蘆薈提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用

張雙 高鷹 李黎仙 杜俊蓉

蘆薈提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用

張雙 高鷹 李黎仙 杜俊蓉

目的探討蘆薈(AVE)提取物對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)炎性反應(yīng)的作用。方法將hPDLCs分為對(duì)照組，模型組(1 μg/ml LPS)和AVE組，濃度為0.05，0.1， 0.2 mg/ml的AVE分別處理AVE組的hPDLCs； MTT法測(cè)定各組細(xì)胞存活率； ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6含量；用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)TLR4的表達(dá)情況；免疫熒光染色檢測(cè)NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)情況。結(jié)果各組細(xì)胞存活率差異沒有顯著性，模型組上清液中的IL-6含量顯著升高， TLR4表達(dá)及 NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)均明顯上調(diào)；與模型組相比，蘆薈提取物呈劑量依賴性抑制細(xì)胞上清液中IL-6的分泌，下調(diào)TLR4表達(dá)及NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)移。結(jié)論蘆薈提取物能有效抑制人牙周膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與TLR4/NF-κB-p65信號(hào)通路有關(guān)。

蘆薈提取物(AVE)； 人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)； 脂多糖(LPS)

牙周炎是細(xì)菌引起的慢性炎癥，往往引發(fā)牙周支持組織的炎性破壞。人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)免疫應(yīng)答是牙周組織結(jié)構(gòu)完整或者破壞的重要決定因素[1]。牙周炎主要是由革蘭氏陰性菌引起的[2-3]，而脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。Toll 樣受體(Toll like receptors, TLRs)是一類天然免疫受體，TLR4是其主要成員之一，研究表明hPDLCs被 LPS 刺激后，經(jīng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)從而調(diào)節(jié)各種炎癥因子的表達(dá)[4]，參與牙周組織破壞。因此如何調(diào)控hPDLCs炎癥反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)牙周炎的防治具有重要意義。

蘆薈為百合科蘆薈屬多年生肉質(zhì)草本植物，集食用、藥用、美容、觀賞于一身。文獻(xiàn)報(bào)道，該植物具有抗炎、促進(jìn)傷口愈合、增強(qiáng)免疫功能、降血糖等多種藥理活性[5-6]。目前，蘆薈提取物對(duì)牙周炎的防治作用鮮有報(bào)道，本研究從細(xì)胞水平探討蘆薈提取物對(duì)LPS誘 導(dǎo)下的hPDLCs炎癥的抑制作用并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與藥物來源

1.2 主要儀器與試劑

LPS(E.coliO55:B5，Sigma，美國(guó))；IL-6 Elisa試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；胎牛血清(民海生物)；DMSO，MTT(Amresco，美國(guó))；兔抗TLR4單克隆抗體、羊抗兔FITC、抗熒光衰減封片劑、4, 6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色劑、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔NF-κB p65單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；倒置式生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(Bio-RAD Model 550,美國(guó))；顯微鏡及照片獲取系統(tǒng)(Olympus，日本)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的hPDLCs復(fù)蘇，用含10%胎牛血清和1%青霉素、1%鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)， 1∶3比例進(jìn)行傳代，選取4～6 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為5組，包括對(duì)照組，模型組(1 μg/ml LPS)，蘆薈提取物低劑量組(0.05 mg/ml)，中劑量組(0.1 mg/ml)，高劑量組(0.2 mg/ml)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

從DDoS攻擊的發(fā)展歷程，我們不難看出，在如今這個(gè)虛擬網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)嵌入我們現(xiàn)實(shí)生活的社會(huì)里，DDoS攻擊無疑是一個(gè)巨大的安全隱患。伴隨著DDoS工具的廉價(jià)性、易獲取性，以及各僵尸網(wǎng)絡(luò)家族的快速增長(zhǎng)，利用物聯(lián)網(wǎng)設(shè)備組建僵尸網(wǎng)絡(luò)發(fā)起攻擊的現(xiàn)象日益嚴(yán)峻，與此同時(shí)，移動(dòng)端的僵尸網(wǎng)絡(luò)亦處于萌芽階段，網(wǎng)絡(luò)安全之路可謂任重道遠(yuǎn)。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hPDLCs(1×105/ml) 接種于96 孔板，于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按各組濃度進(jìn)行造模或給藥，每組3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，常溫下?lián)u床搖10 min，在酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度值，取3 孔平均值，計(jì)算細(xì)胞存活率(實(shí)驗(yàn)組A490/空白組A490×100%)。重復(fù)3 次。

