rhIL-1Ra抑制大鼠顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞的研究

滿城 蔣練 徐凡

rhIL-1Ra抑制大鼠顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞的研究

滿城 蔣練 徐凡

目的探討關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射重組人IL-1Ra對實驗性大鼠顳下頜關(guān)節(jié)炎軟骨關(guān)節(jié)修復(fù)的影響。方法取SD大鼠24 只，用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射II型膠原酶法建立雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，1 周后，右側(cè)(實驗側(cè))關(guān)節(jié)腔內(nèi)一次性注射重組人IL-1Ra 5 μg(稀釋于0.05 ml生理鹽水)，左側(cè)(對照側(cè))注射等量生理鹽水。建模后2 周、4 周各處死12 只動物，取顳下頜關(guān)節(jié)標本進行HE染色、免疫組化染色及RT-PCR檢測,用Mankin評分方法評估TMJ組織病理變化程度。另取1 只SD大鼠用作空白對照，2 周后處死。結(jié)果2 周時雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨均呈現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)病損，實驗側(cè)和對照側(cè)Mankin計分分別為1.33±0.52和2.00±6.63(P>0.05)。4 周時，實驗側(cè)改良和對照側(cè)Mankin評分分別為3.00±0.63和6.50±0.84(P<0.05)，ADAMTS-4、5的蛋白及mRNA表達也低于對照側(cè)(P<0.05)。結(jié)論顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射重組人IL-1Ra能緩解骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的軟骨病損，其治療機制可能是通過抑制ADAMTS-4、5的表達來實現(xiàn)的。

顳下頜關(guān)節(jié)(TMJ)； 骨關(guān)節(jié)炎(OA)； IL-1Ra； ADAMTS-4； ADAMTS-5

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是最常見的骨關(guān)節(jié)病，主要表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)的退行性改變。OA的病因尚未完全闡明，一般認為是力學(xué)及生物學(xué)因素共同作用導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的破壞，軟骨細胞、細胞外基質(zhì)及軟骨下骨的合成與降解失衡所致[1]，其中細胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)的降解被認為是OA早期最主要的病理改變[2]。Ⅱ型膠原和蛋白聚糖是構(gòu)成ECM的主要成分，Ⅱ型膠原提供骨架結(jié)構(gòu)，蛋白聚糖提供抗壓性。體外研究證實[3]，蛋白聚糖降解先于Ⅱ型膠原發(fā)生。因此，保護蛋白聚糖不被降解對保護關(guān)節(jié)軟骨的完整性具有重要意義。本實驗通過II型膠原酶注射法建立大鼠顳下頜關(guān)節(jié)OA模型，觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射重組人IL-1Ra對OA的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取25 只2 月齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供)，體重200～220 g，無明顯口頜系統(tǒng)疾病，飼養(yǎng)1 周讓動物熟悉環(huán)境。

1.2 實驗試劑

大鼠注射用II型膠原酶，重組人IL-1Ra購于上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;ADAMTS-4、ADAMTS-5多克隆抗體購于英國Abcam公司;ADAMTS-4、5及內(nèi)參β-actin引物由上海生工合成(表 1)。

表 1 PCR引物

注： F： Forward primer； R： Reverse primer

1.3 實驗方法

1.3.1 麻醉 0.3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)腹腔注射。

1.3.2 注射 麻醉效果滿意后，剪除雙側(cè)關(guān)節(jié)區(qū)毛發(fā)，碘伏消毒，觸摸顴弓后下方，采用1 ml胰島素注射器(30 G針頭)，循顴弓后方進針，直抵骨面，稍后退，推注生理鹽水，如能回抽出生理鹽水，即證明針尖位于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，反之，則需調(diào)整進針方向或深度。

