人真皮微血管內(nèi)皮細胞的分離、純化、鑒定研究進展

董瑞娜，王炳坤，呂雅潔，曹天宇，張衍國

空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院皮膚科，陜西 西安 710038)

血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)是血管管腔內(nèi)側(cè)的單層細胞，可以感受血液中的信號并及時做出反應。同時VECs在血管生成、血管內(nèi)外物質(zhì)交換和凝血等方面都扮演著重要角色[1]。不同解剖部位VECs在結(jié)構(gòu)和功能上存在明顯異質(zhì)性[2]。例如，在結(jié)構(gòu)上，大腦血管中連接緊密的內(nèi)皮細胞有助于血腦屏障的形成，而不連續(xù)的內(nèi)皮細胞排列則構(gòu)成肝臟的竇狀結(jié)構(gòu)以促進物質(zhì)交換[1]。在功能上，免疫方面，皮膚微血管內(nèi)皮細胞(microvascular endothelial cells，MVECs)高表達免疫相關分子人類白細胞抗原-Ⅱ(human leukocyte antigen-Ⅱ，HLA-Ⅱ)，可作為非專職型抗原呈遞細胞啟動免疫應答[3]；而肝竇VECs高表達清道夫受體，使其具有更強的內(nèi)吞活性[4]，可吞噬血液中的脂質(zhì)和可溶性抗原等[5]，促進炎癥信號的傳導。在代謝方面，真皮、肝臟和胃腸道VECs多傾向于氧化磷酸化途徑，而糖異生途徑在大腦和子宮VECs中更為活躍。通過RNA測序分析，證實了哺乳動物內(nèi)皮細胞之間存在明顯的器官差異性[6]。因此，要準確反映疾病特征，應針對性培養(yǎng)相應部位的VECs，就皮膚疾病而言，應獲取皮損部位的原代MVECs進行培養(yǎng)。

許多皮膚疾病的發(fā)生發(fā)展與血管關系密切，如銀屑病、毛細血管瘤、硬皮病、瘢痕疙瘩等[7-10]。但目前，原代MVECs較難分離、純化困難且易伴隨其他細胞污染，對皮膚疾病發(fā)病機制的研究造成一定阻礙。因此，本文結(jié)合我們自身實踐，對當前文獻報道的真皮MVECs的分離、純化與鑒定方法以及其優(yōu)缺點等內(nèi)容進行總結(jié)，旨在為讀者選擇合適的方法提供參考。

1 真皮MVECs的分離

1.1 組織塊貼壁法

使用組織塊貼壁法培養(yǎng)人真皮MVECs的具體方法為：真表皮分離后，將修剪成合適大小的組織塊貼附于預先用培養(yǎng)基濕潤的培養(yǎng)皿中，于細胞孵箱靜置數(shù)小時后加入培養(yǎng)液，待組織塊周邊有細胞游離爬出后將組織塊去除[11]。

該方法經(jīng)濟且易操作，但因真皮組織中成纖維細胞為優(yōu)勢細胞，易于生長，會對MVECs的生長產(chǎn)生抑制作用，易造成培養(yǎng)過程中大量成纖維細胞污染。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，爬出的大部分細胞為成纖維細胞，MVECs很難爬出，考慮可能與其位于血管管腔內(nèi)側(cè)，難以貼壁有關。

1.2 機械按壓法

將真表皮分離后使用器械的彎曲部分對真皮施加壓力并向組織塊外側(cè)反復擠壓，將MVECs壓出，收集細胞懸液離心并將目的細胞接種于培養(yǎng)皿中[9，12-16]。

通常認為該法不易發(fā)生成纖維細胞污染，但在提取正常組織或瘢痕疙瘩MVECs的實驗操作中，我們發(fā)現(xiàn)此方法操作難度大且效率低下。可能是因為：①因組織細胞外基質(zhì)較為緊密，單純靠擠壓組織中的血管內(nèi)膜獲取MVECs具有一定難度；②操作敏感度較高，不易保持恒定的按壓力度，壓力過大可能導致成纖維細胞污染，壓力過小則難以提取真皮MVECs。因組織來源不同以及操作者個體差異，對力度的把握尚需多次嘗試。

1.3 酶消化法

1.3.1 組織塊酶消化法 應用酶制劑降解細胞外基質(zhì)，使組織分散為單個細胞或細胞團塊，通過濾器或濾網(wǎng)收集細胞懸液，離心后獲取原代細胞進行培養(yǎng)。

