酚酸介導(dǎo)下連作茶樹(shù)根際病原菌Alternaria sp及其拮抗菌Pseudomonas sp變化

摘要：茶樹(shù)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，然而長(zhǎng)期宿根連作鐵觀音茶園存在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡、病害加重等連作障礙問(wèn)題，探究鐵觀音茶樹(shù)連作障礙形成的分子機(jī)制對(duì)尋求有效的防控技術(shù)具有重要意義。采用微生物分離純化、平板對(duì)峙等方法對(duì)鐵觀音茶樹(shù)根際病原菌及其拮抗菌進(jìn)行分離、鑒定，并對(duì)不同宿根連作年限（0、1、10、20 a）鐵觀音茶樹(shù)根際土壤中的病原菌和拮抗菌數(shù)量進(jìn)行定量分析；同時(shí)運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)分析不同連作年限根際土壤中酚酸含量變化，并模擬土壤中各酚酸配比，研究酚酸類物質(zhì)對(duì)茶樹(shù)根際病原菌及其拮抗菌的影響。結(jié)果顯示，從連作20 a 患病鐵觀音茶樹(shù)根系分離鑒定到1 株病原真菌鏈格孢菌（Alternaria sp.），并從根際土壤中篩選到1 株拮抗菌假單胞菌（Pseudomonas sp.）。熒光定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)，與1 a 茶園相比，20 a 茶園土壤中的鏈格孢菌絕對(duì)含量顯著偏高，而假單胞菌含量卻顯著偏低。連作茶園根際土壤中共檢測(cè)到對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、阿魏酸5 種酚酸類物質(zhì)，其平均配比為38∶229∶11∶11∶3。連作條件下酚酸類物質(zhì)并未在土壤中累積，而是隨種植年限的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。模擬試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中低濃度（30～120 μmol·L-1）的混合酚酸能夠顯著促進(jìn)鏈格孢菌菌絲的生長(zhǎng)，單一酚酸對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸在低濃度（30 μmol·L-1 和60 μmol·L-1）時(shí)也能夠顯著促進(jìn)鏈格孢菌菌絲的生長(zhǎng)。對(duì)羥基苯甲酸對(duì)假單胞菌的生長(zhǎng)有抑制作用，并且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，混合酚酸以及其他單一酚酸對(duì)假單胞菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯作用。由此可見(jiàn)，鐵觀音根系分泌物酚酸類物質(zhì)對(duì)根際土壤關(guān)鍵微生物菌群具有不同的生態(tài)效應(yīng)，是引起微生物群落結(jié)構(gòu)失衡、病害增加等連作障礙問(wèn)題的重要因素。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示鐵觀音茶樹(shù)連作障礙機(jī)理提供一些理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；連作障礙；酚酸類物質(zhì)；鏈格孢菌；假單胞菌

中圖分類號(hào)：S571.1；S435.711 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-369X（2023）06-823-12