1.3.3 處理 麻醉下雙側(cè)關(guān)節(jié)腔一次性注射2% II型膠原酶0.05 ml建模，1 周后右側(cè)(實驗側(cè))關(guān)節(jié)腔內(nèi)一次性注射重組人IL-1 Ra 5 μg(稀釋于0.05 ml生理鹽水)，左側(cè)(對照側(cè))注射等量生理鹽水。建模后2、4 周各處死12 只動物，其中隨機選取6 只用于HE及免疫組化染色，6 只用于RT-PCR檢測?？瞻讓φ战M不作任何處理。

1.4 檢測方法

1.4.1 標本處理 取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)組織，10%中性甲醛溶液固定，脫鈣液脫鈣，37 ℃水浴。約2 周后常規(guī)脫水石蠟包埋切片。

1.4.2 HE染色 每個標本選取5 個部位參照改良Mankin法(表 2)對OA的病損程度進行組織學(xué)評分。

1.4.3 免疫組化染色 常規(guī)切片脫蠟，抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性酶。孵育一抗：1∶200稀釋一抗，4 ℃冰箱過夜。PBS洗3 次，每次5 min。孵育二抗：37 ℃孵育30 min，PBS洗3 次，每次5 min。DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染8 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片鏡檢。圖像分析：每張切片選取5 個視野，OLYMPUS BX43顯微鏡下放大200 倍，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定陽性染色平均累積吸光度(A值)，用改良Mankin評分法計分(表 2)。

表 2 顳下頜關(guān)節(jié)Mankin評分

1.4.4 RT-PCR 完整剝離髁突軟骨組織，取10 mg于液氮中研磨，放入-80 ℃冰箱中保存。應(yīng)用Trizol(Invitrogen公司，美國)試劑盒，按操作手冊要求提取總RNA并溶解于DEPC水中，紫外線分光度計檢測樣品吸光度。每組取2 μl總RNA采用“兩步法”逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA按1∶5稀釋后，取1 μl cDNA進行PCR擴增。擴增完畢后取5 μl產(chǎn)物與2 μl上樣buffer混合在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用Image-Pro Plus軟件對圖片進行吸光度分析，以β-actin作為內(nèi)參，目的條帶的吸光度值除以對應(yīng)內(nèi)參的吸光度值計算出目的基因的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

2.1.1 空白對照側(cè) 無明顯病理學(xué)改變，髁突軟骨表面光滑且連續(xù)，由表及里可分為纖維層、增殖層、肥大層和鈣化軟骨層，4 層結(jié)構(gòu)排列緊密，層次清楚，細胞排列整齊(圖 1)。

圖 1 2 月齡SD大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)特點

圖 2 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射IL-1Ra 4 周后顳下頜關(guān)節(jié)組織學(xué)改變 (HE,×100)

Fig 2 Histological feature of TMJ 4 weeks after injection of IL-1Ra into the TMJ cavity (HE,×100)

2.1.2 實驗側(cè)與對照側(cè) 2 周時，對照側(cè)關(guān)節(jié)盤及髁突表面膠原纖維輕微裂解，髁突表面凹凸不平。髁突軟骨細胞數(shù)量減少，細胞層次不清。實驗側(cè)關(guān)節(jié)盤及髁突表面膠原纖維裂解稍減輕，髁突表面較光滑。髁突軟骨細胞數(shù)量增多，細胞層次較為清晰。對照側(cè)和實驗側(cè)改良Mankin法評分為2.00±0.63和1.33±0.52(P>0.05)。

4 周時，對照側(cè)關(guān)節(jié)盤及髁突表面膠原纖維出現(xiàn)崩解現(xiàn)象，關(guān)節(jié)軟骨萎縮。髁突軟骨細胞數(shù)量明顯減少，近骨組織處關(guān)節(jié)軟骨崩解。實驗側(cè)關(guān)節(jié)盤及髁突表面膠原纖維未見崩解現(xiàn)象。髁突軟骨細胞明顯增殖，細胞數(shù)量增多，近骨組織處軟骨缺乏崩解。對照側(cè)和實驗側(cè)改良Mankin法評分為6.50±0.84和3.00±0.63(P<0.05)(圖 2)。

