（表3）。12個地理種群中，巫溪、廣元、貴陽、六盤水、漢中等5 個地理種群因不具有多態(tài)性位點，各項指數(shù)均為0，表明其內(nèi)部序列保守，遺傳多樣性較低；其余7 個種群的單倍型多樣性指數(shù)在0.100 00～0.847 37，核苷酸多樣性指數(shù)在0.000 12～0.017 83，核苷酸平均差異數(shù)在0.100 00～14.405 26，茶網(wǎng)蝽在這7 個地理種群的遺傳多樣性差異較為明顯，其中永川、巴南、宜賓、樂山4 個種群內(nèi)部多態(tài)性位點較多，遺傳多樣性較高。對有多態(tài)性位點的7 個種群進行Tajima’s D 和Fu’s Fs 中性檢驗，其中巴南和恩施種群的Tajima’s D 值顯著小于0，F(xiàn)u’sFs 值極顯著小于0，說明這兩個種群偏離了遺傳平衡狀態(tài)，可能是種群擴張的結(jié)果。永川、城口、宜賓、樂山、十堰以及所有種群作為整體時的值均為不顯著，說明茶網(wǎng)蝽在這5 個地理種群和總?cè)后w進化都遵循中性進化模型，群體處于較穩(wěn)定狀態(tài)。將圖2A 中以Hap13 為中心進化的6 個種群（城口、巫溪、廣元、恩施、十堰和漢中）作為群體進行檢驗，Tajima’s D和Fu’s Fs 值分別為–1.681 66（P＜0.05）和–5.664 72（P＜0.01），支持該群體發(fā)生過種群擴張事件。茶網(wǎng)蝽總?cè)后w的錯配分布圖有非常明顯的多峰（圖3），支持我國茶網(wǎng)蝽在整體上沒有發(fā)生擴張事件；其SSD 值（期望與觀測錯配分布之間的平方和）為0.038 50，rg 值（Harpending’s raggedness index）為0.046 91，兩個值均較小，且未達到顯著水平，推測我國茶網(wǎng)蝽總?cè)后w可能經(jīng)歷了較弱的突然增長過程。

2.4 茶網(wǎng)蝽地理種群間的遺傳關(guān)系

茶網(wǎng)蝽COI 序列地理種群間的差異程度的遺傳學(xué)參數(shù)通過DnaSP 6.12.03 軟件計算。茶網(wǎng)蝽總?cè)后w的FST 為0.864 26（Plt;0.05），表明我國茶網(wǎng)蝽總體遺傳分化程度較高。各地理種群間的FST 在0.000 00～1.000 00（表4），其中有56 個種群對間FST 有顯著差異，且在0.259 44～1.000 00，表明這些種群對之間遺傳分化程度較高；城口與巫溪、恩施、十堰、漢中種群之間的FST 較小，在0.026 32～0.052 63，說明城口種群與這4 個種群之間的遺傳分化程度很低；巫溪、恩施、十堰、漢中4 個種群相互之間FST 值為0，表明4 個種群相互之間幾乎未發(fā)生遺傳分化。總?cè)后w的Nm 為0.039 87，種群對間的Nm 為0 到無限大，其中除巫溪、恩施、十堰、漢中4 個種群相互間Nm 為無限大；城口與巫溪、恩施、十堰、漢中種群之間的Nm 均大于4.5，推測城口種群與這4 個種群之間基因交流頻繁；其余種群對間的Nm 均小于1，表明這些種群相互間幾乎不發(fā)生基因交流。茶網(wǎng)蝽各地理種群之間的遺傳距離與地理距離相關(guān)性結(jié)果顯示，二者相關(guān)性系數(shù)為0.282（Plt;0.05），說明茶網(wǎng)蝽在不同地理種群間的遺傳分化與地理距離正相關(guān)（圖4）。

綜上所述，我國茶網(wǎng)蝽總?cè)后w遺傳分化程度較高，基因交流較少；而城口、巫溪、恩施、十堰、漢中5 個種群間分化程度較低，基因交流頻繁，其余種群對之間分化程度較高，基因交流較少。

2.5 茶網(wǎng)蝽的分子變異分析

利用Arlequin 3.5.2.2 軟件對茶網(wǎng)蝽的進行分子變異（AMOVA）分析，結(jié)果顯示，COI基因序列在茶網(wǎng)蝽12 個地理種群之間變異方差組分為6.631 03，占總方差比率的86.43%，種群內(nèi)的變異方差組分僅為1.041 45，方差比率為13.57%，P 值均小于0.001，差異極顯著（表5），上述結(jié)果表明，COI 序列在我國茶網(wǎng)蝽這12 個地理種群的遺傳分化主要來自于種群之間，種群內(nèi)部的遺傳分化相對較低，但對遺傳分化的作用不可忽視。

