柞蠶滯育的研究進(jìn)展

陳 欣 陳俊山 劉書禹 劉鳳全 徐 亮 諶苗苗 趙 賀 劉佩鋒

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所,遼寧鳳城 118100)

柞蠶(Antheraeapernyi)是一種具有重要綜合價(jià)值的泌絲昆蟲,在分類學(xué)上屬于昆蟲綱、鱗翅目、大蠶蛾科、柞蠶屬。柞蠶業(yè)起源于中國,距今已有2000多年的發(fā)展歷史,是我國山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)。當(dāng)前全國柞蠶繭總產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的 90%以上,柞蠶資源的綜合利用價(jià)值得以不斷開發(fā),使得這項(xiàng)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)具有更加廣闊的發(fā)展前景[1]。

滯育是昆蟲渡過不利時(shí)期的一種重要的生理過程,是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)和激素調(diào)控的適應(yīng)性發(fā)育抑制事件,通常在不利環(huán)境到來之前開始發(fā)生,且不會(huì)隨不利環(huán)境的消失而立即結(jié)束,在昆蟲的生存、進(jìn)化和繁殖等方面發(fā)揮著重要的作用[2]。柞蠶是完全變態(tài)昆蟲,在一生中要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個(gè)形態(tài)和生理機(jī)能完全不同的發(fā)育階段,以蛹態(tài)滯育,屬兼性滯育昆蟲,其每個(gè)世代的生活周期較長(zhǎng),一般最多為三化。在自然狀況下,柞蠶滯育的發(fā)生與解除,是適應(yīng)環(huán)境所產(chǎn)生的遺傳性生理過程,柞蠶的遺傳性(化性及化性的穩(wěn)定性)和環(huán)境因子(光照、溫度、營(yíng)養(yǎng)等)均與滯育的發(fā)生及解除有密切關(guān)系[3]。

由于柞蠶產(chǎn)業(yè)具有巨大的社會(huì)效益,研究并掌握、調(diào)控其滯育機(jī)制,可實(shí)現(xiàn)柞蠶放養(yǎng)技術(shù)的改革、育種手段的創(chuàng)立以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高效利用,可見研究利用柞蠶滯育機(jī)制,對(duì)于柞蠶業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要作用。

1 柞蠶滯育特性

1.1 滯育蟲態(tài)

研究表明,滯育在不同的昆蟲中所發(fā)生的蟲態(tài)也有所不同,如卵滯育、幼蟲滯育、蛹滯育和成蟲滯育[4]。柞蠶是蛹態(tài)滯育的昆蟲,佟秀云經(jīng)過連續(xù)3年的觀察試驗(yàn),總結(jié)出柞蠶滯育蛹進(jìn)入滯育期的重要標(biāo)志是:蛹長(zhǎng)與胃長(zhǎng)之比接近100∶37,胃質(zhì)濃縮變硬[5]。

1.2 滯育階段劃分

依據(jù)滯育在昆蟲個(gè)體間發(fā)生的狀況將其分為3個(gè)主要時(shí)期: 滯育前期,滯育期,滯育后期。根據(jù)生理生態(tài)特點(diǎn),滯育前期進(jìn)一步細(xì)分為誘導(dǎo)階段、準(zhǔn)備階段2個(gè)亞時(shí)期,滯育期細(xì)分為啟動(dòng)、維持、解除3個(gè)亞時(shí)相[2]。

1.2.1 滯育前期

誘導(dǎo)階段:以蛹滯育的昆蟲,感應(yīng)刺激的敏感階段多在幼蟲期[6],柞蠶在蛹化前的最后兩個(gè)齡期即柞蠶的壯蠶期(4—5齡幼蟲稱為壯蠶)最為敏感[7],接受到特殊的環(huán)境信號(hào),誘導(dǎo)其在后期注定進(jìn)入滯育。

準(zhǔn)備階段:在準(zhǔn)備階段,柞蠶壯蠶期食量增加,生長(zhǎng)到5齡末期,會(huì)在樹枝間徘徊,尋找適合營(yíng)繭的場(chǎng)所,為進(jìn)入滯育做準(zhǔn)備。

1.2.2 滯育期

昆蟲滯育期的長(zhǎng)短在不同種類、同種不同種群間、個(gè)體間均存在較大差異,從幾周至數(shù)月甚至長(zhǎng)達(dá)1年以上[8],二化性柞蠶秋蛹的滯育期大約在1個(gè)月左右[9]。