2.2 免疫組化染色

2 周時實驗側(cè)ADAMTS-4、5蛋白陽性表達細胞與對照側(cè)無明顯差異(P>0.05)，4周時實驗側(cè)ADAMTS-4、5蛋白陽性表達細胞均低于對照側(cè)(P<0.05)，4 周時實驗側(cè)ADAMTS-4、5蛋白陽性表達細胞均較2 周實驗側(cè)無明顯差異(P>0.05)(圖 3)。

2.3 RT-PCR

2 周和4 周時實驗側(cè)ADAMTS-4、5 mRNA表達均低于對照側(cè)(P<0.05)，4 周時實驗側(cè)ADAMTS-4、5 mRNA表達均高于2 周實驗側(cè)(P<0.05)(圖 4)。

3 討 論

蛋白聚糖酶屬于ADAMTS 家族，其中ADAMTS-1、4、5、8、9及15具有降解蛋白聚糖的作用，因此也被稱為蛋白聚糖酶，ADAMTS-4、5是最重要的蛋白聚糖酶[4]，在蛋白聚糖的降解過程中起決定性作用。截止現(xiàn)在，在體外細胞培養(yǎng)及動物實驗方面，對ADAMTS-4、5的研究已經(jīng)取得了很大進展，在對小鼠的研究中，分別通過敲除ADAMTS-4、5基因，來觀察手術(shù)誘導(dǎo)OA模型下小鼠OA的發(fā)展變化，得出結(jié)論ADAMTS-5在小鼠OA的病變起主要作用，而ADAMTS-4幾乎不起作用[5-6]；同時敲除ADAMTS-4、5基因后，仍然是手術(shù)誘導(dǎo)OA模型，發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠的OA相比正常組明顯改善；這2組實驗證明了針對ADAMTS-5的治療對小鼠OA的治療是有效的[7]，然而針對小鼠的研究并不能說明ADAMTS-4、5在人關(guān)節(jié)軟骨中也起到相同的作用，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過TNF-α和OSM聯(lián)合誘導(dǎo)正常人關(guān)節(jié)軟骨細胞，利用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)來抑制ADAMTS-4、5的表達，發(fā)現(xiàn)無論是抑制ADAMTS-4或ADAMTS-5，蛋白聚糖的降解會被明顯抑制。提示ADAMTS-4、5在人和小鼠中的作用不同，它們均在人OA的發(fā)展中起作用[4]。

圖 3 顳下頜關(guān)節(jié)軟骨組織中ADAMTS-4、5蛋白表達 (DAB,×200)

Fig 3 Protein expression of ADAMTS-4 and ADAMTS-5 in the cartilage of TMJs (DAB,×200)

圖 4 顳下頜關(guān)節(jié)軟骨組織中ADAMTS-4、5 mRNA表達

IL-1被認為是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的中心環(huán)節(jié)[8]。可以誘導(dǎo)蛋白聚糖酶的表達，但其誘導(dǎo)機制并沒有完全闡明，在對牛鼻軟骨細胞的體外培養(yǎng)中，Pratta等[9]利用IL-1進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)ADAMTS-4的活性顯著升高。Sheu等[10]對小鼠關(guān)節(jié)軟骨的體外培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IL-1β干預(yù)后ADAMTS-5的表達增高。但HU等[11]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IL-1β干預(yù)的人軟骨細胞體外培養(yǎng)時ADAMTS-4、5均升高，而且這種升高被認為是有個體差異的[12]。雖然這些實驗結(jié)果不同甚至是相互矛盾，但均提示抑制IL-1的表達，可以起到保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。