1.6 ELISA法檢測(cè)IL-6的含量

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hPDLCs(1×105/ml) 接種于96 孔板，于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照各組濃度預(yù)防給藥1 h， 1 μg/ml LPS造模作用24 h， 每組9 個(gè)復(fù)孔，收集培養(yǎng)上清，根據(jù)Elisa試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞上清液中IL-6含量。

1.7 免疫染色法測(cè)定TLR4的表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hPDLCs(3×104/ml) 接種24 孔板爬片，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取對(duì)照組、模型組、高劑量組，預(yù)防給藥1 h，每組3 個(gè)復(fù)孔，1 μg/ml LPS造模作用24 h后，SABC免疫細(xì)胞染色法進(jìn)行DAB染色，蘇木素染核，脫水透明后，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察TLR4表達(dá)情況。

1.8 免疫熒光染色法檢測(cè)NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)狀況

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hPDLCs(3×104/ml)接種24 孔板爬片，于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取高劑量組預(yù)防給藥1 h。 1 μg/ml LPS造模1 h后， PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min， PBS洗3 次，1 min/次，0.3% Triton X-100打孔30 min，PBS漂洗3 次， 1 min/次，3% H2O230 min氧化內(nèi)源性過氧化物酶， PBS洗3 次，1 min/次，5% 牛血清 37 ℃封閉1 h，一抗(1∶50)4 ℃過夜，PBS洗3 次，熒光二抗37 ℃避光孵育1 h， DAPI染核1 min，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察NF-κB-p65的表達(dá)情況。每組3 個(gè)復(fù)孔。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 蘆薈提取物對(duì)hPDLCs細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組比較，模型組、蘆薈提取物低、中、高劑量組中細(xì)胞活力無顯著差異(P>0.05, 表 1)。

注： 與對(duì)照組比較, ①P>0.05

2.2 蘆薈提取物對(duì)細(xì)胞上清液中IL-6 含量的影響

與正常組比較，模型組中IL-6含量顯著提高(P<0.05)。與模型組比較，蘆薈提取物低、中、高劑量組hPDLCs細(xì)胞上清中IL-6 含量均顯著下降(P<0.05)，并且呈劑量依賴性(表 2)。

注： 與模型組比較, ①P<0.01， ②P<0.05

2.3 蘆薈提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的hPDLCs中TLR4蛋白的影響

與對(duì)照組相比，模型組的TLR4陽(yáng)性表達(dá)明顯上調(diào)。與模型組相比，蘆薈提取物高劑量組TLR4陽(yáng)性表達(dá)顏色明顯變淺，表達(dá)下調(diào)(圖 1)。

2.4 蘆薈提取物對(duì)NF-κB-p65的作用

對(duì)照組NF-κB-p65基本分布在胞漿中，模型組NF-κB-p65核轉(zhuǎn)明顯增多，蘆薈提取物高劑量組NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)明顯減少(圖 2)。

3 討 論

牙周炎是常見的口腔感染性疾病，已成為突出的口腔保健問題。 據(jù)報(bào)道， 蘆薈具有抗炎作用[5]， 本研究就蘆薈提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)hPDLCs炎癥的抑制效果進(jìn)行了探討。研究結(jié)果表明，蘆薈提取物能夠抑制LPS誘導(dǎo)hPDLCs分泌IL-6，其抗炎機(jī)制可能與抑制TLR-4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，提示蘆薈提取物可能是牙周疾病預(yù)防與治療的有效藥物。

A: 對(duì)照組； B: 模型組； C: 高劑量組

圖 1 蘆薈提取物對(duì)牙周膜細(xì)胞TLR4表達(dá)的影響 (×200)

A: Control group; B: Model group; C: AVE of 0.2 mg/ml

Fig 1 The effects of AVE on TLR4 expression in LPS-induced hPDLCs (×200)

圖 2 蘆薈提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞NF-κB-p65核內(nèi)轉(zhuǎn)的作用 (×400)

