干眼動物模型建立與研究進展

陳 鵬，孔歡歡，桂 煜，孫麗娟

空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院眼科，陜西 西安 710032)

干眼是一種由多因素引起淚膜不穩(wěn)定、眼表結(jié)構(gòu)狀態(tài)異常的慢性疾病。我國5～89歲人群的干眼患病率為13.55%，約1.7億人受到此病困擾，有干眼癥狀的人群大約有3.9億，占人口總數(shù)的31.40%[1]。由此可見，干眼已逐漸成為亟待解決的眼科常見病之一。

覆蓋在角膜表面的3層淚膜結(jié)構(gòu)(脂質(zhì)層、水液層、黏蛋白層)是維持屈光狀態(tài)，濕潤保護角膜和結(jié)膜上皮，使其避免受到感染、外傷和環(huán)境刺激，維持眼表微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。眼部結(jié)膜、角膜上皮、淚腺、瞼板腺、神經(jīng)以及組織中的炎癥因子和免疫細胞通過影響淚膜的穩(wěn)定性和完整性，引起炎性細胞浸潤、組織結(jié)構(gòu)損傷和角膜神經(jīng)異常等病理改變，使眼表微環(huán)境遭到破壞，發(fā)生干眼[2]。

由于干眼的多因素致病特征，本文按照干眼的臨床特征分類，將干眼動物模型分為水液缺乏型、蒸發(fā)過強型和混合型三類[3]。水液缺乏型是通過淚腺切除、動物先天性淚腺功能障礙、動物自身免疫性疾病、神經(jīng)阻滯、全身或者局部應(yīng)用藥物等方式影響淚腺分泌功能建立模型；蒸發(fā)過強型主要通過燒灼瞼板腺口、干燥環(huán)境應(yīng)激、局部應(yīng)用藥物破壞淚膜脂質(zhì)層和黏蛋白層引起淚膜動力學異常誘導干眼體征；實驗中通常在淚液缺乏動物的基礎(chǔ)上進行干燥環(huán)境應(yīng)激、局部應(yīng)用藥物或去勢手術(shù)等方式建立模型，這種以兩種方式建立的稱為混合型干眼模型。

1 水液缺乏型干眼模型

1.1 淚腺的切除與損毀

不同實驗動物淚腺構(gòu)造存在種屬差異，淚腺切除后淚液的分泌量、眼表炎癥的持續(xù)時間和模型的可逆性均不一致。MECUM等[4]研究發(fā)現(xiàn)雌性小鼠的角膜更容易受到淚腺切除影響。SHINOMIYA等[5]在眶外淚腺切除的小鼠模型基礎(chǔ)上，摘除眶內(nèi)淚腺，使得模型的干眼體征更加明顯。FAKIH等[6]利用切除淚腺建模研究參與干眼相關(guān)疼痛發(fā)展的外周致敏和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，有助于識別減輕眼部疼痛的新分子。

ROCHA等[7]通過8 Gy連續(xù)輻射5 d成功誘導小鼠干眼。與切除小鼠淚腺不同，此類模型在輻照結(jié)束2個月后，變薄的角膜上皮恢復(fù)，角膜基質(zhì)增厚等炎性體征可逐漸消失。如果在小鼠接受輻照前，將腺病毒載體介導的促紅細胞生成素基因轉(zhuǎn)移到小鼠唾液腺進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)干眼體征和角膜損傷得到恢復(fù)[7]。完全切除兔的淚腺(主淚腺、第三眼瞼上腺和哈氏腺)，干眼體征穩(wěn)定持續(xù)[8]，而部分切除兔的淚腺并不給予額外干預(yù)，淚液分泌代償性增加，干眼體征和角膜炎癥反應(yīng)在4個月內(nèi)逐漸好轉(zhuǎn)[9]。這種干眼模型因其可逆性常用于治療藥物的開發(fā)。

1.2 淚腺神經(jīng)功能障礙

淚腺分泌淚液需要正常的神經(jīng)支配、充足的血液循環(huán)和腺體結(jié)構(gòu)與功能完整。神經(jīng)阻滯模型可以通過阻斷神經(jīng)傳導來抑制淚腺分泌。