IL-1Ra是IL-1特異性拮抗因子，在關(guān)節(jié)內(nèi)的主要作用是對抗IL-1的生物效力[13]。在OA患者的軟骨細胞和滑膜細胞中，均可見IL-Ra蛋白顯著增高，但是相比IL-1的增高幅度，IL-1Ra/IL-1比值明顯減小[14]。本研究證明在藥物誘導(dǎo)大鼠TMJOA 4周內(nèi)，通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射重組人IL-1Ra的方式能降低OA的病損程度。

本實驗結(jié)果顯示，2 周時實驗側(cè)ADAMTS-4、5蛋白陽性表達細胞與對照側(cè)無明顯差異，4 周時實驗側(cè)ADAMTS-4、5蛋白陽性表達細胞均低于對照側(cè)，這與組織學(xué)大體標本觀察結(jié)果相符，然而卻與ADAMTS-4、5核酸水平表達不一致，2 周和4 周時ADAMTS-4、5 mRNA表達均低于對照側(cè)，這可能是由于蛋白表達滯后于基因表達所致。4 周時實驗側(cè)ADAMTS-4、5蛋白陽性表達細胞均較2周實驗側(cè)無明顯差異，這與ADAMTS-4、5核酸水平表達也不相同，4 周時實驗側(cè)ADAMTS-4、5 mRNA表達均高于2 周實驗側(cè)。這種不同可能是免疫組化主要用于蛋白定位，無法精確定量所致。本實驗表明顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射IL-1Ra可以緩解早期OA的軟骨病損，其作用機制可能是通過抑制ADAMTS-4、5的表達實現(xiàn)的。

本實驗初步探討了抑制ADAMTS-4、5后TMJOA的病理變化，為以后靶向藥物的研發(fā)提供一定的參考。

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Theeffectsofrecombinanthumaninterleukin-1receptorantagonistonthecartilagerepairinrattemporomandibularjointwithosteoarthritis

MANCheng,JIANGLian,XUFan.

563000,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,StomatologicalHospital,ZunyiMedicalCollege,China

Objective: To investigate the effects of recombinant human interluekin-1 receptor antogonist(rhIL-1Ra) on the cartilage repair in rat temporomandibular joint(TMJ) with osteoarthritis(OA).MethodsCollagenase-II was injected into bilateral TMJs of 24 adult rats for the induction of bilateral TMJOA, 1 week after injection, 5μg rhIL-1Ra(diluted in 0.05 ml normal saline) was injected into each right TMJ and the left joint

the same amount of normal saline injection as the control. 12 animals were sacrificed at 2 and 4 weeks after the first injection respectively. HE staining, immunnohistochemical method and RT-PCR examination were conducted. Mankins scere was used to evaluate the TMJOA degree. 1 adult SD rat was used as healthy control, and sacrificed at 2 weeks of the experiment.ResultsThe TMJs of both sides showed typical OA-related cartilage degradation 2 week after IL-1Ra treatment, the Mankin's score of the IL-1Ra treated and control joints was 1.33±0.52 and 2.00±6.63(P>0.05), 4 week after treatment that was 3.00±0.63 and 6.50±0.84(P<0.05), respectively. Lower expression of ADAMTS-4 and ADAMTS-5 was observed in the treated joints than in the controls(P<0.05).ConclusionIntra-articular injection of IL-1Ra into TMJ can alleviate the cartilage lesion, the mechanism may lie in the inhibition of the expression of ADAMTS-4 and ADAMTS-5.

Temporomandibularjoint(TMJ)；Osteoarthritis(OA)；IL-1Ra；ADAMTS-4；ADAMTS-5

貴州省科技廳聯(lián)合基金(編號： 黔科合J字LKZ[2013]09號)； 遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動基金(編號： F-458)

563000， 遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院[滿城 蔣練 徐凡(現(xiàn)在孝感市中心醫(yī)院)]

徐凡 0851-28608120 E-mail： 13797189527@163.com

R782.6

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.003

(收稿： 2016-11-18 修回： 2017-02-14)