Fig 2 The effects of AVE on the transfer of NF-κB-p65 into the nucleus in LPS-induced hPDLCs (×400)

hPDLCs在牙周炎的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[1]。牙周炎的主要致炎因子LPS能促進(jìn)如IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，參與牙周組織的破壞。因此，抑制炎癥因子的產(chǎn)生有益于減緩牙周疾病的發(fā)展進(jìn)程[7]。IL-6具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在牙周疾病中參與局部炎癥反應(yīng)及牙周組織的破壞。研究表明，IL-6不僅在牙周組織中能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成[8]，還與牙周袋的深度密切相關(guān)[9]。牙周炎患者齦溝液中IL-6的含量顯著高于健康人齦溝液中IL-6的含量，表明IL-6在某種程度上是牙周炎的嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志[10]。本研究中，蘆薈提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)hPDLCs分泌IL-6有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性。這些結(jié)果提示，蘆薈提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的hPDLCs的炎癥反應(yīng)有較好的抗炎效果。

TLR4是LPS的主要受體，二者結(jié)合后，通過相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB，從而誘發(fā)一系列炎癥因子如IL-1β、IL-6等的產(chǎn)生[3]。正常狀態(tài)下，NF-κB-p65在胞漿中與 NF-κB 抑制蛋白(Inhibitor of NF-κB，IκB)相結(jié)合[11]，處于非活化狀態(tài)。在LPS刺激下，TLR4與髓樣分化因子88結(jié)合，活化后的髓樣分化因子88使得IL-1受體相關(guān)激酶發(fā)生一系列磷酸化反應(yīng)[12]，IκB 磷酸化后，與NF-κB-p65形成的蛋白復(fù)合體解離，游離的 NF-κB-p65 進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)位點(diǎn)的DNA鏈結(jié)合，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能[13-14]，調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)，引起一系列炎癥因子產(chǎn)生，促進(jìn)牙周病的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)探究了蘆薈提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)下hPDLCs中TLR4及NF-κB-p65的影響，結(jié)果顯示庫(kù)拉索蘆薈凝膠凍干粉能夠抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4蛋白的表達(dá)以及NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)，進(jìn)而抑制下游靶基因IL-6的生成。

綜上所述，本研究選用的蘆薈提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的hPDLCs炎癥反應(yīng)有一定抑制效應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)。但值得注意的是，在本課題組同步進(jìn)行的LPS誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)研究中，蘆薈提取物并沒有抗炎活性(組內(nèi)結(jié)果)。為何庫(kù)拉索蘆薈凝膠凍干粉對(duì)hPDLCs和人牙齦成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響有明顯差異，值得進(jìn)一步深入研究以闡明其藥理學(xué)機(jī)制，為蘆薈提取物在口腔保健產(chǎn)品中的合理應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Theinhibitoryeffectsofaloeveraextractonlipopolysaccharide-inducedinflammatoryresponseinhumanperiodontalligamentcells

ZHANGShuang1,GAOYing2,LILixian2,DUJunrong1.

1. 610041Chengdu,DepartmentofPharmacology，WestChinaCollegeofPharmacy,SichuanUniversity,China; 2.YunnanBaiyaoGroupCo.,Ltd,Kunming

Objective: To explore the effects of aloe vera extra(AVE) on lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammatory response of human periodontal ligament cells(hPDLCs).MethodshPDLCs were induced with LPS at 1 μg/ml for the simulation of periodontitis model(model group) and then treated by AVE at 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml respectively(AVE group). Cell viability was examined by MTT assay. The level of interleukin-6(IL-6) from cell culture medium was measured by ELISA. The expression of Toll like receptor 4(TLR4) protein was detected by immunocytochemistry staining and the transfer of nuclear factor-kappa B p65(NF-κB-p65) was observed by immunofluorescence staining.ResultsThere was no significant difference of the cell viabilities among the groups. IL-6 in culture medium, the expression of TLR4 protein and the transfer of NF-κB-p65 into the nucleus were increased in model group. AVE at 0.05-0.2 mg/ml inhibited the secretion of IL-6 in the cell culture supernatant down-regulated the TLR4 expression, attenuated the transfer of NF-κB-p65 into the nucleus in a concentration-dependent manner.ConclusionAloe vera extract can inhibit the inflammation response of hPDLCs induced by LPS through TLR4/ NF-κB-p65 signaling pathway.

Aloeveraextract(AVE);Humanperiodontalligamentcells(hPDLCs);Lipopolysaccharide(LPS)

610041, 四川大學(xué)華西藥學(xué)院藥理學(xué)系(張雙 杜俊蓉)； 云南白藥集團(tuán)股份有限公司(高鷹 李黎仙 )

杜俊蓉 E-mail： dujr_1@163.com

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.020

(收稿： 2016-10-18 修回： 2016-12-19)