我國(guó)是全球最大的茶葉生產(chǎn)與消費(fèi)國(guó)。長(zhǎng)期困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的連作障礙問(wèn)題，在茶樹(shù)栽培中表現(xiàn)也很嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，貴州省的鳥(niǎo)王茶在連作10 a 后茶葉產(chǎn)量開(kāi)始下降，連作11～15 a的產(chǎn)量比連作6～10 a 的降低了69.1%[1]。福建省安溪縣連作20 a 的鐵觀音茶樹(shù)其光合特性、茶葉產(chǎn)量以及品質(zhì)都顯著低于連作10 a 的[2]。為追求經(jīng)濟(jì)利益，大部分茶農(nóng)通過(guò)增施氮肥、噴施農(nóng)藥等措施維持茶葉產(chǎn)量，再結(jié)合茶樹(shù)本身喜酸富鋁的生物學(xué)特性，宿根連作多年后的茶園土壤普遍出現(xiàn)酸化嚴(yán)重、養(yǎng)分非均衡性退化、微生物多樣性減少以及種群結(jié)構(gòu)惡化等生態(tài)環(huán)境問(wèn)題[3-4]，使茶葉生產(chǎn)陷入惡性循環(huán)。因此，探究茶樹(shù)連作障礙形成機(jī)制及其防控措施，對(duì)促進(jìn)茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前，大多數(shù)研究表明，根際土壤微生物區(qū)系惡化以及微生物群落失衡是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要原因。據(jù)報(bào)道，花生[5]、黃瓜[6]、茄子[7]、草莓[8]等作物連作后，根際微生物區(qū)系逐漸由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變，根際病原真菌增加，致使作物發(fā)生嚴(yán)重病害。鐵觀音茶樹(shù)長(zhǎng)期單一種植，也會(huì)引起根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如微生物量減少、群落多樣性降低、代謝能力降低，根際土壤環(huán)境質(zhì)量變差[9]。此外，隨著連作年限增加，鐵觀音茶樹(shù)根際土壤中對(duì)植物生長(zhǎng)有益的細(xì)菌屬[如假單胞菌（ Pseudomonas spp. ）、產(chǎn)黃桿菌（ Rhodanobacter spp. ）、慢生根瘤菌（ Bradyrhizobium spp. ）、分枝桿菌（ Mycobacterium spp. ）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas spp.）]急劇減少，某些病原菌數(shù)量（如鏈格孢菌，Alternaria spp.）卻不斷增加[4，10]。隨著研究的深入，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，植物根系分泌物的間接生態(tài)效應(yīng)及其引起的土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡是導(dǎo)致連作障礙的主要因素[11-12]。據(jù)報(bào)道，黃瓜植株根系分泌物的化感自毒物質(zhì)肉桂酸能抑制根系生長(zhǎng)，增加黃瓜枯萎?。‵usarium oxysporum）的發(fā)病率[13]；西瓜根系分泌物中的精氨酸、組氨酸和苯丙氨酸可誘導(dǎo)多黏類芽孢桿菌SQR-21 對(duì)西瓜根系的趨化性并促進(jìn)其在西瓜根際的有效定殖[14]。可見(jiàn)，根系分泌物在植物-土壤-微生物之間的根際對(duì)話中起重要作用，可以通過(guò)直接或間接方式對(duì)土壤微生物發(fā)揮調(diào)控作用。

酚酸類物質(zhì)是常被報(bào)道的重要化感物質(zhì)，在作物連作障礙形成過(guò)程中起重要作用[15]。連作7 a 黃瓜土壤中香草酸、對(duì)羥基苯甲酸和阿魏酸總含量顯著高于正茬和重茬3 a 土壤中的含量，外源添加酚酸類物質(zhì)至盆栽基質(zhì)中，可使黃瓜幼苗根長(zhǎng)及莖粗顯著降低，使株高及干物質(zhì)量略有下降[16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜化感自毒物質(zhì)香豆酸能顯著促進(jìn)土壤中病原菌尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)繁殖[17]。草莓苗期枯萎病的發(fā)生與阿魏酸密切相關(guān)，相對(duì)高濃度（50～100 mg·L-1）的阿魏酸能誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌的增殖進(jìn)而引發(fā)病害[18]?？梢?jiàn)，酚酸類物質(zhì)是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要原因。然而，目前對(duì)連作條件下茶樹(shù)根系分泌物酚酸類物質(zhì)的含量變化及其對(duì)根際關(guān)鍵微生物的調(diào)控作用尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

課題組前期通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，假單胞菌（有益菌）和鏈格孢菌（病原菌）是鐵觀音茶樹(shù)根際的優(yōu)勢(shì)菌，并且隨著連作年限的增加，假單胞菌豐度急劇減少，而鏈格孢菌豐度卻有增加的趨勢(shì)[4，10]。因此，本研究首先分離、篩選與鐵觀音茶樹(shù)連作障礙密切相關(guān)的關(guān)鍵病原菌及其拮抗菌，并對(duì)其進(jìn)行定量分析。同時(shí)，運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)分析不同連作年限根際土壤中酚酸含量變化，并模擬根際土壤中各酚酸配比，研究酚酸類物質(zhì)對(duì)茶樹(shù)根際病原菌及其拮抗菌的影響。以期為深入揭示鐵觀音茶樹(shù)連作障礙形成的分子生態(tài)學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤取樣

在福建省安溪縣感德鎮(zhèn)鐵觀音茶園定點(diǎn)觀測(cè)試驗(yàn)站（25°18′ N，117°51′ E）內(nèi)，選取海拔高度、坡向、坡位以及管理水平基本一致的1、10、20 a 茶園各3 個(gè)，小區(qū)面積不小于15 m×15 m，鄰近未種植過(guò)茶樹(shù)的荒地土壤作為對(duì)照（0 a）。于2020 年5 月3 日采用5 點(diǎn)取樣法對(duì)根際土壤進(jìn)行取樣，用于微生物實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR）分析和酚酸提取與測(cè)定。

