EGCG 對(duì)非肥胖型糖尿病大鼠腎損傷的改善作用及調(diào)節(jié)機(jī)制研究

摘要：EGCG 是一種抗氧化、抗炎癥的天然活性成分，目前關(guān)于EGCG 的抗氧化和抗炎癥作用在糖尿病腎損傷中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制研究較少。采用不同劑量的EGCG 干預(yù)非肥胖型糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠以探究EGCG 對(duì)糖尿病大鼠腎損傷的作用和機(jī)制。試驗(yàn)周期為4 周，監(jiān)測(cè)試驗(yàn)期內(nèi)大鼠的平均體質(zhì)量和日平均攝食量，并在試驗(yàn)結(jié)束后取血清和腎臟組織，檢測(cè)大鼠腎功能、腎臟病理指標(biāo)、氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)以及Nrf2-Keap1/MAPK 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平。試驗(yàn)表明，EGCG 能夠有效改善GK 大鼠腎臟形態(tài)損傷，顯著降低血肌酐、尿素氮和腎臟丙二醛含量，提高腎臟超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性， 抑制促炎因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1 和白介素-1β 的釋放水平， 調(diào)節(jié)與抗氧化應(yīng)激相關(guān)的Nrf2-Keap1/MAPK 信號(hào)通路的Nrf2、Keap1、JNK、NF-κB、P38 基因表達(dá)水平，且在試驗(yàn)范圍內(nèi)，高劑量的改善效果優(yōu)于低劑量。以上結(jié)果表明，EGCG 對(duì)大鼠糖尿病導(dǎo)致的腎損傷有一定的改善作用，其作用機(jī)理可能與Nrf2-Keap1/MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

關(guān)鍵詞：EGCG；糖尿病腎損傷；氧化應(yīng)激；炎癥；糖尿??；GK 大鼠

中圖分類號(hào)：S571.1；R587.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-369X（2023）06-784-11

腎臟是人體的重要內(nèi)臟器官，具有排泄、重吸收和內(nèi)分泌等功能[1]。長(zhǎng)期腎損傷導(dǎo)致腎臟排水和排毒能力下降，可能引起腎性高血壓、電解質(zhì)紊亂和尿毒癥性心肌癥等并發(fā)癥，影響人體健康。糖尿病腎損傷（Diabetic kidneydisease，DKD）是2 型糖尿?。―iabetes mellitustype 2，T2DM）常見的微血管并發(fā)癥，也是引起終末期腎?。‥nd-stage renal disease，ESRD）的首要原因，全球約有30%～50%的ESRD 是由DKD 所致[2]。因此DKD 已經(jīng)成為一種亟待解決的健康問題。

目前針對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥，主要是采用降血糖藥物進(jìn)行治療，但仍存在治療成本高、患者對(duì)治療的依從性差、副作用大、低血糖風(fēng)險(xiǎn)高等問題[3]。因此人們?cè)絹?lái)越關(guān)注天然活性物質(zhì)對(duì)DKD 的治療功效。茶是世界上很受歡迎的飲料之一，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）作為茶葉中含量最高的多酚類物質(zhì)，因其顯著的降血糖功效已被用作糖尿病的替代療法[4]。然而目前關(guān)于EGCG 改善高血糖引起的組織損傷的作用機(jī)制多聚焦于EGCG 的降血糖功效，較少討論EGCG 的抗氧化和抗炎癥作用在DKD 中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。

非肥胖型Goto-Kakizaki（GK）大鼠是一種自發(fā)性T2DM 動(dòng)物模型。因其生長(zhǎng)發(fā)育過程中所體現(xiàn)的大量生物學(xué)特性與人類T2DM 具有高度相似性，且造模穩(wěn)定，近年來(lái)在糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的動(dòng)物研究中得到廣泛應(yīng)用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，成年（8～12 周）GK 大鼠的腎臟形態(tài)變化與人類糖尿病腎損傷相似，且具有氧化應(yīng)激基礎(chǔ)，如高血糖、胰島素抵抗和微血管損傷[6]。因此，本研究以GK 大鼠為對(duì)象探究不同劑量的EGCG 對(duì)自發(fā)非肥胖型T2DM 大鼠腎損傷的作用和機(jī)制，為開發(fā)EGCG 應(yīng)用于治療DKD 提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從江蘇常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司采購(gòu)SPF 級(jí)的9～11 周齡的雄性GK 大鼠30 只以及7～8 周齡健康Wistar 大鼠10 只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2021-0013。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(hào)：倫審科2021 第（2137）號(hào)]，飼養(yǎng)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所動(dòng)物房。動(dòng)物房溫度24～26 ℃，光暗時(shí)間為12 h/12 h 循環(huán)，飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水進(jìn)食。

