細(xì)胞蠟塊抗酸染色在淋巴結(jié)結(jié)核診斷中的應(yīng)用

【摘要】 目的：探討淋巴穿刺液細(xì)胞蠟塊抗酸染色在淋巴結(jié)結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法：納入贛州市第五人民醫(yī)院2021年1月—2022年6月收治的100例疑似淋巴結(jié)結(jié)核患者。所有患者均采集淋巴結(jié)抽吸液標(biāo)本，均行直接涂片及細(xì)胞蠟塊抗酸染色、瑞氏-吉姆薩染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較不同方法診斷淋巴結(jié)結(jié)核的價(jià)值。結(jié)果：100例患者經(jīng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)確診淋巴結(jié)結(jié)核38例（38.00%）。涂片抗酸染色法診斷準(zhǔn)確度為73.00%，敏感度為34.21%，特異度為96.77%；細(xì)胞蠟塊抗酸染色法診斷準(zhǔn)確度為85.00%，敏感度為78.95%，特異度為88.71%；瑞氏-吉姆薩染色法診斷準(zhǔn)確度為83.00%，敏感度為73.68%，特異度為88.71%。以上三種方法與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性Kappa值分別為0.351、0.680、0.634。結(jié)論：淋巴結(jié)穿刺液細(xì)胞蠟塊抗酸染色法在淋巴結(jié)結(jié)核診斷中具有較高的診斷效能，相較于傳統(tǒng)的涂片抗酸染色法、瑞氏-吉姆薩染色法，其診斷準(zhǔn)確度更高。

【關(guān)鍵詞】 淋巴結(jié)結(jié)核 臨床診斷 細(xì)胞蠟塊技術(shù) 抗酸染色法 細(xì)胞學(xué)

Application of Acid-fast Staining of Cell Wax Block in the Diagnosis of Lymph Node Tuberculosis/PENG Haiying， ZENG Jiang， LAI Xiaoju， ZHANG Runlan. //Medical Innovation of China， 2023， 20（22）： -138

[Abstract] Objective： To explore the the value of acid-fast staining of cell wax block in lymphopuncture fluid in the diagnosis of lymph node tuberculosis. Method： A total of 100 patients with suspected lymph node tuberculosis admitted to the Fifth People's Hospital of Ganzhou from January 2021 to June 2022 were included. Lymph node aspiration fluid samples were collected from all patients， and all of them underwent direct smear and cell wax block acid-fast staining， Wright's-Giemsa staining and Mycobacterium tuber-culosis culture. Taking the result of Mycobacterium tuber-culosis culture as the gold standard， the value of different methods in the diagnosis of lymph node tuberculosis were compared. Result： Among 100 patients， 38 cases （38.00%） were diagnosed as lymph node tuberculosis by Mycobacterium tuber-culosis culture. The diagnostic accuracy， sensitivity and specificity of smear acid-fast staining respectively was 73.00%， 34.21% and 96.77%. The diagnostic accuracy， sensitivity and specificity of cell wax block acid-fast staining diagnostic respectively was 85.00%， 78.95% and 88.71%. The diagnostic accuracy， sensitivity and specificity of Wright's-Giemsa staining respectively was 83.00%， 73.68% and 88.71%. The consistency Kappa values between the above three methods and the gold standard respectively was 0.351， 0.680 and 0.634. Conclusion： The acid-fast staining of cell wax block of lymph node aspiration fluid has higher diagnostic efficacy in the diagnosis of lymph node tuberculosis， compared with the traditional smear acid-fast staining and Wright's-Giemsa staining， the diagnostic accuracy is higher.

[Key words] Lymph node tuberculosis Clinical diagnosis Cell wax block technique Acid-fast staining method Cytology

First-author's address： The Fifth People's Hospital of Ganzhou， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.22.032