1.2 病原微生物的分離與鑒定

采用組織分離法篩選病原微生物。將患根腐病的鐵觀音茶樹(shù)根系先用自來(lái)水沖洗干凈，再在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌水清洗。將病原菌侵染的根部切成薄片，用75%的乙醇浸泡30～40 s，然后用無(wú)菌水沖洗3 次，接種在MS 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)，分離單菌落。采用CTAB 法對(duì)真菌基因組DNA 進(jìn)行提取，PCR 擴(kuò)增采用通用引物為ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTG CG G-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3'）。

PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括5.0 μL 10×Buffer（含2.5 mmol·L-1 Mg2+），1.0 μL Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1），1.0 μL dNTP（10 mmol·L-1），1.5 μL ITS1 引物（10 μmol·L-1），1.5 μL ITS4引物（10 μmol·L-1），1 μL 基因組DNA 和39 μLddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶樣品送至上海派森諾基因科技有限公司純化并測(cè)序。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，將獲得的準(zhǔn)確序列遞交至GenBank獲得登錄號(hào)，使用MEGA 7.0 軟件（Neighborjoining，NJ 鄰位相連法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，抽樣次數(shù)為1 000。

1.3 拮抗菌的篩選與鑒定

將活化的病原真菌接種于馬鈴薯蔗糖瓊脂（Potato sucrose agar，PSA）培養(yǎng)基平板中心位置，在距離中心2.5 cm 處的4 個(gè)方向分別接種一株活化培養(yǎng)的細(xì)菌（前期從連作鐵觀音根際土壤中篩選到的微生物），置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，觀察抑菌圈的形成，分離篩選對(duì)病原真菌有拮抗效應(yīng)的細(xì)菌。

對(duì)分離篩選到的拮抗菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。PCR 擴(kuò)增采用細(xì)菌16 S rDNA 通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括5.0 μL 10×Buffer（含2.5 mmol·L-1 Mg2+），1.0 μL Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1），1.0 μL dNTP（10 mmol·L-1），1.5 μL 27F 引物（10 μmol·L-1），1.5 μL 1492R引物（10 μmol·L-1），1 μL 基因組DNA 和39 μLddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。將電泳檢測(cè)的目的條帶進(jìn)行膠回收并送至上海派森諾基因科技有限公司測(cè)序。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 微生物致病性的驗(yàn)證

基于前期已建立的鐵觀音無(wú)菌組培苗體系，向鐵觀音組培苗中添加已活化的病原菌和拮抗菌，對(duì)照組加入等量的液體培養(yǎng)基代替，將組培苗置于光照培養(yǎng)箱觀察其生長(zhǎng)情況。

1.5 土壤關(guān)鍵菌群qPCR 分析

土壤總DNA 采用BioFast 土壤基因組DNA 提取試劑盒（杭州博日科技股份有限公司）進(jìn)行提取。鏈格孢菌qPCR 定量正向引物序列為5'-GCCCACCACTAGGACAAACA-3'，反向引物序列為5'-TCCCTACCTGATCCGAGGTC-3'。假單胞菌qPCR 定量引物序列為Ps-for（5'-GGTCTGAGAGGATGATCAGT-3'）和Ps-rev（5'-TTAGCTCCACCTCGCGGC-3'）。反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 2×SYBR GreenI SuperReal Premix，上下游引物各0.5 μL，10 ngDNA 模板，ddH2O 補(bǔ)足到20 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

將特異引物擴(kuò)增的目的片段與pMD-19T載體連接，經(jīng)感受態(tài)轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆挑選、質(zhì)粒提取獲得含有目的片段的質(zhì)粒，用于制備各關(guān)鍵菌群qPCR定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在對(duì)不同連作年限鐵觀音根際土壤中各關(guān)鍵菌群的含量進(jìn)行分析時(shí)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較進(jìn)行計(jì)算。

1.6 土壤酚酸提取及HPLC 分析

稱取5 g 鐵觀音茶樹(shù)根際土壤，加入20 mL1 mol·L-1 NaOH 溶液，放置于搖床上（25 ℃，180 r?min- 1） 振蕩12 h，再漩渦振蕩30 min，離心棄沉淀，上清液用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至2.5，再次離心收集上清液，用等體積乙酸乙酯萃取5 次，收集有機(jī)相（上層），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液蒸干（溫度35 ℃），用5 mL 色譜級(jí)甲醇復(fù)溶，–80 ℃避光保存?zhèn)溆没蛄⒓从糜贖PLC 分析。

