全自動(dòng)固相萃取結(jié)合UPLC-MS/MS 測(cè)定茶葉中的草甘膦及其代謝物

摘要：建立超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的分析方法。用水-二氯甲烷體系對(duì)樣品進(jìn)行提取和初步除雜，在全自動(dòng)固相萃取儀中通過聚苯乙烯鍵合苯磺酸混合型陽(yáng)離子交換柱進(jìn)一步凈化樣品溶液基質(zhì)，利用正交試驗(yàn)和方差分析得出最優(yōu)的衍生條件為5%硼酸鈉緩沖溶液和10 mg·mL-1 的9-芴基甲基三氯甲烷（FMOC-Cl）衍生劑在室溫下衍生2 h，衍生后的樣品溶液在HSS T3 色譜柱和5 mmol·L-1 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈流動(dòng)相體系下進(jìn)行梯度洗脫分離，經(jīng)UPLC-MS/MS 進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量分析。草甘膦和氨甲基膦酸在0.2～50 ng·mL-1 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，該方法的檢出限為2 μg·kg-1，定量限為5 μg·kg-1。低、中、高3 個(gè)加標(biāo)水平（5、50 μg·kg-1 和250 μg·kg-1）的回收率為94.2%～106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～4.9%。該方法具有高效率、高準(zhǔn)確度、高通量、基質(zhì)干擾小和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)室日常大批量茶葉樣品篩查草甘膦及氨甲基膦酸殘留的工作需求。

關(guān)鍵詞：草甘膦；氨甲基膦酸；全自動(dòng)固相萃取儀；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

中圖分類號(hào)：S571.1；S482 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-369X（2023）06-857-13

草甘膦（Glyphosate，Gly）是20 世紀(jì)70年代由孟山都公司發(fā)明的一種除草劑，由于其獨(dú)特的毒理作用方式、具有快速轉(zhuǎn)移至植物體內(nèi)且無(wú)法解毒等特性，因而具有廣譜性、非選擇性和高效性，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)田中，成為目前全球使用量最大的除草劑。草甘膦在植物中的作用方式是通過抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS），從而影響重要的芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的產(chǎn)生，阻礙蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，并最終導(dǎo)致細(xì)胞混亂和死亡[1]。草甘膦對(duì)其他生物的毒害作用仍存在較大的爭(zhēng)議[2]，草甘膦的大量使用不僅會(huì)使其在土壤中殘留，還會(huì)隨雨水和灌溉水等污染地下水，最終通過食物鏈富集進(jìn)入人體，產(chǎn)生潛在毒性[3-4]。相關(guān)研究顯示，草甘膦不僅對(duì)小鼠肝細(xì)胞色素酶活性有抑制作用[5]；還能明顯地誘發(fā)黃鱔染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變率上升[6]；使經(jīng)口染毒小鼠的精子形態(tài)發(fā)生畸變[7]；對(duì)人體產(chǎn)生潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)[8-10]。我國(guó)作為茶樹種植大國(guó)和茶葉主要出口國(guó)，通過化學(xué)農(nóng)藥防治茶樹病蟲害，極易造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)[11]。其中，草甘膦作為常用且大量使用的除草劑，歐盟規(guī)定其最大殘留限量為2.0 mg·kg-1，而我國(guó)GB 2763—2021 則規(guī)定了更為嚴(yán)格的最大殘留限量為1.0 mg·kg-1，予以保障我國(guó)茶葉質(zhì)量安全和茶葉出口貿(mào)易的穩(wěn)定發(fā)展。