有學者使用射頻探針損毀兔的三叉神經(jīng)節(jié)[10]或經(jīng)顳下巖前入路切除兔單側(cè)眼巖淺大神經(jīng)[11]，阻斷眼表神經(jīng)支配，實驗眼出現(xiàn)結(jié)膜杯狀細胞密度減少和角膜上皮糖原水平降低等干眼體征。但此種方法對手術(shù)操作有較高的要求，且低等動物神經(jīng)修復(fù)能力大于人類，因此采用這種方法建立模型應(yīng)考慮與人相近的大型哺乳動物。除手術(shù)干預(yù)，將肉毒桿菌素(botulinum toxin，BTX)注射到動物淚腺部位，可以阻斷神經(jīng)肌肉接頭和膽堿能神經(jīng)連接處乙酰膽堿的釋放。在手術(shù)顯微鏡觀察下，將1.25 mU的BTX-B注射至CBA/J小鼠淚腺持續(xù)3 d，小鼠淚液分泌量減少，有助于研究人類慢性干眼發(fā)病機制[12]。

抗膽堿藥物是毒蕈堿型乙酰膽堿受體(M受體)的競爭性拮抗劑，通過阻斷乙酰膽堿的作用，抑制副交感神經(jīng)系統(tǒng)，抑制腺體分泌。在6周齡的雌性Lewis大鼠中[13]，皮下植入東莨菪堿滲透泵誘導干眼，可見大鼠淚液分泌量減少，角膜上皮點狀缺損等明顯的干眼體征。AICHER等[14]在雄性SD大鼠皮下注射1 g/L甲基阿托品(1 mg/kg)，2次/d，連續(xù)2 d即可建立模型。該類干眼模型建立快速、簡便，但阿托品、東莨菪堿等抗膽堿藥物有一定毒副作用，對藥物劑量和用藥間隔時間有嚴格的要求。目前這種模型已廣泛用于評估人工淚液或眼部外用藥物的安全性。

Neurturin是一種副交感神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子，Neurturin-deficient(NRTN-/-)轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為與人干燥性角膜結(jié)膜炎相似的體征[15]。與同年齡的正常小鼠相比，NRTN-/-小鼠的淚液分泌量，淚膜破裂時間和角膜反射明顯降低，結(jié)膜黏蛋白和杯狀細胞密度均低于正常小鼠。該模型在研究淚腺自主感覺神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)維持眼表健康方面有一定意義。

1.3 藥物影響淚腺分泌

T細胞有絲分裂原刀豆蛋白是一種植物血凝素，具有強力的促有絲分裂作用，HONKANEN等[16]將其注射于兔雙側(cè)主淚腺，發(fā)現(xiàn)兔眼淚液分泌減少，眼表炎癥反應(yīng)明顯，淚腺結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴重破壞，可建立穩(wěn)定的干眼模型[17]。

ZOUKHRI等[18]在小鼠淚腺中注射IL-1，抑制淚腺分泌功能，使淚液分泌減少、淚腺腺泡上皮細胞破壞、炎癥反應(yīng)明顯，建立一種可逆的淚液缺乏型干眼動物模型。

1.4 自主免疫影響淚腺功能

該類動物模型一般通過特定的基因編輯技術(shù)誘導突變，導致自身免疫失衡，外分泌腺中大量炎性細胞浸潤，使淚腺功能受損，淚液分泌量減少，出現(xiàn)干眼體征，是模擬人類自身免疫性干眼的理想模型，但該類模型同時伴有其他器官或系統(tǒng)的損傷，造模時間一般較長(表1)。

表1 自身免疫性疾病相關(guān)的干眼癥模型

NOD小鼠是由MAKINO等[19]開發(fā)的1型糖尿病小鼠模型，16周齡以上的NOD小鼠患自身免疫性胰島素依賴型糖尿病，外分泌腺中炎性細胞浸潤，淚腺分泌功能受損，淚液減少。12～16周齡NOD小鼠淚腺中，IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、IFN-γ、TNF-α等水平明顯增加，與人類自身免疫性干眼中炎性因子的類別相似[20]。雄性NOD小鼠的自身免疫性淚腺炎發(fā)病率較高，可能與性激素水平有關(guān)。因此NOD小鼠是研究性別相關(guān)的原發(fā)性自主免疫性干眼的理想模型[21]。但伴有1型糖尿病的NOD小鼠需要長期注射胰島素，增加飼養(yǎng)成本，還可能影響實驗結(jié)果，為進一步排除糖尿病對造模的影響，ROBINSON等[22]建立了一種NOD小鼠衍生的B10.H2b小鼠模型，僅出現(xiàn)外分泌腺淋巴細胞浸潤功能障礙而沒有糖尿病癥狀。