運(yùn)用HPLC 技術(shù)對(duì)酚酸含量進(jìn)行定量分析，待檢測(cè)的酚酸包括沒(méi)食子酸、香豆酸、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸。色譜條件如下：C18 色譜柱（Inertsil ODS-SP，4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A 為甲醇，流動(dòng)相B 為2%冰醋酸溶液，洗脫梯度為72%流動(dòng)相B 等梯度洗脫，柱箱溫度為30 ℃，流速為0.7 mL?min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

1.7 酚酸類物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)

基于鐵觀音根系分泌物酚酸類物質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果，依據(jù)各酚酸在根際土壤中的平均配比（對(duì)羥基苯甲酸∶香草酸∶丁香酸∶香蘭素∶阿魏酸=38∶229∶11∶11∶3）制備一系列單一酚酸和混合酚酸濃度梯度為0、30、60、120、240、480、960 μmol·L-1 的酚酸-PDA 平板。制備方法如下：將稀釋8 倍的PDA 培養(yǎng)基（1/8 PDA）滅菌后冷卻至40～50 ℃，然后加入適量經(jīng)0.22 μm超濾膜除菌過(guò)濾的各酚酸儲(chǔ)備液（甲醇溶解后加水定容），立即倒平板，冷卻凝固后獲得不同酚酸濃度梯度的酚酸-PDA 平板。將已活化培養(yǎng)的鏈格孢菌菌餅接種于酚酸-PDA 平板中心位置，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d 后，測(cè)量菌絲直徑。對(duì)照組以添加雙蒸水代替，同時(shí)加入與試驗(yàn)組等量的甲醇以排除甲醇對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.8 酚酸類物質(zhì)對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)

制備一系列單一酚酸和混合酚酸濃度梯度為0、30、60、120、240、480、960 μmol·L-1的1/8 LB 培養(yǎng)基。制備方法如下：配制1/8濃度LB 培養(yǎng)基，每支試管分裝39.5 mL，121 ℃ 高溫高壓滅菌20 min 后冷卻至40～50 ℃，然后分別向試管中加入0.5 mL 經(jīng)0.22 μm 超濾膜除菌過(guò)濾的單一酚酸或混合酚酸儲(chǔ)備液。每支試管接種10 μL 已活化的假單胞菌菌液，置于37 ℃，180 r·min-1 搖床中培養(yǎng)8 h，取200 μL 菌液于96 孔酶標(biāo)板中，測(cè)定OD600 的吸光值。對(duì)照組以添加雙蒸水代替，同時(shí)加入與試驗(yàn)組等量的甲醇以排除甲醇對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)的影響。每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007 和Matlab 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。采用單因素（One-way ANOVA）和Duncan 法進(jìn)行方差分析和多重比較（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌和拮抗菌的分子鑒定及致病性驗(yàn)證

病原真菌F26 測(cè)序獲得的DNA 片段長(zhǎng)度為532 bp，提交至GenBank 中的NCBI 登錄號(hào)為OR462358。通過(guò)BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與GenBank 中Alternaria alternata 的序列相似度高達(dá)100%，結(jié)合基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1），確定該菌屬于鏈格孢菌屬。

采用平板對(duì)峙方法分離篩選對(duì)病原菌有拮抗效應(yīng)的細(xì)菌，其中T4 菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗性（圖2）。該菌株經(jīng)測(cè)序獲得的DNA 片段長(zhǎng)度為1 410 bp，提交至GenBank 中的NCBI登錄號(hào)為OR462360。通過(guò)BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與GenBank 中Pseudomonas koreensi的序列相似度高達(dá)99.43%，結(jié)合基于16 SrRNA 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），確定該菌屬于假單胞菌屬。

將分離到的病原菌和拮抗菌與鐵觀音茶樹(shù)組培苗進(jìn)行共培養(yǎng)，病原菌Alternaria sp.（F26）對(duì)鐵觀音組培苗有較強(qiáng)的致病性（圖4A），拮抗菌Pseudomonas sp.（T4）對(duì)鐵觀音組培苗無(wú)致病性（圖4B）。