草甘膦因其結(jié)構(gòu)上含有氨基和膦酸基兩性極性基團(tuán)而具有強(qiáng)親水性，容易發(fā)生降解并產(chǎn)生代謝物氨甲基膦酸（Aminomethylphosphonicacid，AMPA）[12]。目前的檢測(cè)方法主要有免疫檢驗(yàn)法[13]、氣相色譜法[14]、高效液相色譜法[15]、毛細(xì)管電泳法[16]、離子色譜法[17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[19-20]，但其中大部分的檢測(cè)方法前處理過程繁雜，日常可操作性低，靈敏度低，檢出限/定量限高。其中，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，因具有高靈敏度和高選擇性，是目前常用的檢測(cè)方法。茶葉基質(zhì)復(fù)雜，茶湯中含有大量色素、多酚類、生物堿、多糖和氨基酸等化合物，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法存在基質(zhì)干擾效應(yīng)[21]，因此高效快捷地凈化茶葉中的干擾基質(zhì)非常關(guān)鍵。目前我國(guó)尚未實(shí)施檢測(cè)茶葉中草甘膦的相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，而GB 2763—2021中所推薦的SN/T 1923—2007 在日常試驗(yàn)操作時(shí)，存在過程繁雜、試劑復(fù)雜多樣、凈化柱價(jià)格高、洗脫液中水難以蒸干、衍生時(shí)間過長(zhǎng)和重現(xiàn)性差等問題。因此，建立一種針對(duì)茶葉基質(zhì)的高效、可靠和便捷的檢測(cè)方法，對(duì)于提高茶葉市場(chǎng)監(jiān)督效率和保障人們飲茶健康具有重大意義。

現(xiàn)有對(duì)凈化方法的研究多采用QuEChERS 法[22-23]和專用柱固相萃取法[24-25]，并取得了一定成效。其中QuEChERS 法需要嚴(yán)格控制凈化材料的量值和種類；傳統(tǒng)固相萃取柱凈化時(shí)需進(jìn)行繁雜的洗脫、濃縮等步驟；草甘膦專用柱能有效縮短凈化流程，但成本較高，不適用于日常大批量檢驗(yàn)。因此，本研究探索一種采用實(shí)驗(yàn)室常見且價(jià)格較低的固相萃取柱進(jìn)行過濾式凈化的方法，柱子可吸附多酚、色素、生物堿和氨基酸等干擾雜質(zhì)，同時(shí)對(duì)草甘膦和氨甲基膦酸的保留作用較小，并配合內(nèi)標(biāo)法定量以校正目標(biāo)化合物的損失，做到無(wú)需洗脫和濃縮，凈化液直接進(jìn)行快速衍生后上機(jī)測(cè)定，在保證成本效益的同時(shí)大大縮短試驗(yàn)時(shí)間。

本研究采用一級(jí)水對(duì)茶葉樣品中的草甘膦和氨甲基膦酸進(jìn)行提取，使用二氯甲烷初步除雜，經(jīng)全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行凈化，探究UPLC-MS/MS 的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)、液相色譜條件、最佳的衍生反應(yīng)條件，對(duì)比不同固相萃取柱的凈化效果以及不同種類茶葉的基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME），用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，運(yùn)用正交試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)方案，并結(jié)合SPSS 數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)用，以期建立一個(gè)應(yīng)用于茶葉基質(zhì)中草甘膦和氨甲基膦酸的高效、準(zhǔn)確和高靈敏度的檢測(cè)方法，為今后相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)參考，亦為茶葉的市場(chǎng)監(jiān)管效率和茶葉市場(chǎng)安全提供技術(shù)理論保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

ExionLC 液相色譜儀、SCIEX Triple Quad5500+三重四極桿質(zhì)譜儀，美國(guó)AB SCIEX 公司；Fotector 高通量全自動(dòng)固相萃取儀，中國(guó)睿科集團(tuán)股份有限公司；BC-1000 渦旋振蕩儀，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司；CPX880H-C超聲波清洗機(jī)，美國(guó)Branson 公司；3k15 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；MiniSpin 離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司。

1.2 材料與試劑

草甘膦、氨甲基膦酸（純度99.9%）、同位素內(nèi)標(biāo)1，2-13C15N 草甘膦（100 μg·mL-1）購(gòu)自北京曼哈格生物科技有限公司；二氯甲烷、甲酸（色譜純）、硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O，優(yōu)級(jí)純）購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）購(gòu)自德國(guó)默克公司；9-芴基甲基三氯甲烷（FMOC-Cl，分析純）購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；乙酸銨（色譜純）購(gòu)自山東西亞化學(xué)股份有限公司。茶葉樣品為東莞市市場(chǎng)監(jiān)管抽檢樣品及部分市場(chǎng)自購(gòu)。

C18 固相萃取柱（500 mg/6 mL），北京艾杰爾科技有限公司； 親水親脂平衡小柱（Hydrophile-lipophile balance，HLB）、混合陰離子交換柱（Mixed-mode anion exchanger，MAX）、混合陽(yáng)離子交換柱（ Mixed-modecation exchanger，MCX）（500 mg/6 mL），美國(guó)Waters 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑的配制