1.1.2 藥品和試劑

EGCG（純度≥98%）由湖南三福生物科技公司提供；肌酐（Creatinine，CRE）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、總超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（ Glutathione peroxidase ，GSH-Px）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、總抗氧化能力（ Total antioxidant capacity ，T-AOC）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和總蛋白等檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司； 大鼠腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素-6（ Interleukin-6 ， IL-6 ）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1 （ Monocyte chemoattractant protein-1 ，MCP-1 ） 等酶聯(lián)免疫法（ Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)于湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.1.3 儀器和設(shè)備

UV-2550 型紫外分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司；病理切片機(jī)（RM2016），上海徠卡儀器有限公司；生物顯微鏡（NIKONE100），日本尼康有限公司；Varioskan Flash-全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、微量核酸定量?jī)x（NanoDrop 2000）、96 孔PCR 儀（SimpliAmp）、實(shí)時(shí)定量PCR 儀（ QuantStudio 3 ）， 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及干預(yù)

10 只雄性Wistar 大鼠和30 只GK 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，30 只GK 大鼠空腹血糖值均大于11.1 mmol·L-1，為合格的糖尿病模型鼠[7]。將GK 大鼠隨機(jī)等分成3 組（每組10 只），分別為模型（ MC ） 組、10 mg·kg-1 EGCG（ EGCG10 ） 干預(yù)組、120 mg·kg-1 EGCG（EGCG120）干預(yù)組，均進(jìn)食60%高脂飼料。干預(yù)劑量均為安全劑量[8]。10 只Wistar 大鼠作為正常對(duì)照（NC）組，進(jìn)食實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料。EGCG10 和EGCG120 組的大鼠每天按相應(yīng)劑量灌胃1 次EGCG，干預(yù)4 周，每周記錄大鼠體質(zhì)量和攝食量。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠禁食12 h 后腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）后稱重。采集血液樣本和腎臟組織，并立即保存在–80 ℃冰箱中備用。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1A 所示。

1.2.2 腎功能指標(biāo)檢測(cè)

肌酐、尿素氮是蛋白質(zhì)終極代謝產(chǎn)物，經(jīng)腎小球?yàn)V過排出體內(nèi)，當(dāng)腎小球?yàn)V過能力下降時(shí)，血液中的肌酐和尿素氮含量升高[9]，因此檢測(cè)肌酐、尿素氮以評(píng)價(jià)糖尿病GK 大鼠腎功能。大鼠處死后取大動(dòng)脈血，室溫靜置2 h，4 ℃ 3 500 r·min-1 離心10 min，取血清放置于–80 ℃冰箱保存。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血肌酐（Serum creatinine，Scr）和尿素氮。

1.2.3 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察

大鼠腎臟置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、包埋、切片、蘇木精- 伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，Hamp;E 染色）和過碘酸-雪夫染色（Periodic acid-schiff stain，PAS 染色）后，使用顯微鏡觀察腎臟和腎小球的完整性及受損情況，Image J 統(tǒng)計(jì)腎小球面積，并計(jì)算腎臟肥大指數(shù)以評(píng)價(jià)大鼠腎臟病理情況。

腎臟肥大指數(shù)=雙腎質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）

1.2.4 腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

準(zhǔn)確稱量大鼠腎臟質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例，加入9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下勻漿，2 500 r·min-1 離心10 min，去除上清液制備成10%腎臟勻漿，后續(xù)嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)后，找到最佳勻漿濃度檢測(cè)腎臟酶類抗氧化劑SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC 和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)腎臟和血清炎癥水平

取大鼠10%腎臟勻漿和血清，嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，找到最佳勻漿、血清濃度檢測(cè)大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1。