2.2 不同連作年限根際土壤關(guān)鍵菌群含量變化

對(duì)不同連作年限茶樹(shù)根際土壤中的關(guān)鍵菌群鏈格孢菌和假單胞菌進(jìn)行qPCR 分析發(fā)現(xiàn)，與1 a 茶園相比，10 a 和20 a 茶園中鏈格孢菌的絕對(duì)含量顯著增加；而20 a 茶園中假單胞菌的絕對(duì)含量顯著低于1 a 和10 a 茶園（表1）?？梢?jiàn)，鐵觀音茶樹(shù)宿根連作導(dǎo)致根際土壤病原菌數(shù)量增多，有益菌數(shù)量減少，這與前期高通量測(cè)序結(jié)果一致[4，10]。

2.3 不同連作年限根際土壤酚酸含量變化

不同宿根連作年限鐵觀音根際土壤中共檢測(cè)到5 種酚酸類物質(zhì)，分別為對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素和阿魏酸（圖5）。種植鐵觀音茶樹(shù)根際土壤的酚酸含量要高于對(duì)照土壤。隨著連作年限的增加，對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸并未在土壤中累積，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。與1 a 和10 a 茶園土壤相比，20 a 茶園土壤中對(duì)羥基苯甲酸含量分別顯著降低了53.20%和45.26%，香草酸含量分別顯著降低了9.88%和10.86%。依據(jù)測(cè)定結(jié)果，可以得到5 種酚酸類物質(zhì)在鐵觀音根際土壤中的平均配比為對(duì)羥基苯甲酸∶香草酸∶丁香酸∶香蘭素∶阿魏酸=38∶229∶11∶11∶3。

2.4 酚酸類物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響

設(shè)定一系列混合酚酸和單一酚酸的濃度梯度（0、30、60、120、240、480、960 μmol·L-1），分析室內(nèi)模擬連作條件下，單一或混合酚酸物質(zhì)對(duì)病原菌鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，中低濃度的混合酚酸（30～120 μmol·L-1）對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用（圖6）。當(dāng)混合酚酸濃度為240 μmol·L-1 時(shí)，對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)作用不明顯；而濃度高于480 μmol·L-1 時(shí)，對(duì)其菌絲生長(zhǎng)有抑制作用。5種單一酚酸對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響不同，其中：（1）對(duì)羥基苯甲酸和丁香酸表現(xiàn)出低促高抑的作用，即在中低濃度（30～120 μmol·L-1）時(shí)促進(jìn)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)，在高濃度（480 μmol·L-1和960 μmol·L-1）時(shí)抑制菌絲生長(zhǎng)；（2）香草酸只有在30 μmol·L-1 時(shí)顯著促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，在高濃度（480 μmol·L-1 和960 μmol·L-1）時(shí)顯著抑制菌絲生長(zhǎng)；（3）香蘭素在高濃度（480 μmol·L-1和960 μmol·L-1）時(shí)對(duì)菌絲生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用；（4）阿魏酸對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，只有高濃度（960 μmol·L-1）時(shí)抑制其生長(zhǎng)。

綜上所述，并非所有酚酸都對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

2.5 酚酸類物質(zhì)對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)的影響

同樣設(shè)定0、30、60、120、240、480、960 μmol·L-1 濃度梯度的單一酚酸和混合酚酸，分析其對(duì)有益拮抗菌假單胞菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度梯度的混合酚酸對(duì)假單胞菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響（圖7）。同時(shí)，不同濃度梯度的單一酚酸對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)的影響不同，其中：（1）對(duì)羥基苯甲酸對(duì)假單胞菌的生長(zhǎng)有抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)；（2）香草酸對(duì)假單胞菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，特別在120 μmol·L-1 和240 μmol·L-1濃度下促進(jìn)作用顯著；（3）丁香酸、阿魏酸、香蘭素對(duì)假單胞菌的生長(zhǎng)基本沒(méi)有明顯影響?？梢?jiàn)，酚酸類物質(zhì)對(duì)病原真菌和有益拮抗菌的生長(zhǎng)具有不同的生態(tài)效應(yīng)。

3 討論

酚酸類物質(zhì)是一種常見(jiàn)的化感物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，隨著大豆[19]、蘋(píng)果[20]、草莓[21]、茄子[22]等作物連作年限的增加，酚酸類物質(zhì)會(huì)在土壤中累積，對(duì)作物生長(zhǎng)有明顯抑制作用，是導(dǎo)致這些農(nóng)作物連作障礙發(fā)生的重要原因。但進(jìn)一步量化測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)在田間條件下很難達(dá)到抑制作物生長(zhǎng)發(fā)育所需的濃度[12]。