淋巴結(jié)結(jié)核是指結(jié)核分枝桿菌在淋巴系統(tǒng)內(nèi)存儲、繁殖而形成的淋巴感染，常見于頸部，好發(fā)于兒童及青少年，臨床表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大，或伴疼痛、發(fā)熱等癥狀，隨著病情進(jìn)展可能導(dǎo)致多發(fā)淋巴結(jié)受累，且該病晚期預(yù)后較差，因此需早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療[1-3]。臨床診斷方法包括組織活檢、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等，由于組織活檢具有創(chuàng)傷性，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)耗時(shí)長且成本較高，導(dǎo)致應(yīng)用受限。因此需尋找更便捷、實(shí)用且準(zhǔn)確度較高的檢查方法?？顾崛旧ㄊ墙Y(jié)核疾病的常見檢查手段，將采集標(biāo)本直接涂布于載玻片固定后染色，但直接涂片導(dǎo)致抗酸桿菌的聚集性相對較差，陽性率相對較低[4-6]。細(xì)胞蠟塊技術(shù)即采用蠟液包埋的方式將體液、痰液、組織細(xì)胞等標(biāo)本制成細(xì)胞蠟塊，可有效保存細(xì)胞成分，且可相對提高細(xì)胞聚集性，提高檢出率。近年來，細(xì)胞蠟塊技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞病理學(xué)診斷中，如胸腹水、子宮頸癌及其他婦科疾病中均有學(xué)者證實(shí)細(xì)胞蠟塊技術(shù)有顯著應(yīng)用價(jià)值，其特異度和準(zhǔn)確度均較高，值得臨床推廣應(yīng)用[7-10]?；诖耍狙芯恐荚谔接懠?xì)胞蠟塊技術(shù)聯(lián)合抗酸染色法在淋巴結(jié)結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取贛州市第五人民醫(yī)院2021年1月—2022年6月收治的100例行淋巴結(jié)穿刺檢查的患者。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①疑似淋巴結(jié)結(jié)核：根據(jù)患者臨床癥狀、病史等進(jìn)行綜合計(jì)分，觸診可見成堆淋巴結(jié)、實(shí)驗(yàn)室檢查顯示結(jié)核抗體陽性或結(jié)核菌素試驗(yàn)陽性、X線顯示活動性肺結(jié)核、出現(xiàn)竇道均計(jì)2分，淋巴結(jié)腫大數(shù)量gt;3個(gè)、多部位出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、具有發(fā)熱、盜汗等臨床癥狀、年齡30歲以下均計(jì)1分，綜合得分gt;5分考慮為淋巴結(jié)結(jié)核[11]；②行淋巴結(jié)穿刺檢查；③臨床資料完整。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤性淋巴結(jié)病變；②檢查前已進(jìn)行抗結(jié)核或手術(shù)治療。其中男37例，女63例；年齡19～67歲，平均（43.11±7.86）歲；病程2～4周，平均（3.11±0.28）周；病變部位：頸部78例、腋下13例、腹股溝9例。本研究已經(jīng)通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 取材方法 局部消毒淋巴結(jié)腫塊，左手固定腫大淋巴結(jié)，采用10 mL一次性注射器和7號注射針頭刺入腫塊，負(fù)壓多方位抽吸取材1 mL，一式4份。

1.2.2 檢驗(yàn)方法

1.2.2.1 涂片抗酸染色 以上標(biāo)本，一份直接涂片行抗酸染色：抽取液直接涂于載玻片，采用石炭酸復(fù)紅溶液（5%）染色15 min，后采用5%酸性乙醇液脫色（3～5 s/次，共2次）至無色，水洗后加堿性美蘭復(fù)染5 min，后洗去多余染液，冷風(fēng)吹干后采用中性樹膠封固，鏡下背景顯示藍(lán)色，抗酸桿菌顯示紅色。

1.2.2.2 細(xì)胞蠟塊抗酸染色 一份標(biāo)本制成細(xì)胞蠟塊后再進(jìn)行抗酸染色：采用玻片法制作細(xì)胞蠟塊，將淋巴結(jié)抽吸液標(biāo)本推至玻片采用針尖將細(xì)胞聚集成團(tuán)，使用95%酒精短暫硬化，再用10%的中性甲醛溶液固定30 min，輕刮取細(xì)胞團(tuán)塊用濾紙包裹后置入包埋盒，浸入10%的中性甲醛溶液固定2 h，脫水后整齊放入裝有蠟液的浸蠟容器內(nèi)包埋，再采用LEICA 2245切片機(jī)切片（厚5 μm），將石蠟切片貼附于載玻片后采用電熱恒溫箱65 ℃烤片20 min，使用松節(jié)油脫蠟（共2次，10 min/次），沖洗切片表面油性物后使用抗酸染色法進(jìn)行染色處理。

1.2.2.3 瑞氏-吉姆薩染色 一份標(biāo)本采用瑞氏-吉姆薩染色法進(jìn)行染色：將抽吸液涂片，干燥后用10%的中性甲醛溶液固定，瑞氏-吉姆薩染液染色10～15 min后采用PBS溶液漂洗后沖洗數(shù)秒，常規(guī)封片，由專業(yè)病理科醫(yī)師采用顯微鏡觀察病變細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征，鏡下見細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為紅色。