1.2.6 Nrf2-Keap1/MAPK 信號(hào)通路相關(guān)基因檢測(cè)

取腎臟勻漿，按照艾科瑞試劑盒說(shuō)明書對(duì)其進(jìn)行總RNA 抽提，測(cè)定RNA 濃度，并將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。調(diào)節(jié)cDNA 濃度后結(jié)合SYBR 反應(yīng)體系，對(duì)腎臟中核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）、Kelch 樣ECH聯(lián)合蛋白1 （ Kelch-like ECH -associatedprotein1，Keap1）、醌氧化還原酶1（Quinoneoxidoreductase 1，NQO1）、血紅素加氧酶1（Heme oxygenase 1，HO-1）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal regulated kinase，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminalkinase，JNK）、核因子活化B 細(xì)胞κ 輕鏈增強(qiáng)子（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancerof activated B cells，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶P38（Mitogen-activated protein kinase，P38）的基因表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，PCR 引物序列見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Image J 軟件處理圖像，使用IBMSPSS Statistics 25 和GraphPad Prism 9 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)并繪制圖表。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ±SD）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA 單向方差分析和Dunnett 多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG 對(duì)糖尿病GK 大鼠的體質(zhì)量、攝食量的影響

如圖1B 所示，MC、EGCG10、EGCG120組的大鼠初始體質(zhì)量無(wú)顯著差別，而NC 組大鼠初始體質(zhì)量明顯低于其他3 組大鼠；對(duì)應(yīng)飲食喂養(yǎng)4 周后，NC 組大鼠體質(zhì)量增幅明顯，且高于其他3 組大鼠，不同劑量EGCG 干預(yù)對(duì)糖尿病GK 大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯影響。在日平均攝食量方面（圖1C），與NC 組大鼠相比，糖尿病GK 大鼠日平均攝食量下降，10 mg·kg-1EGCG 干預(yù)無(wú)明顯變化，120 mg·kg-1 EGCG 干預(yù)后，GK 大鼠日平均攝食量略有增加。

2.2 EGCG 對(duì)糖尿病GK 大鼠腎功能指標(biāo)的影響

由圖1D 和圖1E 可知，與正常組大鼠相比，模型組大鼠血清中的尿素氮、肌酐顯著增加（Plt;0.05）；與模型組相比，補(bǔ)充10 mg·kg-1和120 mg·kg-1 EGCG 后，GK 大鼠血清中的肌酐和尿素氮均顯著下降（ Plt;0.05 ）， 且EGCG120 組大鼠的血肌酐含量低于正常對(duì)照組。這些結(jié)果表明，EGCG 能降低DKD 大鼠尿素氮和血肌酐含量，提高糖尿病GK 大鼠的腎小球?yàn)V過能力，改善腎臟功能。

2.3 EGCG 對(duì)糖尿病GK 大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響

Hamp;E 染色可使細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、基質(zhì)、間質(zhì)膠原呈紅色，主要用于觀察腎臟組織基本結(jié)構(gòu)，分辨細(xì)胞的種類、壞死及管型成分。如圖2A 所示，Hamp;E 染色結(jié)果顯示，NC組大鼠腎皮質(zhì)部腎小管排列緊密、腎小球組織結(jié)構(gòu)清晰未見異常；MC 組大鼠出現(xiàn)腎小管內(nèi)蛋白管型，腎小囊內(nèi)血漿蛋白滲出，腎小管上皮細(xì)胞空泡腫脹，腎小管結(jié)構(gòu)明顯擴(kuò)張；EGCG10組的大鼠腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變明顯，腎小球旁器細(xì)胞增生；EGCG120 組大鼠腎臟組織形態(tài)與NC 組相近，未見異常，明顯區(qū)別于MC 組和EGCG10 組。

PAS 染色可使腎小球基底膜、系膜基質(zhì)、腎小管基膜呈紫紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，能清楚地觀察腎小球固有細(xì)胞的位置、變化和腎小管上皮細(xì)胞的變化。由圖2B 可知，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠腎小球肥大、出現(xiàn)系膜區(qū)增大、基底膜增厚、基質(zhì)增多和系膜細(xì)胞增生等病變，符合DKD 病理特征。相較于模型對(duì)照組，EGCG 干預(yù)后以上病變情況減輕，且高劑量EGCG 的改善效果優(yōu)于低劑量。腎臟和腎小球體積增大是DKD 的特征，高糖環(huán)境下，血流動(dòng)力學(xué)的改變使腎小球內(nèi)壓力增高、濾過率持續(xù)性下降，腎臟血流量增多導(dǎo)致腎臟和腎小球肥大。由圖2C 和圖2D 可知，120 mg·kg-1 EGCG 干預(yù)顯著改善了GK 大鼠的腎臟肥大（Plt;0.01），并使腎小球體積回降到正常狀態(tài)。