MRL/lpr小鼠是一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡動物模型，與NOD小鼠模型不同，雌性MRL/lpr小鼠的淚腺炎癥嚴重程度明顯高于雄性小鼠，表現(xiàn)為淚液分泌減少，淚腺中淋巴細胞浸潤，有抗SSA和抗SSB抗體產(chǎn)生[23]，有學者發(fā)現(xiàn)，將p38-MAPK抑制劑SB203580注射到淚腺中可改善淚腺分泌功能。證實p38-MAPK途徑在MRL/lpr小鼠干眼模型中起著重要作用[24]。

RbAp48轉(zhuǎn)基因小鼠中視網(wǎng)膜母細胞瘤相關(guān)蛋白48是控制細胞生長和凋亡的一種多功能蛋白質(zhì)分子，ISHIMARU等[25]研究發(fā)現(xiàn)RbAp48轉(zhuǎn)基因鼠的淚腺上皮細胞出現(xiàn)特異性凋亡，影響淚腺分泌功能，敲除RbAp48基因，可抑制淚腺細胞凋亡。切除小鼠卵巢后，凋亡的淚腺上皮細胞中RbAp48的表達量增加，這提示RbAp48在雌激素缺乏介導的干眼中起一定作用。RbAp48轉(zhuǎn)基因小鼠是研究淚腺上皮細胞凋亡的理想模型，但該模型完全依賴于人工過表達RbAp48，與人類干眼的自然病程不符。

Aire-/-小鼠，由于常染色體隱形基因Aire基因突變出現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)功能不全，甲狀旁腺功能減退、慢性皮膚感染，以及眼部并發(fā)癥。還表現(xiàn)為許多眼部并發(fā)癥[26]。如淚液分泌減少，淚腺大量的淋巴細胞浸潤及角膜新生血管增加等[27]。Aire-/-小鼠是研究自身免疫性干眼機制的常用模型。在IL-1受體拮抗劑治療自身免疫性干眼和乳蛋白促進淚液分泌療效方面的研究中已廣泛應(yīng)用[28]。

研究人員建立了其他具有干眼癥狀的自主免疫性小鼠模型。Aly/aly小鼠的常染色體隱性基因純合子突變出現(xiàn)淋巴組織發(fā)育不全，淚腺發(fā)生以CD4+T細胞浸潤為主的慢性炎癥變化[29]。IQI/Jic小鼠與NFS/sld小鼠和其他自主免疫模型相比，需在培育過程中切除小鼠胸腺建立干眼模型，對出生3 d的IQI/Jic小鼠切除胸腺，小鼠在16周出現(xiàn)淚腺病變[30]。NFS/sld小鼠出生3 d后行胸腺切除術(shù)，外分泌腺出現(xiàn)以CD4+T細胞為主的淋巴細胞浸潤[31]。

NZB/WF1小鼠和BXSB/MpJ-Yaa小鼠是系統(tǒng)性紅斑狼瘡動物模型，疾病累及淚腺，可出現(xiàn)典型的干眼癥狀。雄性BXSB/MpJ-Yaa小鼠因Y染色體上的Y連鎖自身免疫加速突變使得干眼癥狀更為嚴重[32]。Id3KO小鼠唾液和淚液的分泌明顯減少[33]，是一種細胞和體液免疫共同參與疾病的模型。PI3KKO小鼠胸腺細胞發(fā)育不良，出現(xiàn)角膜損傷，淚腺腺泡結(jié)構(gòu)破壞，導管直徑變粗，伴有以CD4+T細胞為主的淋巴細胞浸潤[34]。Act-1-/-小鼠淚腺中存在嚴重的B220+細胞、CD4+T和CD8+T細胞浸潤，破壞淚腺的分泌功能[35]。CD25KO小鼠淚腺中Th1和Th17因子增加導致淚腺萎縮纖維化[36]。TSP-1KO小鼠淚腺CD4+T細胞浸潤，上皮細胞凋亡壞死[37]。