目前分離真皮MVECs需使用的酶制劑包括：分離酶Ⅱ、胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ、膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶，脫氧核糖核酸酶Ⅰ等。其中分離酶Ⅱ可通過降解基底膜上的半橋粒對真表皮進行分離；胰蛋白酶可作用于賴氨酸或精氨酸殘基處的羧基從而使細胞分離；膠原酶可水解結(jié)締組織中的膠原蛋白；透明質(zhì)酸酶可分解細胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸；脫氧核糖核酸酶用于降解死細胞釋放的DNA(DNA會促使細胞凝集，從而使細胞懸液過于黏稠)。通過聯(lián)合使用上述酶制劑可將MVECs從組織中分離。

另外，部分實驗室使用皮膚解離試劑盒獲取MVECs原代細胞[17-19]。該試劑盒含有酶A、D、P，可將修剪后的人全層皮膚解離為單細胞懸液，后通過解離器將單細胞從細胞外基質(zhì)中釋放出來。

1.3.2 勻漿與酶聯(lián)合法 該方法與組織塊酶消化法類似，即先進行真表皮分離，后將真皮仔細剪碎呈勻漿狀再進行酶消化。因組織與酶制劑的接觸面積增大，消化更為充分[3]。

酶消化法操作簡單，較為經(jīng)濟且所用酶制劑方便易得。但仍存在以下缺點：①純化工作量大；只可獲得混雜的皮膚組織來源細胞，無法直接獲得目的細胞，需要配合大量的后期純化工作；②干擾因素較多；消化時間長短、酶濃度高低等均可能對細胞的活力造成影響。因此，掌握酶聯(lián)合制劑的用法以及消化時長是很有必要的。下面將列舉部分酶聯(lián)合制劑的使用方法(表1)。

表1 不同酶消化法的操作條件

通過對以上三種方法的分析并結(jié)合自身實操經(jīng)驗，我們認為組織貼壁法細胞爬出時間較長(2周左右)，其次爬出的細胞大多以梭形的成纖維細胞為主，鵝卵石樣MVECs少見，且此法更常用于成纖維細胞的培養(yǎng)。同時，機械按壓法成功概率較低，首先因細胞外基質(zhì)的存在，僅靠外力很難使MVECs脫落下來，其次從脫落的絮狀組織中爬出的多為成纖維細胞。因此我們更推薦酶消化法，此法操作簡單，細胞外基質(zhì)混雜較少，可以高效地使MVECs從組織中釋放出來，具有良好應用前景。上述三種分離方法的優(yōu)缺點見表2。

表2 不同MVECs分離方法比較

1.4 其他注意事項

1.4.1 組織樣本處理 ①供體年齡不宜過大。衰老會影響血管生成能力，年輕供體的細胞增殖活力相對較強[28]。②組織應盡量新鮮。細胞活力關系著培養(yǎng)成功與否，因此原代提取應盡可能快速，以減少因環(huán)境變化引起的細胞損傷[29]。③組織樣本嚴格處理，原代提取無菌操作。對于組織預處理中使用750 mL/L乙醇進行消毒的做法，目前存在爭議，因750 mL/L乙醇會使組織脫水，處理過久可能會導致細胞的損傷。因此，樣本不可在750 mL/L乙醇中浸泡過久，可短時間浸入750 mL/L乙醇后使用大量平衡鹽溶液多次沖洗。④保存組織樣本以及原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基中需添加抗菌素。大部分文獻提出通過青霉素、鏈霉素、慶大霉素和抗真菌劑(兩性霉素B)等聯(lián)合使用以抑制細菌或真菌的產(chǎn)生。

1.4.2 細胞提取操作細節(jié) ①剔除脂肪等皮下組織，減少混雜細胞。②確保真表皮充分分離，其方式包括分離酶Ⅱ消化與表皮切除兩種。我們結(jié)合自身實踐認為，方法的選用需視皮膚狀態(tài)而定。若以真皮增厚為主要表現(xiàn)的疾病如瘢痕疙瘩等，切除表皮用時短且可避免酶對細胞的損傷，細胞活性較好。對于正常皮膚或非真皮層增生疾病，切除難度較大，更推薦采用分離酶Ⅱ進行處理，消化時長不得超過15 h[9]。③修剪組織盡可能小，以便增加細胞提取率和酶作用效果(按壓法除外，組織塊過小會增加按壓難度)。

1.4.3 細胞培養(yǎng) ①在細胞爬出的過程中，可采取半換液的方式進行培養(yǎng)。②MVECs與成纖維細胞有明顯區(qū)別。MVECs原代培養(yǎng)會形成呈同心圓狀獨立生長的細胞島。文獻中認為可通過換液時于顯微鏡下抽吸成纖維細胞將其去除[16]，但實際操作方面存在難度。

2 真皮MVECs的純化

在MVECs的分離過程中會摻雜其他細胞，其中以成纖維細胞為主，可對MVECs生長產(chǎn)生一定的抑制作用[16]。因此，純化是獲得MVECs極為關鍵的一項步驟。