2.4 EGCG 對(duì)糖尿病GK 大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

為研究EGCG對(duì)糖尿病GK大鼠腎臟抗氧化酶系統(tǒng)及氧化損傷的影響，檢測(cè)了大鼠腎臟抗氧化酶系統(tǒng)，如SOD（圖3A）、CAT（圖3C）、GSH-Px（圖3D）、T-AOC（圖3E），以及膜脂過氧化產(chǎn)物MDA（圖3B）。與MC 組相比，10 mg·kg-1 和120 mg·kg-1 EGCG 干預(yù)可顯著調(diào)節(jié)SOD、CAT、GSH-Px 和T-AOC 活性，抑制脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 的產(chǎn)生。說(shuō)明EGCG 增強(qiáng)了GK 大鼠腎臟抗氧化酶活性，減輕了腎臟氧化應(yīng)激。

2.5 EGCG 對(duì)糖尿病GK 大鼠腎臟及血清炎癥反應(yīng)的影響

通過檢測(cè)GK 大鼠腎臟和血清中的MCP-1、TNF-α、IL-6 和IL-1β 釋放水平以評(píng)價(jià)EGCG 的抗炎作用。如圖4 所示，各組大鼠腎臟中的TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量無(wú)顯著差異，MC 組大鼠腎臟中MCP-1 的釋放水平顯著高于其他3 組，不同劑量的EGCG 干預(yù)均顯著降低了腎臟中MCP-1 含量（Plt;0.05）。各組大鼠血清中的TNF-α 含量無(wú)顯著差異；MC 組的血清中IL-6、IL-1β、MCP-1 含量顯著高于正常組（Plt;0.0001），不同劑量EGCG干預(yù)對(duì)血清中IL-6 含量無(wú)顯著影響，但顯著降低了IL-1β（Plt;0.0001）、MCP-1（Plt;0.05）的釋放水平。EGCG 的干預(yù)降低了GK 大鼠的MCP-1、IL-1β 的釋放水平，且在DKD 大鼠的腎臟和血清中促炎因子釋放水平不同，血清中促炎因子IL-6 和IL-1β 的變化先于腎臟，這可能表示高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激不會(huì)最先發(fā)生在腎臟。

2.6 EGCG 對(duì)Nrf2-Keap1/MAPK 信號(hào)通路的影響

在上述研究的基礎(chǔ)上， 為進(jìn)一步探究EGCG 通過抑制氧化應(yīng)激及炎癥改善糖尿病GK 大鼠腎損傷的分子機(jī)制，檢測(cè)了GK 大鼠腎臟中調(diào)控氧化應(yīng)激的Nrf2-Keap1/MAPK 信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平。由圖5A 可知，與NC 組相比，MC 組Nrf2、NQO1、HO-1 的表達(dá)量顯著下降（Plt;0.05），Keap1 表達(dá)量顯著增加（Plt;0.01）。不同劑量EGCG 干預(yù)對(duì)NQO1和HO-1 的表達(dá)量無(wú)顯著影響；10 mg·kg-1 EGCG干預(yù)對(duì)Nrf2 和Keap1 的表達(dá)量與MC 組無(wú)顯著差異，而120 mg·kg-1 EGCG 干預(yù)顯著增加了Nrf2 的表達(dá)量（Plt;0.001），顯著降低了Keap1 的表達(dá)量（Plt;0.05）。由圖5B 可知，在MAPK 信號(hào)通路中，ERK 表達(dá)水平在各組無(wú)顯著差別；10 mg·kg-1 EGCG 干預(yù)對(duì)JNK 的表達(dá)量無(wú)顯著影響，但顯著降低了NF-κB 和P38的表達(dá)量（Plt;0.01）；120 mg·kg-1 EGCG 干預(yù)組大鼠腎臟中JNK、NF-κB 和P38 的表達(dá)量顯著低于MC 組（Plt;0.01）。以上結(jié)果表明，EGCG可能是通過調(diào)節(jié)腎臟Nrf2-Keap1/MAPK 信號(hào)通路抑制糖尿病GK 大鼠的氧化應(yīng)激和炎癥。

2.7 EGCG 濃度與GK 大鼠腎臟、血清生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

如圖6A 所示，EGCG 濃度與Scr、BUN、MDA、血清IL-1β、MCP-1 和腎臟MCP-1 含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），與SOD、CAT、GSH-Px以及T-AOC 活性呈顯著正相關(guān)（Plt;0.01）。