這些模型外分泌腺中出現(xiàn)嚴重的淋巴細胞浸潤，唾液和眼淚的分泌量明顯減少，均可作為一種干眼模型來研究人類自身免疫性干眼。

2 蒸發(fā)過強型干眼動物模型

蒸發(fā)過強型干眼動物模型，一般是通過誘導眼表炎癥影響淚膜穩(wěn)定性建立模型。

瞼板腺分泌脂質(zhì)形成了淚膜脂質(zhì)層，可穩(wěn)定淚膜，灼燒封閉兔瞼板腺口，間接破壞淚液脂質(zhì)層可促進淚液的蒸發(fā)，淚膜破裂時間減少，淚液滲透壓增高，結(jié)膜杯狀細胞和角膜上皮糖原減少，出現(xiàn)典型干眼體征[38]。JIN等[39]認為1-25-二羥基-22-氧骨化三醇作為一種臨床上用于治療銀屑病的維生素D3類似物，可緩解瞼板腺萎縮和導管擴張，提示維生素D及其類似物在維持眼表健康方面起著重要作用。MIYAKE等[40]將完全弗氏佐劑(滅活的結(jié)核分枝桿菌)分別注射到兔鼻側(cè)、中部和顳側(cè)上眼瞼邊緣，建立瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction，MGD)模型，兩周后出現(xiàn)干眼體征。有學者對大鼠、兔眼局部應(yīng)用高濃度腎上腺素或全身應(yīng)用異維A酸，異維A酸通過PPAR-γ途徑，影響瞼板腺細胞分化，瞼板腺導管口上皮過度角化、建立MGD模型[41-42]。載脂蛋白C1轉(zhuǎn)基因小鼠[43]和ACAT-1-/-小鼠[44]等轉(zhuǎn)基因動物模型，有不同程度瞼板腺功能異常，引發(fā)眼表慢性炎癥。

使用開瞼器或縫線固定眼瞼或者將小鼠在低濕度氣流持續(xù)暴露，出現(xiàn)淚液分泌量減少和角膜點狀潰瘍，暴露時間越長，角膜干燥斑越明顯。而將濕度控制恒定，環(huán)境溫度升高時，小鼠淚膜破裂時間也會下降[45]。這在生物學和形態(tài)學變化方面與人類干眼相似，且較為容易建立模型。

局部應(yīng)用藥物也可破壞淚膜穩(wěn)定。苯扎氯銨作為滴眼液中常用的防腐劑能夠影響淚膜穩(wěn)定、結(jié)膜杯狀細胞缺失、結(jié)膜鱗狀化生[46]?？衫酶邼舛缺皆蠕@建立干眼模型。李晶等[47]用高滲鹽水局部滴小鼠眼，可見淚液分泌量減少，角膜上皮基底部細胞排列紊亂缺失，出現(xiàn)空泡，引起類似干眼的病理損害，為探索淚液高滲透壓導致干眼的機制提供思路。

有研究認為空氣污染指數(shù)的升高會增加干眼癥的發(fā)病率，LI等[48]用大氣污染物制備的滴眼液誘導建立干眼動物模型，將5.0 g/L PM10滴眼液滴小鼠眼，4次/d，持續(xù)14 d，小鼠角膜上皮增厚，伴有細胞損傷和脫落，角膜表面光滑度降低，角膜上皮微絨毛縮短無序。使用頸部約束器將大鼠暴露于約500 μg/m3城市污染物中[49]，5 h/d，連續(xù)5 d，可誘導大鼠角膜上皮細胞凋亡，結(jié)膜杯狀細胞減少，破壞淚膜粘蛋白層。

