茶樹春季發(fā)芽期的QTL 定位及候選基因分析

摘要：春季發(fā)芽期（Timing of spring bud flush，TBF）是茶樹重要的農(nóng)藝性狀，對茶葉的風味品質(zhì)和經(jīng)濟效益均具有重要的影響。為了挖掘調(diào)控茶樹TBF 性狀的關(guān)鍵候選基因，以龍井43×白毫早雜交的F1 群體327 株子代為材料，利用基于該群體構(gòu)建的茶樹高密度遺傳圖譜，采用MapQTL 6.0 和GACD 1.2 軟件對茶樹春季發(fā)芽指數(shù)（Sprouting indexs，SPI）進行數(shù)量性狀基因座（QTL）定位。連續(xù)兩年（2022、2023 年）對群體子代的春季SPI 進行觀測，結(jié)果顯示，SPI 在F1 群體內(nèi)存在明顯的性狀分離，表現(xiàn)出數(shù)量性狀的特征。利用MapQTL6.0 軟件定位到1 個主效的QTL（qSPI-5-1），分別可解釋18.30%（2022 年）和7.60%（2023 年）的表型變異；利用GACD 1.2 軟件定位到2 個穩(wěn)定的QTL 位點（qSPI-1，qSPI-5-2），解釋2.75%～18.40%的表型變異，且qSPI-5-2 與qSPI-5-1 位點基本重合。進一步將上述3 個位點的置信區(qū)間與茶樹參考基因組進行比對，通過基因功能注釋分析共篩選到23 個與調(diào)控茶樹春季發(fā)芽期相關(guān)的候選基因。研究結(jié)果為進一步探究茶樹春季萌發(fā)的調(diào)控基因和分子機理提供了理論參考。

關(guān)鍵詞：茶樹；春季發(fā)芽期；數(shù)量性狀基因座；候選基因

中圖分類號：S571.1；S326 文獻標識碼：A 文章編號：1000-369X（2023）06-747-10

茶樹[Camellia sinensis （L.） O. Kuntze]是多年生常綠木本經(jīng)濟作物。茶樹芽葉經(jīng)加工制成的茶葉，因富含多種對人體健康有益的次生代謝物以及具有良好的風味品質(zhì)而受到人們喜愛[1-3]。糧農(nóng)組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫（FAOSTAT，www.fao.org/faostat）顯示，目前已有超過48個國家種植茶樹，茶樹已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟作物。春季發(fā)芽期（Timing of springbud flush，TBF）是茶樹重要的農(nóng)藝性狀，具有早芽性狀的茶樹品種具有較高的栽培育種價值。一方面，茶樹經(jīng)過一個冬季的休止期，春季新梢積累了更多的次級代謝物，使得茶葉品質(zhì)優(yōu)異；另一方面，春季發(fā)芽較早的茶樹品種其茶葉上市早，春茶采收期長，使得春茶產(chǎn)量和經(jīng)濟效益提高。

研究表明，即使在相同的生長環(huán)境下，不同茶樹品種的TBF 差異仍然很大，最大可相差40 d[4]。為明確TBF 的調(diào)控機制和重要基因，科學(xué)家們也開展了相應(yīng)的研究。Wang 等[4]使用抑制差減雜交（ Suppression subtractivehybridization，SSH）的方法研究了休眠和萌發(fā)腋芽的差異表達基因（ Differentiallyexpressed genes，DEGs），主要涉及脅迫反應(yīng)、能量代謝和激素調(diào)節(jié)等。Hao 等[5]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）分析了腋芽的休眠期和萌發(fā)期等不同時期的基因表達量，發(fā)現(xiàn)16 125個DEGs，主要富集在表觀遺傳、植物激素信號、胼胝體等調(diào)控通路。Tan 等[6]通過對休眠芽和萌發(fā)芽差異表達基因分析發(fā)現(xiàn)，MADS、NY-FC、AP2-ERFs 等轉(zhuǎn)錄因子和植物激素相關(guān)基因可能調(diào)控茶樹休眠和萌發(fā)。近期，Liu等[7] 鑒定到了9 個與茶樹萌芽有關(guān)的CsAP2/ERF 基因，同時發(fā)現(xiàn)D-type 周期蛋白可能與茶芽萌發(fā)有關(guān)。然而，這些重要的候選基因仍需要進一步的功能驗證。