2.1 差異胰蛋白酶消化

基于不同細胞貼壁能力的差異，該方法通過控制胰蛋白酶消化時長，使貼壁能力弱的細胞懸浮，從而實現(xiàn)兩種細胞的分離[11，30]。原代培養(yǎng)5～7 d后，存在生長優(yōu)勢的成纖維細胞與MVECs競爭生長[9]，此時為采用本方法去除成纖維細胞的最佳時機。

此方法經(jīng)濟且簡單易行，但尚存在以下不足：①獲得的細胞純度不高。單純依賴貼壁能力差異純化MVECs，難免會存在其他細胞污染，無法達到研究所需的細胞純度。②需要連續(xù)傳代提高細胞純度。TSOU等[8]對原代培養(yǎng)的硬皮病MVECs進行檢測，發(fā)現(xiàn)在P7時許多細胞出現(xiàn)衰老跡象。因此對于原代細胞，P2～P6為開展實驗的最佳選擇。但在純化過程中，連續(xù)的消化傳代易錯過細胞的最佳使用時機。③純化效率受外界因素影響較大。酶濃度、消化時長、外界環(huán)境溫度、細胞活力等均可影響純化MVECs的效率。若酶濃度過高可對細胞造成損傷，消化時間不當可導致其他細胞混雜，且外界溫度、細胞活力可影響酶消化細胞的時長。

2.2 流式細胞分選(fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS)

FACS采用熒光素標記不同分子[31]，通過精確的熒光過濾器和探測器，對混合細胞群中的細胞進行分類[32]。

FACS獲得的細胞純度高，可以同時分選存在多種表面標志的細胞且不影響細胞活力[33]，但也存在不足：①儀器價格昂貴；②儀器操作技術敏感性較高；③存在易發(fā)生交叉污染(其他細胞或細菌的污染)、噴嘴堵塞(細胞團塊堵塞噴嘴)和試劑消耗量較大等情況[31]。

2.3 免疫磁珠分選(magnet-activated cell sorting，MACS)

多數(shù)文獻采用MACS對MVECs進行純化[3，9，13-14，16-17，19，34-35]。MACS基于抗原抗體特異性識別的原理，使用高度特異性單克隆抗體偶聯(lián)的納米級磁化微粒對目的細胞進行特異性的磁性標記，通過高強度磁場分選進而達到分離所需細胞的目的[31]。通常需要分別進行一次CD31正篩選(VECs的表面標志)[36]和CD45-負篩選(剔除CD31+的免疫細胞)以獲得高純度的MVECs[37]。

MACS分選的細胞純度較高，設備簡單，耗時短且效率高。小的磁珠一般不影響細胞的光散射特性以及熒光抗體對細胞的標記，因此無需解離磁珠便可直接進行后續(xù)實驗。但此方法存在以下缺點：①成本較高。不能在普通試管中進行，需配備一次性分離柱。②一次只能進行一種細胞標志的分選，不可同時進行多種標志的篩選。③磁珠可能存在細胞毒性。研究表明，細胞與高濃度的磁珠長時間接觸后，被吞噬的磁珠在胞內(nèi)聚集，影響細胞的正常生理功能[38]。此外，胞內(nèi)磁珠刺激細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，高ROS水平可氧化細胞膜結(jié)構(gòu)、破壞DNA并影響基因轉(zhuǎn)錄，導致細胞生理功能下降甚至細胞死亡[39-40]。

在MACS中，需注意：①內(nèi)皮細胞與免疫磁珠的比例為關鍵參數(shù)[16]。因成纖維細胞可吞噬磁珠[38]，若磁珠數(shù)量過少，會導致部分MVECs丟失；若磁珠數(shù)量過高，會阻礙純化后期MVECs的生長，導致成纖維細胞占比增加，因此需要正確計算磁珠的需要量。所需磁珠數(shù)目可根據(jù)培養(yǎng)中成纖維細胞的比例進行計算。若出現(xiàn)較多的MVECs群，可考慮磁珠與細胞數(shù)目之比為1∶1；若成纖維細胞更多，可調(diào)整磁珠數(shù)量與細胞比例為1∶2～1∶4。②可在磁珠分選前進行兩次差異分選，提前篩去部分成纖維細胞，以提高MVECs純度[16]。上述三種純化方法的優(yōu)缺點見表3。