1.2.2.4 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 一份標(biāo)本使用氫氧化鈉溶液（40 g/L）處理后接種在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基內(nèi)，環(huán)境溫度調(diào)為37 ℃，觀察4周，若結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基斜面有結(jié)核分枝桿菌菌落生長則記為陽性，反之則為陰性。同時(shí)對非結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進(jìn)行鑒定。

一次性注射器、包埋盒、載玻片、蓋玻片均購自江蘇世泰公司，染色液、羅氏培養(yǎng)管均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。標(biāo)本采集、細(xì)胞蠟塊制作、鏡檢、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)均由同組專業(yè)病理醫(yī)師及檢驗(yàn)師完成。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

抗酸染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以100個(gè)油鏡視野為單元，單元內(nèi)無抗酸桿菌判為（-）、可見1～9條抗酸桿菌判為（±）、可見10～99條抗酸桿菌判為（+）、可見100～999條抗酸桿菌判為（++）、可見≥1 000條抗酸桿菌判為（+++），（+）、（++）、（+++）均為陽性結(jié)果[12]。淋巴結(jié)結(jié)核分型：多見成熟型小淋巴細(xì)胞、原幼淋巴細(xì)胞增生，或可見少量類上皮細(xì)胞為1型；可見少量類上皮細(xì)胞及少量結(jié)核結(jié)節(jié)為2型；可見大量類上皮細(xì)胞及結(jié)核結(jié)節(jié)，或可見朗格罕巨細(xì)胞為3型；可見干酪樣壞死組織為4型；可見大量增生及纖維結(jié)締組織為5型[13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字²檢驗(yàn)；各診斷方法與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的一致性分析采用配對四表格字²檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，100例患者中共檢出38例，其中頸部27例（71.05%）、腋下9例（23.68%）、腹股溝2例（5.26%）；陰性62例，其中46.77%（29/62）為非特異性淋巴結(jié)炎，38.71%（24/62）為壞死性淋巴結(jié)炎，14.52%（9/62）為肉芽腫性病變。

2.2 不同檢查方法結(jié)果比較

以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。涂片抗酸染色法陽性率為15.00%（15/100），漏診率為65.79%（25/38），誤診率為3.23%（2/62，2例診斷為淋巴結(jié)結(jié)核改變，最終證實(shí)均為非特異性淋巴結(jié)炎）。細(xì)胞蠟塊抗酸染色法陽性率為37.00%（37/100），漏診率為21.05%（8/38），誤診率為11.29%（7/62，7例診斷為淋巴結(jié)結(jié)核改變，最終證實(shí)4例為肉芽腫性病變、3例為壞死性淋巴結(jié)炎）。瑞氏-吉姆薩染色法陽性率為35.00%（35/100），漏診率為26.32%（10/38），誤診率為11.29%（7/62，7例均鏡下見類上皮細(xì)胞，診斷為淋巴結(jié)結(jié)核改變，最終證實(shí)3例為非特異性淋巴結(jié)炎、2例為壞死性淋巴結(jié)炎、2例為肉芽腫性炎）。上述三種檢測方法陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字²=14.376，Plt;0.05），其中細(xì)胞蠟塊抗酸染色法檢測的準(zhǔn)確度最高，與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性最好。見表1、2。

3 討論

淋巴結(jié)結(jié)核往往由肺結(jié)核繼發(fā)而來，好發(fā)于免疫力低下者，淋巴結(jié)最常見的部位是頸部。臨床表現(xiàn)為淋巴結(jié)增大、質(zhì)硬、互不粘連且可移動的特點(diǎn)，隨著病情進(jìn)展，結(jié)核灶破潰可引發(fā)感染，甚至遷徙至脊柱、關(guān)節(jié)等部位形成冷膿腫，嚴(yán)重危害患者生命健康[14]。因此，淋巴結(jié)結(jié)核一旦確診需及時(shí)予以規(guī)范治療以防止病情惡化。目前常以臨床病史結(jié)合病理活檢進(jìn)行診斷，但病理活檢存在耗時(shí)長、費(fèi)用貴的缺點(diǎn)，亟需一種診斷效能高、操作簡單、耗時(shí)短的檢測方法進(jìn)行淋巴結(jié)結(jié)核的臨床診斷。