數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait locus，QTL）定位研究需要構(gòu)建龐大的作圖群體，并對作圖群體進行基因組水平的測序，以構(gòu)建高密度遺傳圖譜，結(jié)合表型觀測結(jié)果，進行QTL定位分析。但是茶樹育種周期長、自交不親和，難以像水稻、小麥等一年生大田作物一樣構(gòu)建永久作圖群體，這使得利用正向遺傳學(xué)方法解析茶樹重要農(nóng)藝性狀進展緩慢。近年來，隨著茶樹高質(zhì)量參考基因組的發(fā)布，結(jié)合茶樹基因組具有高雜合度的特性，使得采用F1 代擬測交作圖策略[8]研究茶樹QTL 定位取得一定進展。前期課題組以龍井43 和白毫早為親本構(gòu)建了F1 代雜交群體，并構(gòu)建了高密度茶樹遺傳圖譜[9]。龍井43 和白毫早都屬于國家級特早生茶樹品種，觀測發(fā)現(xiàn)TBF 性狀在子代群體中發(fā)生了明顯的性狀分離，有利于QTL 定位分析。本研究以此為基礎(chǔ)，對茶樹TBF 進行了連續(xù)兩年的QTL 定位研究，并分析了置信區(qū)間內(nèi)的候選基因，以期為茶樹分子標記輔助育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

龍井43（C. sinensis var. sinensis ‘Longjing43’ ） 和白毫早（ C. sinensis var. sinensis‘Baihaozao’）及其327 個F1 雜交子代均種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所嵊州綜合試驗基地（29°44′N，120°49′E），正常水肥管理。

1.2 TBF 表型觀測

茶樹TBF 表型觀測參考文獻[10]，使用發(fā)芽指數(shù)（Sprouting indexs，SPI）來代表茶樹春季發(fā)芽狀態(tài)。通過春季在田間觀測，待群體大多數(shù)子代已經(jīng)萌發(fā)時（2022 年3 月16 日和2023 年3 月24 日）觀測親本及其F1 群體子代發(fā)芽指數(shù)，每根粗壯枝上選擇5 個腋芽進行發(fā)芽指數(shù)評分，取平均值代表子代的發(fā)芽狀態(tài)。

而MapQTL 6.0 在2022 年和2023 年的春季SPI數(shù)據(jù)中僅僅定位到1 個穩(wěn)定的QTL（qSPI-5-2，圖2B），該位點同樣位于5 號連鎖群上，且該位點與GACD1.2 在5 號連鎖群上定位到的QTL幾乎重合，該位點在連續(xù)兩年觀測的表型數(shù)據(jù)QTL 定位結(jié)果中相同峰值標記距離極近，但不相同，分別為AX-414610507（2022 年）和AX-416494071 （ 2023 年）， LOD 范圍為5.54～14.02，隨后在兩年的表型觀測中以峰值標記閾值LOD-1 所覆蓋到的分子標記的共同置信區(qū)間作為該QTL 位點置信區(qū)間，大小為6.65 cM。qSPI-5-2 的PVE 分別為18.30%和7.60%，由此可知，該位點是調(diào)控茶樹春季SPI性狀效應(yīng)最強的QTL。

2.3 QTL 內(nèi)重要候選基因的分析

在以往的工作中，已經(jīng)建立了該遺傳群體的連鎖群與茶樹基因組染色體對應(yīng)的關(guān)系[12]，并且它們之間具有良好的共線性，這為尋找QTL 置信區(qū)間內(nèi)參考基因提供了便利[9，11-12]。利用QTL 兩端的標記序列與舒茶早茶樹參考基因組進行比對，將QTL 區(qū)間比對到茶樹參考基因組上。結(jié)果如圖3A 所示，LG1 對應(yīng)1號染色體，該置信區(qū)間在染色體上的大小為9.24 Mb，包含199 個基因；而LG5 上的qSPI-5-1 和qSPI-5-2 對應(yīng)到4 號染色體上，為了盡可能不遺漏調(diào)控茶樹TBF 的候選基因，qSPI-5-1 和qSPI-5-2 位點包含的全部置信區(qū)間比對到序列長度為20.76 Mb 的茶樹染色體上，該區(qū)間內(nèi)含有505 個基因。

