糖尿病腎臟病患者腎臟纖維化與YAP活化水平的相關性分析

馮 嵐，楊小娟，陳 楊，劉宏寶，李 妮

(1延安大學附屬醫(yī)院腎臟內科，陜西 延安 716000；2空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院腎臟內科，陜西 西安 710038)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率逐年上升，40%的DM患者會發(fā)展成慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)，DM已經成為全球終末期腎病的首要原因[1-2]。目前臨床上判斷CKD進展的可靠指標包括蛋白尿、血清胱抑素C和估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)等[3]。全球改善腎臟病預后組織(Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO)基于eGFR和尿蛋白/肌酐比值(urinary albumin-creatinine ratio，UACR)對CKD進行定義和分期[4]，并得到美國糖尿病協(xié)會的認可，將符合CKD標準的DM命名為糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)。這為DKD的篩查和檢測提供了依據，但是因肌肉質量和種族帶來的估算偏差，其對DKD進展的判斷效果仍有待長期評價[5-6]。

目前DKD的腎臟病理分類仍然沿用國際腎臟病理學會的共識，包括腎小球病變分級(Ⅰ～Ⅳ級)、間質纖維化(interstitial fibrosis，IF)和腎小管萎縮(tubular atrophy，TA)評分(IFTA，0～3分)、間質炎癥評分(0～2分)、小動脈玻璃樣變評分(0～2分)和小動脈硬化評分(0～2分)[7]。一直以來專家們對于DKD的研究主要集中在腎小球損害，但越來越多的證據證實了腎小管間質損害在DKD進展中的重要性。

Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)是經典Hippo信號通路的核心效應分子，可被上游機械信號(如基質硬度增加)激活，促進其核移位并激活靶基因，已成為器官纖維化發(fā)病機制中的一個關鍵因素，包括腎、肝、肺和心臟組織[8-9]。新近的研究證實YAP表達和核移位隨著體外水凝膠硬度的增加而增加，而且DKD大鼠腎臟的YAP表達顯著高于正常大鼠腎臟[10]。但是迄今為止，尚未見到DKD患者腎臟YAP活化與腎臟纖維化相關性的報道。本研究選擇近5年空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院經腎活檢確診的58例DKD患者，進行腎組織YAP染色，評估其與DKD患者臨床生物標記物和病理分類的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象

回顧空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院2017年2月至2022年4月全部行腎活檢的2型DM患者，共有66例患者經腎活檢診斷為DKD。其中1例合并IgA腎病、2例合并高血壓腎損害、1例合并原發(fā)性膜性腎病和1例腎小球數(shù)<10個被排除，剩下的61例患者按KDIGO指南CKD標準進行分期，1例CKD 4期和2例CKD 5期的患者因例數(shù)少而被排除。最終58例患者納入本研究，按KDIGO指南CKD的eGFR分期標準[5]，DKD患者被分為3組：DKD 1期(n=19)、DKD 2期(n=18)和DKD 3期(n=21)。另選擇8例接受腎腫瘤切除術的患者作為對照(對照組)，均無高血壓、DM、心血管疾病或急慢性腎臟疾病病史。該研究根據赫爾辛基宣言進行，經空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院倫理委員會批準(許可證號：K202211-30)，并征得每個受試者的書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料獲取 由唐都醫(yī)院CKD管理中心護士調取DKD患者的臨床和實驗室資料，包括年齡、性別、血壓、DM史、24 h尿蛋白(24 h urine protein，24 hUP)、UACR、eGFR、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)、胱抑素C、血清白蛋白(albumin，ALB)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和糖化血紅蛋白(hemoglobin A1C，HbA1c)等。eGFR通過CKD-EPI方程計算[11]。另由2名主治醫(yī)生對數(shù)據進行核對并最終確認準確性和合理性。

1.2.2 病理資料獲取 根據病歷調取受試病理報告，使用光學顯微鏡和電子顯微鏡對腎標本進行評估。按照國際腎臟病理學會的共識進行腎臟病理分類和評分[7]。包括：①腎小球病變分級(Ⅰ～Ⅳ級)：Ⅰ級，基底膜增厚；Ⅱ級，輕度系膜增生>25%(Ⅱa)和重度系膜增生>25 %(Ⅱb)；Ⅲ級，結節(jié)硬化(至少一個KW結節(jié))；Ⅳ級：全球硬化>50%。②IFTA評分(0～3分)：0分，IF和TA無受累；1分，IF和TA受累面積<25%；2分，IF和TA受累面積為25%～50%；3分，IF和TA受累面積>50%。③間質炎癥評分(0～2分)：0分，無；1分，IFTA區(qū)域存在炎癥；2分，IFTA區(qū)域以外存在炎癥。④小動脈玻璃樣變評分(0～2分)：0分，無；1分，1個；2分，≥2個。⑤小動脈硬化評分(0～2分)：0分，無；1分，內膜增厚但未超過中膜厚度；2分，內膜增厚并超過中膜厚度。