因此，之前的研究方法和思路過(guò)分強(qiáng)調(diào)根系分泌物的直接生理作用，并且受試濃度往往過(guò)高（與田間自然狀況下的實(shí)際濃度不符），同時(shí)也未考慮到土壤的吸附過(guò)程以及土壤微生物分解利用等過(guò)程[23]。事實(shí)上，作物根系分泌的酚酸類物質(zhì)釋放到土壤后可能被微生物分解、轉(zhuǎn)化和加工[24]。Lin 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，將水稻的主要化感化學(xué)物質(zhì)（對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、香草酸、肉桂酸）添加到土壤中3～7 d 后，這些酚酸減少了50%～90%，這可能與土壤微生物的分解和利用有關(guān)。有研究表明，土壤中酚酸累積及其對(duì)作物生長(zhǎng)的抑制作用并不是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的直接原因，很可能是由于酚酸介導(dǎo)下作物和特定微生物之間的相互作用造成的[26]。本研究中，隨著連作年限的增加，茶園根際土壤中的對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素含量并未在土壤中持續(xù)累積，而且對(duì)羥基苯甲酸和香草酸在連作20 a 茶園土壤中的含量顯著低于1 a 和10 a茶園土壤，這可能是由于不同連作年限下鐵觀音茶樹(shù)根系分泌強(qiáng)度不同以及土壤微生物分解代謝綜合作用的結(jié)果。Zhou 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，連作7 a 的黃瓜生物量最低、連作障礙問(wèn)題最為嚴(yán)重，然而7 a 后作物生物量又逐漸增加，連作障礙有所緩解；此外，土壤總酚、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸等酚酸類物質(zhì)含量也都呈現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，說(shuō)明黃瓜連作障礙問(wèn)題并不是由于連作土壤中高濃度酚酸類物質(zhì)直接作用導(dǎo)致的，可能是酚酸類物質(zhì)通過(guò)改變微生物區(qū)系來(lái)間接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

鏈格孢菌是一種普遍存在于環(huán)境中的病原體和腐生菌，在三七根腐病、草坪根腐病中都有分離鑒定到[27-28]。本研究從20 a 茶齡的患病鐵觀音根系分離鑒定到1 株鏈格孢菌，并驗(yàn)證了該菌對(duì)鐵觀音茶樹(shù)的致病性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，較低濃度的對(duì)羥基苯甲酸（60 μmol·L-1）、香草酸和丁香酸（30 μmol·L-1）能顯著促進(jìn)鏈格孢菌菌絲的生長(zhǎng)，中低濃度（30～120 μmol·L-1）的混合酚酸也能顯著促進(jìn)鏈格孢菌菌絲的生長(zhǎng)，說(shuō)明土壤中酚酸類物質(zhì)有促進(jìn)病原菌鏈格孢菌增殖的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，與作物個(gè)體相比，病原菌對(duì)酚酸類物質(zhì)及其濃度更加敏感，土壤中酚酸類物質(zhì)還未達(dá)到對(duì)作物致害的濃度時(shí)，微生物群落結(jié)構(gòu)已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生變化[29]。在黃瓜[17]、草莓[18]、西瓜[30]和甜瓜[31]等作物的研究中也發(fā)現(xiàn)，根系分泌物酚酸類物質(zhì)可以顯著促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致土壤傳播疾病的增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲酸對(duì)拮抗菌假單胞菌的生長(zhǎng)有抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，對(duì)羥基苯甲酸對(duì)病原真菌和有益拮抗菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出不同的作用。Wu 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，太子參根系分泌的8 種酚酸類物質(zhì)能促進(jìn)病原菌大量生長(zhǎng)，抑制有益菌的生長(zhǎng)繁殖，從而導(dǎo)致土壤特殊菌群失衡，與本研究結(jié)果相似。

本研究對(duì)根際關(guān)鍵微生物菌群進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，根際土壤病原菌數(shù)量增多，有益菌數(shù)量減少，這可能與鐵觀音茶樹(shù)根系分泌物酚酸類物質(zhì)可以選擇性地促進(jìn)或抑制病原菌和有益菌的生長(zhǎng)有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為調(diào)節(jié)根部微生物群落以提高鐵觀音茶葉產(chǎn)量和可持續(xù)生產(chǎn)提供了新的思路。今后可以通過(guò)施用微生物肥料和有機(jī)改良劑來(lái)保持茶園根際土壤中微生物群落的平衡，或通過(guò)調(diào)控根系分泌物等方法緩解茶園連作障礙問(wèn)題。

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