1 mg·mL-1 草甘膦、氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg 草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，于4 ℃冰箱中避光保存。

10 μg·mL-1 草甘膦、氨甲基膦酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別準(zhǔn)確移取100 μL 草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 mg·mL-1）于10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，于4 ℃冰箱中避光保存。

10 μg·mL-1 1，2-13C15N 草甘膦內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確移取1.00 mL 1，2-13C15N草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1）于10 mL 容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，于4 ℃冰箱中避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以水和空白茶葉基質(zhì)提取液為稀釋液，逐級(jí)稀釋，加入適量的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成草甘膦和氨甲基膦酸的質(zhì)量濃度為0.2、1、2、5、10、20、50 ng·mL-1 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中內(nèi)標(biāo)1，2-13C15N 草甘膦的質(zhì)量濃度為20 ng·mL-1，配制完成后與樣品一起進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

硼酸鈉溶液：分別稱取3.0、5.0、7.0 g硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O），用水溶解并定容至100 mL，配制濃度分別為3%、5%、7%。FMOC-Cl 乙腈溶液：分別稱取0.1、0.5、1.0 g FMOC-Cl，采用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為1、5、10 mg·mL-1 的FMOC-Cl 乙腈溶液。

1.4 樣品前處理

提?。悍Q取粉碎后的茶葉樣品1.0 g，加入10 μg·mL-1 的1，2-13C15N 草甘膦內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液20 μL，加10 mL 水于50 mL 塑料離心管中，混勻，超聲20 min，再加入10 mL 二氯甲烷，渦旋振蕩1 min，于9 500 r·min-1 離心5 min，上清液待凈化。

凈化：分別移取6 mL 甲醇和6 mL 水依次活化固相萃取柱，取3 mL 待凈化液上樣，棄去凈化液，再取2 mL 待凈化液上樣，收集凈化液，混勻，待衍生。

衍生：取上述凈化液及各標(biāo)準(zhǔn)工作曲線點(diǎn)500 μL，加入200 μL 5%硼酸鈉溶液，渦旋混勻1 min，加入300 μL 衍生劑10 mg·mL-1FMOC-Cl 乙腈溶液，室溫衍生2 h，10 000 r·min-1下離心5 min，衍生液過0.22 μm 濾膜，進(jìn)UPLC-MS/MS 分析檢測(cè)。

1.5 全自動(dòng)固相萃取儀方法

固相萃取方法在全自動(dòng)固相萃取儀中的參數(shù)設(shè)置如表1 所示。

1.6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱為WATERS ACQUITY UPLC?HSS T3 柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動(dòng)相A 為5 mmol·L-1 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B 為乙腈，進(jìn)樣量為5.00 μL，柱溫為40 ℃，液相色譜洗脫程序如表2 所示。

質(zhì)譜電離方式為正離子模式（ESI+），掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），電離電壓（IS）為5 500 V，輔助加熱器溫度為550 ℃，氣簾氣（CUR）為35 psi，碰撞氣（CAD）為7 psi，霧化氣（GAS1）為50 psi，輔助氣（GAS2）為50 psi。

1.7 數(shù)據(jù)處理

通過AB SCIEX 上機(jī)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采用MultiQuant 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計(jì)算，使用Origin 2021 軟件繪制總離子流圖；采用WPS Office 計(jì)算回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以及繪制柱狀圖等；運(yùn)用SPSS 24.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將草甘膦、氨甲基膦酸和1，2-13C15N 草甘膦內(nèi)標(biāo)單標(biāo)溶液按照1.4 章節(jié)中的衍生方法進(jìn)行衍生，分別在電噴霧正離子模式下進(jìn)行掃描，通過調(diào)節(jié)去簇電壓和碰撞電壓，選出響應(yīng)高且穩(wěn)定的母離子和子離子，質(zhì)譜參數(shù)如表3所示。