1.2.3 YAP的免疫熒光染色 對58例腎活檢組織石蠟塊和8例切除腎的癌旁正常腎組織進行4 μm厚切片，進行免疫熒光染色。石蠟切片脫蠟至水，用EDTA抗原修復緩沖液修復，然后用30 mL/L胎牛血清密封，并與YAP(#14074，Cell Signaling Technology，MA，美國)抗體在4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次后，切片與FITC標記的二抗(GB22303，Servicebio，中國)孵育。并用DAPI(G1012，Servicebio，中國)進行細胞核染色。使用Leica DM2500顯微鏡(Leica Microsystems，德國)，以盲法為每個切片隨機拍攝20幅圖像(400倍)，通過Image-ProPlus V.6.0(Media Controbernetics，Bethesda，MD，美國)進行量化。

2 結果

2.1 DKD不同臨床分期患者臨床資料的比較

在58例DKD患者中，38例為男性，20例為女性，腎活檢時年齡為(52.9±11.8)歲。除了HbA1c和FBG之外(P<0.01)，DKD 1期的各項指標與對照組相比無統(tǒng)計學差異。結果顯示，DKD 1期患者比DKD 2期(P<0.01)和DKD 3期(P<0.01)患者更年輕且DM病程更短。與DKD 1期相比，DKD 2期患者的Scr(P<0.01)、24 h UP(P<0.05)和UACR(P<0.05)升高，ALB(P<0.05)和eGFR(P<0.01)降低，但是FBG和HbA1c在二者之間未見顯著性差異。DKD 3期患者比DKD 2期患者的Scr(P<0.01)和胱抑素C(P<0.01)升高，eGFR降低(P<0.01)，但是其他指標在兩組之間未見統(tǒng)計學差異。與DKD 1期相比，DKD 3期患者的Scr(P<0.01)、BUN(P<0.01)、胱抑素C(P<0.01)和24h UP(P<0.05)水平更高，ALB(P<0.01)和eGFR(P<0.01)水平更低，其他指標在兩組之間未見顯著性差異(表1)。

表1 對照組和DKD患者臨床資料比較

2.2 DKD不同臨床分期患者病理分類的比較

DKD患者的病理分類數(shù)據顯示，關于腎小球損傷，DKD 2期和DKD 3期患者的全球硬化比率高于DKD 1期患者(P<0.05)，但是腎小球病變分級在3組之間未見顯著性差異。DKD患者均出現(xiàn)明顯的腎小管間質損傷，分別有36.8%的DKD 1期、55.6%的DKD 2期和71.4%的DKD 3期患者的IFTA評分為3分，DKD 3期患者的IFTA評分顯著高于DKD 1期的患者(P<0.05)。IFTA評分中，TA受累范圍在DKD 1期和DKD 2期患者之間無統(tǒng)計學差異，但均低于DKD 3期患者；IF受累范圍在DKD 2期和DKD 3期之間無統(tǒng)計學差異，但均高于DKD 1期患者(P<0.05，P<0.01)。此外，DKD 3期患者的炎癥評分(P<0.05)和小動脈玻璃樣變評分(P<0.01)均顯著高于DKD 1期，DKD 2期患者的小動脈硬化評分顯著高于DKD 1期患者(P<0.05，表2)。

表2 DKD患者腎臟病理資料的比較

2.3 DKD患者腎組織中YAP的活化

DKD 1期和對照組患者之間腎臟YAP的表達無統(tǒng)計學差異。與DKD 1期患者相比，DKD 2期患者腎小管上皮細胞中YAP表達增加(P<0.01)，且主要分布于細胞質。但是與DKD 2期患者相比，DKD 3期患者腎臟中出現(xiàn)更高的YAP表達和核移位(P<0.01)。重要的是，腎臟YAP表達呈現(xiàn)DKD分期依賴性的點對點增加(圖1)。

A：YAP在對照組和DKD患者腎石蠟切片中的表達，用共聚焦掃描顯微鏡拍攝；B：用ImageJ對YAP的相對熒光強度進行定量并分析。YAP：Yes相關蛋白；DKD：糖尿病腎臟病。標尺為200 μm。 bP<0.01。圖1 對照組和DKD患者腎小管上皮細胞中的YAP表達

2.4 DKD患者腎組織YAP水平與臨床資料的相關性

DKD患者腎組織YAP水平與臨床資料的相關性分析結果顯示(表3)，YAP水平與eGFR呈高度負相關(r=-0.854，P<0.01)，與Scr(r=0.849，P<0.01)、胱抑素C(r=0.717，P<0.01)呈高度正相關。類似地，eGFR與Scr(r=-0.884，P<0.01)、胱抑素C(r=-0.753，P<0.01)呈高度負相關。

表3 DKD患者eGFR水平和腎組織YAP水平與各臨床指標的相關性

2.5 DKD患者腎組織YAP水平與病理分類的相關性

DKD患者腎組織YAP水平與病理分類的相關性分析結果顯示(表4)，腎組織YAP表達與IF受累范圍(r=0.613vsr=-0.482)、TA受累范圍(r=0.633vsr=-0.542)和IFTA評分(r=0.522vsr=-0.377)的相關性顯著優(yōu)于eGFR水平。腎小球病理分級、全球硬化比率、炎癥評分、小動脈玻璃樣變評分和小動脈硬化評分與YAP和eGFR的相關系數(shù)∣r∣均<0.4。因此我們認為與DKD患者eGFR顯著相關的是腎小管間質損傷而不是腎小球病變，腎臟中YAP水平與eGFR下降具有明顯相關性，在腎小管間質纖維化評估方面優(yōu)于eGFR水平。