為了進一步明確候選基因的功能，尋找到可能調(diào)控茶樹TBF 的重要候選基因，對兩個QTLs 內(nèi)704 個候選基因進行GO、KEGG、pfam注釋（表3），分別獲得377、235、520 個候選基因。646 個基因具有非冗余蛋白功能注釋（Non-redundant protein sequence database，NR）信息。參考基因富集通路、功能注釋信息以及查閱文獻，找到23 個與茶樹TBF 可能相關(guān)的重要候選基因，包括幾類轉(zhuǎn)錄因子如AP2/ERF（CSS0034219，CSS0001166）、WRKY（CSS0023134，CSS0005560）、MYB（CSS0013678，CSS0011420）、Dof（CSS0039246，CSS0048433）；還包括部分植物激素調(diào)控基因，如調(diào)控脫落酸（Abscisic acid，ABA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白激酶（ Serine/threonine-protein kinase ， SRK2E ）（CSS0020459，CSS0033957），ABA 受體蛋白Pyrabatin riesistance1-like （ PYL ）（ CSS0027957 ， CSS0015228 ）、RABE1a（CSS0000976，CSS0006593），以及生長素調(diào)控基因AUX1（CSS0046696），參與油菜素內(nèi)酯信號的BSK 基因（CSS0028616），GA 信號相關(guān)的Ataxin-3（CSS0046643）。另外發(fā)現(xiàn)4個F-box 蛋白（CSS0029544、CSS0036037、CSS0044623、CSS0018234）。

這23 個重要候選基因在茶樹頂芽、嫩莖、根等8 個不同器官的基因表達量如圖3B 所示，AP2/ERF（CSS0034219，CSS0001166）和MYB（CSS0013678）在茶樹不同器官的表達模式相同，在芽和嫩莖中表達量明顯低于在其他器官中的表達量； 而Expansin-A8-like（ CSS0008650 ， CSS0010195 ） 、Dof（CSS0039246，CSS0048433）與上述表達模式相反，在頂芽和嫩莖中的基因表達量較高。

3 討論

3.1 茶樹TBF 的QTL 定位分析

為尋找調(diào)控茶樹TBF 的主效QTL，應(yīng)用于分子標記輔助育種，加快茶樹育種效率[18]，已有學(xué)者針對茶樹TBF 進行了相關(guān)研究，如Tan 等[9]使用SSR 分子標記對龍井43×白毫早構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，并對TBF 進行QTL 定位，在5 號連鎖群上獲得QTL 位點，與本研究結(jié)果一致。此外，Wang 等[19]對151 份茶樹種質(zhì)資源使用全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wideassociation study， GWAS）確定了1 個與TBF顯著相關(guān)的SNP 位點（Sc0002405-269473），該位點位于茶樹第13 號染色體上，并開發(fā)了與TBF 相關(guān)的dCAPs 標記。Tan 等[10]以峨眉問春×川沐217 為親本構(gòu)建F1 雜交群體，并對TBF 進行QTL 定位，找到2 個穩(wěn)定的QTLs，其中1 個穩(wěn)定且主效的QTL（qSPI-4）與本研究的qSPI-5 位點相重合，推測在該置信區(qū)間內(nèi)存在調(diào)控茶樹TBF 性狀的重要候選基因。

本研究在本課題組前期開發(fā)的茶樹高密度遺傳圖譜基礎(chǔ)上， 使用GACD 1.2 與MapQTL 6.0 軟件進行茶樹TBF 的QTL 定位研究，發(fā)現(xiàn)兩者都能穩(wěn)定定位到調(diào)控TBF 最主效的QTL 位點（qSPI-5），同時發(fā)現(xiàn)GACD1.2 軟件較MapQTL 6.0 軟件能夠定位到多1個但效應(yīng)較小的QTL（qSPI-1），前人的研究結(jié)果也同樣證明了該結(jié)論[20-21]。但是，在主效QTL 位點上（qSPI-5），兩個軟件定位的置信區(qū)間卻不完全相同，qSPI-5-2（GACD 1.2）的置信區(qū)間在連鎖群末端偏上位置（131.74～143.48 cM），而qSPI-5-1（MapQTL6.0）更靠近連鎖群的末端（140.38～147.03 cM）。

在MapQTL 6.0 軟件定位的QTL（qSPI-5-1）內(nèi)，多個位置出現(xiàn)LOD＞3 但是不連續(xù)的峰型，推測在該主效QTL 位點上可能存在多個調(diào)控TBF 的基因。

3.2 茶樹TBF 的候選基因分析

隨著茶樹高質(zhì)量參考基因組的發(fā)布[17，22-23]，加速了茶樹遺傳育種的研究，也使通過QTL定位尋找候選基因成為可能。本研究將TBF相關(guān)QTL 兩端的序列與茶樹參考基因組進行比對，并在置信區(qū)間內(nèi)尋找候選基因。本研究發(fā)現(xiàn)的2 個穩(wěn)定QTL（qSPI-1，qSPI-5）的置信區(qū)間大小分別為9.24 Mb 和20.76 Mb。通過分析基因注釋和查閱參考文獻，在置信區(qū)間內(nèi)找到23 個重要的候選基因，期望對將來的基因功能驗證提供線索。