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)糖尿病患病率不斷上漲。根據(jù)《2021 全球糖尿病地圖》數(shù)據(jù)顯示，2011年到2021 年，我國(guó)糖尿病患者人數(shù)由9 000萬(wàn)增加至1.4 億，增幅達(dá)56%[10]。在我國(guó)糖尿病患病人群中，T2DM 占90%以上，T2DM 并發(fā)腎?。―KD）的患病率高達(dá)21.8%[11]，嚴(yán)重危害我國(guó)居民健康。限于目前醫(yī)學(xué)水平，糖尿病仍是一種終身性疾病，如何通過減輕氧化應(yīng)激損傷預(yù)防慢性并發(fā)癥、提高患者生活質(zhì)量和延長(zhǎng)壽命是糖尿病治療的遠(yuǎn)期目標(biāo)。

腎臟病理學(xué)檢查是DKD 診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[12]。隨著病情發(fā)展，DKD 患者會(huì)出現(xiàn)腎臟濾過能力下降、腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張、基質(zhì)增多等改變[13-14]。本研究結(jié)果顯示，EGCG 干預(yù)可顯著降低GK 大鼠的血肌酐、尿素氮含量，改善GK 大鼠腎小球肥大、系膜區(qū)增大、基底膜增厚、基質(zhì)增多和系膜細(xì)胞增生等腎臟形態(tài)學(xué)病變，緩解GK 大鼠的腎臟損傷。

抗氧化應(yīng)激是防治T2DM 和DKD 發(fā)展的重要分子機(jī)制[15]。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EGCG 可以顯著降低細(xì)胞的ROS 水平，提高細(xì)胞活力[16-17]。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100 mg·kg-1·d-1 EGCG 對(duì)GK大鼠干預(yù)12 周，觀察到EGCG 可以通過靶向ROS-ERK/JNK-P53 途徑減少ROS 產(chǎn)生改善GK 大鼠的高血糖和氧化應(yīng)激[18]。Nrf2 是抗氧化酶和解毒基因的主要調(diào)節(jié)因子，被證實(shí)能與Keap1 相互作用以減少氧化應(yīng)激并改善生物體的整體抗氧化功能[19]。HO-1、NQO1 和GPx是Nrf2-Keap1 信號(hào)通路的下游靶基因，Wang等[20]觀察到EGCG 干預(yù)上調(diào)了這些基因的表達(dá)。Khan 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 可以通過提高抗氧化酶SOD、CAT 和GPx 的活性改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)Wistar 大鼠的氧化應(yīng)激和肺纖維化。因此本研究假設(shè)EGCG 可以通過Nrf2-Keap1 信號(hào)通路調(diào)節(jié)抗氧化酶活性抑制GK 大鼠腎臟氧化應(yīng)激。如圖3 和圖5A 所示，EGCG 干預(yù)上調(diào)了Nrf2 基因的表達(dá)，提高了抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px 活性，這可能是由于EGCG 促進(jìn)了Keap1 對(duì)自身半胱氨酸殘基的修飾，阻止了Nrf2 降解，并促進(jìn)Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)， 激活抗氧化響應(yīng)元件（Antioxidant response element，ARE），調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用[22]（圖6B）。

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可以通過激活P38和NF-κB 等信號(hào)通路誘導(dǎo)促炎因子表達(dá)[23]。周繼紅等[24]發(fā)現(xiàn)，膳食補(bǔ)充EGCG 可顯著降低高果糖飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β 炎癥因子和腸道中IL-6 炎癥因子水平。Uchiyama 等[25]發(fā)現(xiàn)，膳食補(bǔ)充10% EGCG 能夠顯著降低GK 大鼠腸系膜脂肪組織中一些與炎癥反應(yīng)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，改善GK大鼠脂肪組織的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，EGCG 干預(yù)下調(diào)了GK 大鼠腎臟MAPK 途徑中NF-κB、JNK、P38 的表達(dá)，降低了血清MCP-1、IL-1β 和腎臟MCP-1 水平（MCP-1、IL-1β 為MAPK 途徑下游靶基因），推測(cè)EGCG可以通過抑制MAPK 途徑降低GK 大鼠腎臟促炎因子水平，改善腎臟氧化應(yīng)激。

綜上所述，EGCG 可以降低GK 大鼠血肌酐、尿素氮含量，改善GK 大鼠出現(xiàn)的腎小球肥大、系膜區(qū)增大、基底膜增厚、基質(zhì)增多和系膜細(xì)胞增生等腎臟形態(tài)學(xué)病變，且在試驗(yàn)范圍內(nèi)呈現(xiàn)高劑量改善效果優(yōu)于低劑量。其作用機(jī)制可能與EGCG 通過調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1/MAPK信號(hào)通路提高腎臟抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px 活性，抑制促炎因子MCP-1、IL-1β釋放，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

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