抗酸染色法以5%石炭酸復(fù)紅在加熱條件下染色可使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合，不易脫色。目前抗酸染色法在臨床結(jié)核檢測中被廣泛應(yīng)用[15-16]。本研究中細(xì)胞直接涂片抗酸染色法抗酸桿菌檢出率為15.00%、漏診率為65.79%、誤診率為3.23%，與陳中秀等[17]研究結(jié)果接近，說明直接涂片后染色陽性檢出率相對較低，容易造成漏診情況發(fā)生，可能因?yàn)椋褐苯油科墓潭ㄐЧc標(biāo)本中抗酸桿菌量有關(guān)，且惡性上皮細(xì)胞的極性較差，直接涂片中抗酸桿菌的聚集性相對較差，因此檢出率較低，漏診率較高。為解決這一問題，有學(xué)者提出集菌涂片，如楊劍鋒等[18]研究證實(shí)離心集菌涂片法可有效提高細(xì)菌檢出率，避免漏檢。

細(xì)胞蠟塊技術(shù)是將含脫落細(xì)胞體液、灌洗液或直接采用細(xì)針穿刺吸取的細(xì)胞液采用蠟液包埋制成細(xì)胞蠟塊，可將細(xì)胞成分保存在蠟塊中以判別細(xì)胞性質(zhì)、類型。本研究中細(xì)胞蠟塊抗酸染色法中陽性率為37.00%，漏診率為21.05%，誤診率為11.29%，漏診率明顯低于直接涂片法。分析原因?yàn)椋杭?xì)胞質(zhì)由Golgi體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和代謝物等組成，是細(xì)胞染色的重要影響因素，細(xì)胞質(zhì)變性可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物溢出。細(xì)胞蠟塊技術(shù)有利于完整保存標(biāo)本，降低標(biāo)本中細(xì)胞質(zhì)變性風(fēng)險(xiǎn)，且細(xì)胞蠟塊制作時(shí)采用針尖將細(xì)胞聚集成團(tuán)，可增加細(xì)胞的聚集性，提高陽性檢出率，降低漏診率和誤診率[19-20]。相對而言，直接涂片法不利于抗酸桿菌成團(tuán)聚集，且未經(jīng)包埋的標(biāo)本經(jīng)反復(fù)沖洗、晾干可能破壞細(xì)胞質(zhì)，不利于染色，導(dǎo)致檢出率較低，漏診率較高。此外，抗酸染色法也有局限性，因?yàn)榕ň?、放線菌等在抗酸染色法中也顯示陽性結(jié)果，易造成誤診，導(dǎo)致診斷效能較低，故臨床檢驗(yàn)中需注意鑒別結(jié)核菌與奴卡菌、放線菌等細(xì)菌。

為進(jìn)一步研究細(xì)胞蠟塊技術(shù)在淋巴結(jié)結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值，本研究采用瑞氏-吉姆薩染色法對其中一份標(biāo)本進(jìn)行染色處理，其陽性率為35.00%，漏診率為26.32%，漏診率較細(xì)胞蠟塊抗酸染色法高。分析原因?yàn)椋喝鹗?吉姆薩染色法是通過辨別細(xì)胞形態(tài)判斷淋巴結(jié)是否病變，不僅淋巴結(jié)結(jié)核會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變，非特異度淋巴結(jié)炎、壞死性淋巴結(jié)炎等也可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變，如類上皮細(xì)胞不僅見于淋巴結(jié)感染結(jié)核分枝桿菌，還見于淋巴結(jié)炎性病變的細(xì)胞學(xué)變化之中，因此類上皮細(xì)胞改變對于結(jié)核分枝桿菌感染特異度較低。此外，淋巴結(jié)結(jié)核干酪型無特異性細(xì)胞學(xué)改變，與癌性等原因引起的壞死難以區(qū)分，導(dǎo)致準(zhǔn)確度降低。因此，采用瑞氏-吉姆薩染色法檢測淋巴結(jié)結(jié)核病變時(shí)需注意區(qū)分鑒別壞死性淋巴結(jié)炎、非特異度淋巴結(jié)炎等病變。此外，該項(xiàng)技術(shù)的專業(yè)難度較高，考驗(yàn)檢驗(yàn)科人員的專業(yè)性，且受取材范圍、標(biāo)本質(zhì)量等因素的影響較大，導(dǎo)致出現(xiàn)誤診、漏診發(fā)生。

綜上所述，淋巴結(jié)穿刺液細(xì)胞蠟塊抗酸染色法在淋巴結(jié)結(jié)核診斷中應(yīng)用價(jià)值顯著，相較于傳統(tǒng)的直接涂片抗酸染色法、瑞氏-吉姆薩染色法，診斷準(zhǔn)確度更高。

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