表3 VECs純化方法優(yōu)缺點

細胞純化是完成分離后的一個重要環(huán)節(jié)。純化方法的選擇受分離方式的影響，若選擇酶消化法進行分離，在純化環(huán)節(jié)可選擇免疫磁珠或FACS。因為分離中存在大量真皮來源的其他細胞干擾，單純通過差異胰蛋白酶消化法難以達到目標純度。MACS也可用作FACS前的預分離，以減少FACS所用時間[3]。若采用機械按壓法進行分離，純化方法可選擇差異胰蛋白酶消化法，MACS為備選方案[9]。

3 VECs的鑒定

3.1 形態(tài)學

3.1.1 光學顯微鏡觀察 60 h內(nèi)可見貼壁細胞數(shù)量持續(xù)增加，細胞多呈短梭形。3～4 d細胞形態(tài)拉長呈“紡錘形”。6～10 d細胞密集，呈典型單層“鋪路石樣”[34，41]。

3.1.2 電鏡觀察 MVECs細胞內(nèi)可見Weibel-Palade小體[34，42]，胞質(zhì)內(nèi)富含線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、發(fā)育完好的高爾基復合體，細胞表面存在鋸齒狀橋粒。

3.2 細胞標志

3.2.1 血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31) CD31是MVECs上表達最豐富的跨膜糖蛋白，與白細胞運輸、機械力傳導和血管通透性有關[2]。研究發(fā)現(xiàn)CD31抗體可抑制小鼠腫瘤內(nèi)部的血管生成，可見CD31對血管的形成必不可少。CD31主要分布于細胞連接深處，但其分子定位處于動態(tài)變化之中，其在胞膜上的分布不僅與細胞骨架重排有關，同時受細胞膜微域的影響。CD31是最敏感的內(nèi)皮標記物[43]，常被用于血管定位或鑒定。

3.2.2 von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF) vWF是由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的一種多聚糖蛋白，在止血、血管壁穩(wěn)態(tài)和損傷后修復中扮演著重要角色。當內(nèi)皮損傷或受到刺激時，vWF從內(nèi)皮細胞中釋放，沉積于血管的受損部位，導致局部血小板聚集[44]。vWF主要儲存于胞質(zhì)的Weibel-Palade小體中。自從1972年HOYER等在VECs中發(fā)現(xiàn)vWF后，因其具有高度的敏感度和良好的特異度，常被用作MVECs標志物[45]。

3.2.3 血管內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白(VE-cadherin，CD144) VE-Cadherin是內(nèi)皮細胞黏附連接的主要蛋白，不僅維持著血管結(jié)構(gòu)和功能的完整性，還調(diào)控著內(nèi)皮細胞的發(fā)育與生長。其主要分布在內(nèi)皮之間的黏附連接處[46]。VE-Cadherin僅在內(nèi)皮細胞上表達，因此是內(nèi)皮細胞最特異的標志物之一[47]。

3.2.4 CD34 CD34是一種細胞表面跨膜糖蛋白[48]，在細胞間黏附、調(diào)節(jié)細胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用[37]。CD34起初被視為造血干細胞的標志，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)其可表達于早期VECs，其主要見于外周循環(huán)的血管腔內(nèi)膜和血管出芽端的細胞外膜上[49]，少部分存在于未參與循環(huán)的小血管內(nèi)膜，可作為內(nèi)皮標記物之一[50]。但在體外培養(yǎng)中，因細胞接觸以及外部環(huán)境影響，MVECs可能丟失這一標志物[8]。

3.2.5 內(nèi)皮糖蛋白(CD105) CD105是一種同源二聚體跨膜糖蛋白，對血管生成至關重要，例如CD105基因敲除小鼠，因血管生成缺陷在子宮內(nèi)便死亡[34，51]。CD105在增殖活躍的內(nèi)皮細胞上高度表達，可作為MVEVs的一種標志物[52]。

3.2.6 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(CD143) CD143作為一種胞外糖蛋白，存在于內(nèi)皮細胞的管腔面。與正常內(nèi)皮細胞相比，出芽VECs中CD143表達顯著下調(diào)[53]。因此CD143低表達可作為新血管形成過程中內(nèi)皮細胞的標志物[54-55]。

上述六種分子均為VECs標記物，但在相關文獻中，多采用CD31與vWF進行MVECs鑒定。若在純化方法中，選擇免疫磁珠或流式細胞術進行表面標志物的分選，可忽略鑒定部分直接進行后續(xù)操作。

4 結(jié)束語

不同組織來源的VECs之間存在差異。因此要反映疾病特征，應獲取相應部位的MVECs進行研究。本文通過對原代MVECs的分離、純化與鑒定方法的分析，希望尋找一種能夠快速獲得高質(zhì)量、高純度的原始病理狀態(tài)下MVECs的方法，從而明確不同疾病下的細胞功能，增進對疾病發(fā)生、發(fā)展進程的了解與認識，為疾病的治療和預防提供更加直觀的新思路和新見解。