表4 DKD患者eGFR水平和腎組織YAP水平與臨床指標和病理分類的相關性

3 討論

越來越多的證據表明腎臟間質纖維化在DKD發(fā)生發(fā)展中的作用[1]。在不同臟器損傷的纖維化中顯示了Hippo-YAP信號通路的作用[12-16]，但是臨床上尚未見到腎臟YAP水平在DKD患者進展風險方面的報道。我們團隊新近在DKD大鼠模型中證實了腎臟YAP的活化與腎臟纖維化密切相關[10]。本研究進一步在DKD患者腎組織中評價了腎臟YAP水平與DKD進展風險和腎臟纖維化程度的相關性，主要包括以下亮點：①隨著KDIGO指南CKD分期進展，DKD患者腎臟YAP水平呈CKD臨床分期依賴性地點對點增加；②YAP水平與TA/腎臟纖維化病理分級的相關性顯著優(yōu)于eGFR。

YAP是經典Hippo信號通路的下游效應器，在急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)和CKD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[12，17]。研究顯示YAP的功能依賴于其活化的時間[16]。在AKI中，YAP的激活促進細胞增殖和抗凋亡作用，但是YAP長期過度活化導致細胞去分化，從而促進纖維化進展[18]。在應對長期病理刺激(如高血糖癥)時，Hippo途徑的失活導致轉錄調節(jié)因子YAP去磷酸化，從而驅動YAP的核轉運，在細胞核內與轉錄增強相關結構域家族轉錄因子(TEAD 1-4)結合，調節(jié)下游靶基因的轉錄，最終導致腎臟適應性不良修復和纖維化[8]。YAP的藥理學和遺傳學抑制可以逆轉成纖維細胞活化和上皮間充質轉化，從而延緩腎小管IF[19-22]。本研究證實了DKD患者腎臟YAP表達和核移位隨著CKD分期加重而增加，且與eGFR水平呈顯著負相關，與Scr和胱抑素C呈正相關，提示YAP在DKD進展風險中的作用。

目前臨床上DKD患者行腎活檢僅限于非典型表現(xiàn)者，因此一般選擇功能學改變(eGFR和UACR)來判斷患者進展風險。行腎活檢DKD患者，其病理分類仍然沿用國際腎臟病理學會的共識，包括腎小球病變分級、IFTA評分、間質炎癥評分、小動脈玻璃樣變評分和小動脈硬化評分。相對嚴重的腎小球疾病腎活檢標本中，腎小球硬化(glomerulosclerosis，GS)和IFTA與eGFR相關[23-25]。新近研究顯示當eGFR>60(mL·min-1·1.73 m-2)時，eGFR與GS和IFTA的相關性較弱[26]，而在eGFR>30 (mL·min-1·1.73 m-2)的DKD人群中本研究得到了相似結論。本研究中，即使處于CKD 1期和CKD 2期，也有36.8%～55.6%的DKD患者的IFTA評分為3分，提示了腎小管間質損害在DKD中的重要性。并且無論是eGFR，還是腎組織YAP水平，均顯示與腎小球病變(腎小球病變分級和全球硬化比率)較弱的相關性。此外在腎小管損傷方面，YAP水平與腎小管間質損傷，包括IF受累范圍(r=0.613vsr=-0.482)、TA受累范圍(r=0.633vsr=-0.542)和IFTA評分(r=0.522vsr=-0.377)的相關性明顯優(yōu)于eGFR，這進一步提示腎組織YAP水平在預測腎纖維化中的作用。

本研究尚存在一定局限性，本研究為單中心設計，樣本量有限。最重要的是，所選病例均是存在不典型癥狀的腎活檢DKD患者，他們大多數(shù)存在尿蛋白快速增加或腎病綜合征表現(xiàn)，因此我們不能確定未經腎活檢的DKD患者YAP水平與eGFR等臨床分級和IFTA等病理分級的相關性是否與本研究的結論一致，因此開發(fā)Hippo-YAP信號通路相關的血/尿生物學標志物在臨床上更適用于未經腎活檢的DKD患者的評估。此外，因為所選病例為近5年的DKD患者，尚缺乏YAP對DKD患者長期預后預測價值的數(shù)據。因此，對患者長期隨訪，并觀察YAP水平與每年eGFR下降率、終末期腎臟病的發(fā)生和是否死亡等指標的相關性，有益于進一步判斷其在DKD患者預后中的預測價值。

總之，本研究在經腎活檢的DKD患者中證實，YAP水平顯著關聯(lián)eGFR，其與腎小管間質損害的關聯(lián)性優(yōu)于eGFR，提示DKD患者腎小管結構性損傷早于eGFR預測，YAP的組織學分析可能是DKD腎臟纖維化評估的一種補充方法，有待進一步研究。