2.2 液相條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

FMOC-Cl 常用作氨基酸分析中的衍生劑，作為氨基酸的保護(hù)基團(tuán)[26-28]，在氨基酸類農(nóng)藥的檢測(cè)分析中也發(fā)揮著重要的作用。草甘膦和氨甲基膦酸的極性大且分子量小，直接利用反相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定時(shí)，難以保留且干擾大。草甘膦和氨甲基膦酸衍生化反應(yīng)后，帶有1 個(gè)氨基保護(hù)基團(tuán)，極性大大降低，在C18 反相色譜柱上能有較好的保留[29-34]。本研究采用WATERS ACQUITY UPLC? BEH C18、ThermoHypersil GOLDTM 和WATERS ACQUITY UPLC?HSS T3 3 種色譜柱進(jìn)行探究，用空白茶葉提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定，其中WATERSACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱的色譜峰峰形較寬且響應(yīng)較低；Thermo Hypersil GOLDTM色譜柱的色譜峰有拖尾現(xiàn)象； WATERSACQUITY UPLC? HSS T3 色譜柱分離的色譜峰峰型對(duì)稱、尖銳且響應(yīng)值高，能有效分離茶葉基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾，因此選擇該色譜柱進(jìn)行分析。

2.2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

分別以純水、0.1%甲酸水溶液和5 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相A，乙腈作為流動(dòng)相B，對(duì)比目標(biāo)化合物的峰型和響應(yīng)大小。測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以純水作為流動(dòng)相A 時(shí)，目標(biāo)化合物沒有出峰；在純水相中加入0.1%甲酸后目標(biāo)化合物能有效出峰，這是因?yàn)椴捎谜x子模式進(jìn)樣時(shí)，目標(biāo)化合物需要在高壓電離時(shí)帶上1 個(gè)質(zhì)子，而衍生后的樣品溶液為堿性，流動(dòng)相中的酸可在電離時(shí)為目標(biāo)化合物提供質(zhì)子。在0.1%甲酸水中加入5 mmol·L-1乙酸銨，目標(biāo)峰峰形尖銳對(duì)稱，能有效改善流動(dòng)相中只含甲酸時(shí)峰形拖尾的現(xiàn)象。因此最終選擇5 mmol·L-1 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈作為本次試驗(yàn)的流動(dòng)相體系。

2.3 凈化方式的選擇

取空白茶葉樣品加標(biāo)提取液經(jīng)固相萃取柱進(jìn)行凈化處理，用全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行樣品的凈化，包括固相萃取柱的活化、樣品上樣和接收等步驟，在12 min 以內(nèi)即可完成60 批次樣品的固相萃取過程，實(shí)現(xiàn)便捷、高通量固相萃取，能應(yīng)對(duì)大批量的日常監(jiān)管任務(wù)。該儀器通過數(shù)控加壓泵按照設(shè)置的參數(shù)精準(zhǔn)控制上樣和洗脫速度，有效減少人工操作時(shí)的誤差、耗時(shí)長(zhǎng)和柱子堵塞等問題，可大幅提高檢測(cè)的效率，相比于傳統(tǒng)手動(dòng)固相萃取，全自動(dòng)固相萃取的數(shù)據(jù)精密度更高[12，24，31]，同時(shí)還減少了操作人員在化學(xué)氣霧中的暴露風(fēng)險(xiǎn)。

2.3.1 探究不同固相萃取柱的凈化步驟

考慮到不同固相萃取柱中填料對(duì)目標(biāo)化合物吸附性質(zhì)的差異性，故進(jìn)行凈化液試驗(yàn)，以探究不同固相萃取柱的凈化步驟。MAX 和MCX 柱均為強(qiáng)離子交換柱，在水相中即可呈離子狀態(tài)，與C18、HLB 柱一樣使用甲醇和水即可完成柱子的活化。結(jié)果顯示，每種固相萃取柱的凈化液中均檢測(cè)出目標(biāo)化合物，且因前3 mL 凈化液中混有用于活化的溶液使得目標(biāo)化合物濃度均小于后2 mL 凈化液，故選擇后面2 mL 的凈化液作為樣品溶液進(jìn)行試驗(yàn)。因本研究使用內(nèi)標(biāo)法，在滿足檢出限的前提下不考慮目標(biāo)化合物是否完全洗脫的問題，不進(jìn)行后續(xù)的洗脫液試驗(yàn)，省略后續(xù)的洗脫、氮吹和復(fù)溶步驟，能有效提高試驗(yàn)的效率。