3 討論

本研究對12 個地理種群240 頭茶網(wǎng)蝽成蟲進行了COI 基因序列的擴增測序，共獲得了240 條808 bp 的核苷酸序列，A+T含量約為67%，明顯的A、T 偏向性符合昆蟲線粒體核苷酸組成特征[28-29]，序列中未發(fā)現(xiàn)終止密碼子，經(jīng)比對確認(rèn)為茶網(wǎng)蝽的COI 基因序列[30-31]。

從地理種群的單倍型數(shù)據(jù)來看，永川、巴南、宜賓、樂山4 個種群的單倍型均大于5個，城口、恩施、十堰種群分別為4 個、3 個和2 個，巫溪、廣元、漢中、貴陽和六盤水均僅有1 個單倍型。前人研究認(rèn)為，瓶頸和自然選擇作用通常能影響生物的遺傳多樣性，因此初始種群往往有更高的遺傳多態(tài)性，相反新傳入種群的多態(tài)性較低[32-33]，據(jù)此推斷，處于四川盆地內(nèi)部的永川、巴南、宜賓、樂山4 個種群可能為原始種群，其余種群可能是新入侵種群。早期文獻記載，茶網(wǎng)蝽是西南茶區(qū)的固有害蟲，在四川、云南、貴州均有發(fā)生[15]，2010年傳入陜西南部漢中市和安康市并逐步向北部擴散[5，34]，2012 年在湖北恩施轄區(qū)內(nèi)被初次發(fā)現(xiàn)[3]，并于2017 年暴發(fā)為害，受害茶園面積達0.48 萬hm2[14]。本研究顯示，恩施地區(qū)種群的Tajima’s D 和Fu’s Fs 中性檢驗值均顯著小于0，支持恩施種群發(fā)生過種群擴張事件。單倍型、進化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育樹、遺傳分化系數(shù)分析等均支持城口、巫溪、漢中、恩施、十堰5 個種群間有大量的基因交流，遺傳分化系數(shù)極小。這5 個種群與廣元種群的所有單倍型在進化網(wǎng)絡(luò)圖和系統(tǒng)發(fā)育樹上均聚在一起（圖2），6 個城市均坐落于我國大巴山脈，也位于茶網(wǎng)蝽早期蔓延點四川省萬源市和宣漢縣周邊，推測這6 個種群均為同一種群擴張而來。以這6 個種群作為群體進行中性檢驗，Tajima’s D 和Fu’s Fs 值分別為–1.681 66（Plt;0.05）和–5.664 72（Plt;0.01），支持該群體發(fā)生過種群擴張事件，因此筆者認(rèn)為茶網(wǎng)蝽有入侵種群擴張暴發(fā)為害的風(fēng)險。此外，巴南地區(qū)種群的兩個中性檢驗值也顯著小于0，同樣支持種群發(fā)生過種群擴張。前文分析巴南種群可能為原始種群，因此推測茶網(wǎng)蝽除了有入侵暴發(fā)的風(fēng)險，也有本地原始種群在適宜的生態(tài)環(huán)境下種群擴張暴發(fā)的風(fēng)險。茶網(wǎng)蝽COI序列的38 個單倍型中僅有Hap13 為城口、巫溪、漢中、恩施、十堰種群共享的單倍型，其余37 個單倍型均為獨享單倍型，種群間的FST也多處于較高水平，Nm 較低，均支持我國茶網(wǎng)蝽遺傳分化程度較大。AMOVA 分析表明，遺傳分化主要來自于種群之間。以上數(shù)據(jù)分析支持除大巴山脈周邊5 個種群外，茶網(wǎng)蝽種群之間基因交流較少，推斷該害蟲在茶區(qū)之間相互擴散遷移較少，擴散速度、距離較為有限。茶網(wǎng)蝽若蟲無翅，成蟲有翅但不善飛行[4，15]，其傳播更依賴于風(fēng)力和人類活動。

綜上所述，我國茶網(wǎng)蝽具有入侵暴發(fā)成災(zāi)的風(fēng)險，但其擴散速度和距離較為有限，同時要防范本地原始種群在適宜生態(tài)環(huán)境下快速擴張暴發(fā)成災(zāi)的風(fēng)險。因此，建議大巴山脈周圍無茶網(wǎng)蝽發(fā)生的茶園應(yīng)加強觀測，原發(fā)生區(qū)域在每年3 月下旬到4 月應(yīng)定期開展茶園田間觀測工作，如發(fā)現(xiàn)有茶網(wǎng)蝽傳入或暴發(fā)的跡象，應(yīng)及時采取有效防治措施。

致謝：感謝恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院羅鴻、陜西省漢中市鎮(zhèn)巴縣茶葉技術(shù)指導(dǎo)站唐志剛、湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所焦龍、四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所劉飛、四川省宜賓市茶產(chǎn)業(yè)研究院劉躍云、貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所李帥對本研究樣品收集工作的支持。

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