3 混合型干眼動物模型

有學者將干燥應(yīng)激與藥物干預(yù)結(jié)合建立干眼模型，將小鼠暴露在干燥環(huán)境中，同時皮下注射東莨菪堿，小鼠淚腺分泌量減少、角膜熒光染色異常、結(jié)膜杯狀細胞和角膜上皮細胞凋亡、炎癥因子水平增加，干眼體征穩(wěn)定，而被廣泛應(yīng)用[50]。

LI等[51]將兔淚腺完全切除的基礎(chǔ)上用50 g/mL三氯乙酸燒灼角膜，淚液減少直接損害了結(jié)膜的杯狀細胞，破壞了淚膜黏蛋白層。造模更迅速，干眼體征更明顯。

維生素是調(diào)節(jié)眼的發(fā)育和眼表正常分化的重要營養(yǎng)物質(zhì)[52]。對兔進行維生素A完全缺乏飼料喂養(yǎng)6個月，實驗組兔體質(zhì)量較輕，毛發(fā)粗糙，角膜干燥無光澤，可見灰白色潰瘍灶，淚液分泌量減少，成功建立干眼模型。在此模型中NF-κBp65、NOS2過表達，可能參與干眼的發(fā)生。

SINGH等[53]將雌性Wistar大鼠雙側(cè)卵巢切除，發(fā)現(xiàn)淚液分泌量減少，出現(xiàn)干眼體征。LI等[54]對雌性Wistar大鼠非那雄胺胃灌注4周，淚腺中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、Fas-L和TNF-α等炎性因子升高，淚液分泌量減少，同時發(fā)生MGD，建立一種由雄激素缺乏誘導的干眼模型?？剐奂に貏游锬Ｐ彤a(chǎn)生明顯的干眼體征，可用于了解絕經(jīng)后和雄激素缺乏干眼的疾病過程。

年齡是干眼的重要危險因素，有學者發(fā)現(xiàn)12月齡以上的C57BL/6小鼠瞼板腺功能異常，淚腺中MMP-9過表達、炎癥因子增加、CD4+T和CD8+T細胞浸潤，可作為研究年齡相關(guān)慢性干眼的模型[55]。

4 討論

目前基于多種實驗動物建立的干眼模型類型較多，除常規(guī)實驗動物外，有學者基于探索人類PAX6突變的斑馬魚角膜模型[56]，提出有將斑馬魚等新型實驗動物開發(fā)成干眼動物模型的可能。實驗研究中應(yīng)根據(jù)干眼的嚴重程度與病理生理學機制的不同正確選擇干眼動物模型。一般來說，淚液缺乏型干眼模型多通過阻礙淚腺分泌功能來建立。淚腺切除術(shù)(切除瞬膜和哈德氏腺)、淚腺神經(jīng)阻滯，可引起嚴重的淚液分泌障礙，但需要高水平的手術(shù)技術(shù)并熟悉實驗動物解剖。局部應(yīng)用化學藥品，可迅速建立模型，不過這些不能完全模擬自主免疫性干眼。自身免疫性疾病動物模型表現(xiàn)為包括淚腺損傷在內(nèi)的多器官炎癥病變，淚腺中有明顯淋巴細胞浸潤[57]。蒸發(fā)過強型干眼模型可通過瞼板腺功能障礙實現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)基因鼠，ACAT-1KO小鼠、TRAF6KO小鼠、Barx2KO小鼠，表現(xiàn)為瞼板腺的異常發(fā)育，發(fā)生MGD[58]。也有學者利用煙草煙霧[59]和大氣污染物等建立干眼模型，用以研究環(huán)境因素對干眼疾病發(fā)展的影響。干眼在女性的患病率高于男性，雄激素對淚腺及瞼板腺分泌功能有調(diào)控作用，將雄性大鼠睪丸摘除[60]，瞼板腺和淚腺上皮細胞萎縮，淚液分泌量持續(xù)降低，淚膜破裂時間縮短，角膜熒光異常。

當前，干眼動物模型的研究進展迅速，許多治療藥物開發(fā)正是基于這些干眼動物模型得到重要結(jié)果。但是人類干眼發(fā)病涉及復(fù)雜的病理生理機制和免疫反應(yīng)，沒有哪種干眼動物模型可以作為研究的最佳工具，需要我們建立更全面、更精細的干眼模型來分析干眼發(fā)病機制，尋找治療的新靶點。