2.3.2 固相萃取柱的選擇

茶葉中含有的茶多酚、咖啡堿、多糖、脂質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)會(huì)影響目標(biāo)化合物衍生化反應(yīng)并對(duì)質(zhì)譜具有極強(qiáng)的抑制作用[31]，草甘膦和氨甲基膦酸中同時(shí)含有酸性基團(tuán)（羧酸基團(tuán)、膦酸基團(tuán)）和堿性基團(tuán)（氨基酸基團(tuán)），是具強(qiáng)極性的兩性化合物。根據(jù)目標(biāo)化合物和雜質(zhì)的特性，本研究采用實(shí)驗(yàn)室常見的C18、HLB、MAX 和MCX 柱進(jìn)行探究。各固相萃取柱的凈化效果如圖1 和圖2 所示，經(jīng)C18、HLB 和MAX 柱凈化后的目標(biāo)峰附近存在較多雜峰，而經(jīng)MCX 柱凈化后目標(biāo)峰附近較干凈、無(wú)雜峰，且回收率較其他3 種固相萃取柱大，回收率在97.5%～102.9%。

C18 柱為反相吸附作用，對(duì)茶湯中的極性雜質(zhì)保留作用較小，凈化后的茶湯顏色深，未能很好地吸附色素；HLB 柱對(duì)極性和非極性物質(zhì)均有較好的保留作用，可吸附茶葉中的大部分雜質(zhì)，凈化后的茶湯顏色較淡，對(duì)目標(biāo)化合物也有較強(qiáng)的保留作用，需配合后續(xù)的洗脫步驟；MAX 柱同時(shí)具備反相吸附和陰離子交換作用，能較好地吸附色素等雜質(zhì)，凈化后茶湯淡，對(duì)目標(biāo)化合物有很強(qiáng)的保留作用，需配合相應(yīng)的酸洗脫步驟才能更好地將目標(biāo)化合物洗脫下來；MCX 柱可同時(shí)發(fā)揮反相萃取和陽(yáng)離子交換作用，能有效吸附多糖、脂質(zhì)、色素、生物堿和堿性氨基酸等非極性、弱極性物質(zhì)和堿性物質(zhì)；茶湯pH 在5.5～7.0，茶多酚在酸性條件下以中性分子存在而被反相吸附；同時(shí)，因目標(biāo)化合物為特殊的強(qiáng)極性兩性物質(zhì)，其解離常數(shù)pKa1=2.3、pKa2=5.7、pKa3=10.9[35]，pH 在pKa2 和pKa3 之間時(shí)主要以陰離子形式存在，因而較少量被陽(yáng)離子交換柱吸附，大部分目標(biāo)化合物隨凈化液分離流出；凈化后的茶湯顏色淡，雜質(zhì)干擾少。未經(jīng)凈化的茶湯以及經(jīng)二氯甲烷和各固相萃取柱凈化后的茶湯顏色如圖3 所示。因本試驗(yàn)旨在探究一種過濾式固相萃取法，綜合對(duì)比分析，最終選擇除雜效果好、回收率高且無(wú)需進(jìn)行洗脫步驟的MCX混合型陽(yáng)離子交換柱作為本研究的前處理凈化柱。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4 和表5 所示，根據(jù)各ki 值的大小可判斷草甘膦和氨甲基膦酸衍生條件的優(yōu)組合分別為A3B3C1 和A3B3C3。表6 方差分析結(jié)果顯示，因素A 和因素B 對(duì)草甘膦結(jié)果有顯著影響（Plt;0.05），而因素C 對(duì)草甘膦結(jié)果無(wú)顯著影響（Pgt;0.05）；各因素對(duì)氨甲基膦酸結(jié)果均無(wú)顯著影響。結(jié)合表5 中的優(yōu)組合，考慮到高濃度的緩沖鹽進(jìn)入質(zhì)譜容易污染離子源，且因素A 對(duì)草甘膦衍生反應(yīng)的k2 與k3 值之間的差異性較小，綜合考慮經(jīng)濟(jì)和環(huán)保效益，最終選擇A2B3C1，即緩沖鹽濃度為5%、衍生劑濃度為10 mg·mL-1、衍生時(shí)間為2 h，作為本研究的最佳衍生條件。