在這些候選基因中，發(fā)現(xiàn)幾類重要的轉(zhuǎn)錄因子，如AP2/ERF、WRKY 和MYB。AP2/ERF 基因家族在茶樹春季發(fā)芽中發(fā)揮著重要作用[7]，AP2/ERF （ CSS0001166 ） 與擬南芥中的AtDREB-2C 為同源基因，該基因過表達會使擬南芥種子萌發(fā)延遲和ABA 含量增加[24]。

WRKY（CSS0023134，CSS0005560）和MYB（CSS0013678，CSS0011420）是調(diào)節(jié)ABA 信號的重要轉(zhuǎn)錄因子，可能調(diào)控植物的休眠和萌發(fā)[25]。此外，還發(fā)現(xiàn)了許多與植物激素相關(guān)的基因， 如2 個SRK2E （ CSS002045 ，CSS0033957）基因，它們調(diào)控ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而影響植物的休眠和萌發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥SRK2E 缺失突變體中，擬南芥的種子無法休眠，且ABA 含量出現(xiàn)顯著升高[26]。在水稻中過表達SRK2E 同源基因（SAPK10）會使種子萌發(fā)延遲[27]。此外，還發(fā)現(xiàn)2 個RABE1a（CSS0000976，CSS0006593）基因，在擬南芥中RABE1a 能夠與質(zhì)膜上的ABA 受體結(jié)合，從而正向調(diào)節(jié)ABA 信號傳導(dǎo)，且能抑制ABA受體PYL（CSS0027597，CSS0015228）的積累[28]。同時發(fā)現(xiàn)了參與調(diào)控油菜素內(nèi)酯（BR）的BR-signaling kinase（BSK，CSS0028616），以及生長素調(diào)控基因AUX1（CSS0046696）。在該區(qū)間還存在多個F-box 蛋白，有研究報道[29]它們可以調(diào)控乙烯、赤霉素（GA）、IAA 等植物激素，從而影響植物的休眠與萌發(fā)。另外，在這些候選基因中發(fā)現(xiàn)2 個膨脹素基因Expansin-A8-like（CSS0008650，CSS0010195），二者在茶樹不同器官的基因表達模式相同，但是在頂芽和嫩莖中表達量明顯高于在其他器官中的表達量。有研究報道Expansin-A8-like僅在萌發(fā)的種子中表達，而且在種子萌發(fā)后嫩莖的初期生長階段該基因也參與其中[30-31]；同時，它們的同源基因AtEXP2 在擬南芥中過表達能使種子提前萌發(fā)[32]。上述基因在其他植物中的相關(guān)功能已經(jīng)有所報道，所以推測它們在茶樹的休眠和萌發(fā)中也發(fā)揮一定的作用。

3.3 基于遺傳圖譜精細化定位的分析與展望

基于遺傳連鎖圖譜進行QTL 定位是研究數(shù)量性狀經(jīng)典的遺傳學(xué)方法[33]。影響遺傳圖譜質(zhì)量的重要因素是群體單株數(shù)量以及分子標記數(shù)量[34]。由于茶樹自交不育的特性，以及幼年期往往超過3 年，采用人工雜交方式繁育單株費時費力，所以培育合適數(shù)量的茶樹群體較為困難，導(dǎo)致茶樹正向遺傳學(xué)的研究進展緩慢。在茶樹上，遺傳圖譜作圖群體數(shù)量≥200，平均分子標記＜0.5 cM 的茶樹遺傳圖譜至今僅有2 張[10，12]。本研究使用的遺傳圖譜（n=327）和平均分子標記間距排名都居于前列，但是定位的TBF 的置信區(qū)間仍較大，難以精細定位到候選基因，僅僅依靠增加群體數(shù)量來進一步精細定位置信區(qū)間難以實現(xiàn)。將來可以在置信區(qū)間內(nèi)開發(fā)更多數(shù)量的分子標記，從而進一步縮小候選區(qū)間來鎖定重要基因；或通過QTL 定位與RNA-seq 相結(jié)合的方式提供更多的信息從而確定候選基因；以及利用分離群體分組分析法（Bulked segregation analysis）[35]篩選差異基因片段。這些都是基于遺傳群體用來快速精細定位候選基因的有效方法。

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