相比于SN/T 1923—2007 中的過夜衍生方法，本方法極大縮短了試驗(yàn)時(shí)間?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中大部分采用逐步控制變量法對(duì)緩沖鹽濃度、衍生劑濃度以及衍生時(shí)間進(jìn)行探究[36-37]，但這種探究變量的方法可能存在片面性、代表性不強(qiáng)等限制，本研究將提取工藝中常用的正交試驗(yàn)法運(yùn)用至食品檢測(cè)前處理?xiàng)l件的優(yōu)化中，充分考慮了因素的主次關(guān)系，高效快捷地選擇出最優(yōu)組合。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)

分別以純水和4 種類別的空白茶葉樣品提取凈化液作為溶劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果如表7 所示。一般認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)在85%～115%時(shí)不存在或基質(zhì)效應(yīng)不顯著[38-39]，在外標(biāo)法的線性方程中可以看出草甘膦在4 種茶葉基質(zhì)中均具有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，氨甲基膦酸均產(chǎn)生基質(zhì)抑制效果；加入內(nèi)標(biāo)后，可將草甘膦的基質(zhì)效應(yīng)在定量分析時(shí)進(jìn)行校正，但對(duì)氨甲基膦酸不起作用。這是因?yàn)榛|(zhì)對(duì)草甘膦以及內(nèi)標(biāo)1，2-13C15N 草甘膦具有相同程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而對(duì)氨甲基膦酸則具有基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此使用內(nèi)標(biāo)法時(shí)可用內(nèi)標(biāo)對(duì)草甘膦的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)進(jìn)行校正，對(duì)氨甲基膦酸的基質(zhì)抑制效應(yīng)不具有校正作用。所以需要使用空白茶葉基質(zhì)配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液以校正目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以校正試驗(yàn)過程中目標(biāo)化合物的損失。在4 種茶葉基質(zhì)中的內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線中，草甘膦和氨甲基膦酸線性方程的斜率間的精密度高、差異性小，在試驗(yàn)中使用其中1 種類型的空白茶葉基質(zhì)做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可。

2.6 檢出限和定量限

在多份空白茶葉樣品中分別加入系列經(jīng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4 章節(jié)樣品前處理進(jìn)行操作，上機(jī)測(cè)定。當(dāng)目標(biāo)峰定性離子對(duì)的響應(yīng)值約為基線噪音的3 倍（信噪比S/N≥3）及10 倍（信噪比S/N≥10）時(shí)，所對(duì)應(yīng)空白茶葉樣品中添加的質(zhì)量濃度水平則為方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。草甘膦和氨甲基膦酸的LOD 均為2 μg·kg-1，LOQ 均為5 μg·kg-1。

2.7 加標(biāo)回收及精密度

在空白茶葉樣品中分別加入5、50μg·kg-1和250 μg·kg-1（1 倍、10 倍和50 倍定量限水平）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4 章節(jié)進(jìn)行操作。結(jié)果如表8 所示，回收率范圍為94.2%～106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為3.8%～4.9%，符合GB/T 27404—2008 附錄F 的要求，表明該試驗(yàn)具有良好的適應(yīng)性和精密度。

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用上述優(yōu)化后的方法對(duì)市售茶葉樣品（共50 批）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表9 所示，草甘膦殘留量均符合我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（ GB2763—2021）中制定1.0 mg·kg-1 的限量要求。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定茶葉樣品中的草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的方法，用水-二氯甲烷提取凈化體系對(duì)茶葉進(jìn)行提取及初步除雜，運(yùn)用全自動(dòng)固相萃取儀完成樣品溶液在MCX 混合陽(yáng)離子交換柱中的進(jìn)一步凈化，利用正交試驗(yàn)和方差分析得出最優(yōu)的凈化條件：5%硼酸鈉緩沖溶液、10 mg·mL-1 FMOC-Cl 衍生劑和2 h 衍生時(shí)間，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定性定量分析。該方法具有操作簡(jiǎn)單、高自動(dòng)化、高通量且高精密度等優(yōu)點(diǎn)，在保證定量結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí)大大縮短了前處理時(shí)間，能夠較好地滿足實(shí)驗(yàn)室日常對(duì)茶葉中草甘膦及氨甲基膦酸殘留的大批量檢測(cè)需求，為茶葉安全及質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持與保障。

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