啟動(dòng):在這階段,昆蟲個(gè)體新陳代謝受到抑制,形態(tài)發(fā)生停止[2]。二化性柞蠶秋蛹在化蛹后第30天呼吸強(qiáng)度迅速降至極低水平,耗氧量?jī)H為化蛹后第28天的1/3左右,表明此時(shí)蛹體已進(jìn)人滯育狀態(tài)[9]。

維持:在這個(gè)階段,昆蟲個(gè)體發(fā)育完全停滯,且不會(huì)隨環(huán)境變化而有所改變[2]。處于最低水平的呼吸強(qiáng)度已成為昆蟲滯育的主要生理特征[10],二化性柞蠶秋蛹呼吸強(qiáng)度從化蛹后第30天直到化蛹第53天一直維持在較低水平,形成整個(gè)呼吸曲線的谷底,并且此時(shí)呼吸強(qiáng)度受溫度影響較小,這充分表明蛹體在此階段已處于滯育狀態(tài)[9]。

解除:許多昆蟲滯育的解除需要嚴(yán)格的外界條件,滯育解除目前尚缺乏明顯的標(biāo)志,需要進(jìn)一步研究[11]。

1.2.3 滯育后期

滯育解除后,環(huán)境條件尚不能滿足直接發(fā)育的恢復(fù),發(fā)育和新陳代謝仍為外源條件所抑制[2]。張義成的研究表明,二化性柞蠶秋蛹在化蛹后第56天呼吸強(qiáng)度迅速上升,此后至化蛹第153天始終處于較高水平,并隨溫度變化波動(dòng),表明此時(shí)已進(jìn)入滯育后期階段,但由于正值冬季氣溫較低,故蛹體也不能正常發(fā)育[9]。

2 環(huán)境因子對(duì)柞蠶滯育的影響

在影響昆蟲的滯育的諸多外界環(huán)境因子中,光照和溫度是最主要因素,濕度和食料次之。其中以光周期最為重要[12]。

2.1 非生物因子的影響

2.1.1 光周期的影響

誘導(dǎo)昆蟲滯育的光周期反應(yīng)類型分為長(zhǎng)日照反應(yīng)型、短日照反應(yīng)型、短日照-長(zhǎng)日照反應(yīng)型和中間日長(zhǎng)反應(yīng)型4種[13]。利用光周期反應(yīng)可以確定臨界光周期,當(dāng)光照時(shí)長(zhǎng)低于或高于臨界光周期時(shí),就會(huì)誘導(dǎo)昆蟲滯育的發(fā)生[14]。柞蠶幼蟲期,特別是壯蠶期光照的長(zhǎng)短可直接影響滯育的發(fā)生與否,關(guān)于柞蠶滯育臨界光周期前人做了許多相關(guān)試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果較為一致,認(rèn)為柞蠶為短日照反應(yīng)型,引起其滯育的臨界光周期為14 h左右,且確認(rèn)腦部是柞蠶幼蟲對(duì)于光線的直接感受器[3]。

柞蠶壯蠶期光照是引起柞蠶滯育的首要原因,但是處于臨界中間光照條件下,卵期光照也發(fā)揮作用。我國柞蠶的化性以北緯35°為分界線,北緯35°以北地區(qū)為二化性地區(qū),以南地區(qū)為一化性地區(qū),在一化性和二化性之間的過渡區(qū)域,為柞蠶化性不穩(wěn)定地帶[1]。在這個(gè)不穩(wěn)定地帶,研究發(fā)現(xiàn)柞蠶卵期感光是發(fā)生滯育的主要原因,但與壯蠶期短日照滯育型不同,柞蠶卵在短光照下不滯育,長(zhǎng)光照引發(fā)滯育[15],同時(shí)試驗(yàn)證實(shí),柞蠶卵的光照敏感時(shí)期為胚胎發(fā)育在單眼著色至孵化前[16]。

光周期不僅顯著影響柞蠶滯育的誘導(dǎo),也影響滯育的維持和解除,相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明,短光照使蛹體維持正常滯育,利用長(zhǎng)光照可以解除滯育,且不同化性品種解除滯育時(shí)所需光照處理時(shí)間有所差異[17,18],可見柞蠶的遺傳性(化性及化性的穩(wěn)定性)對(duì)滯育的發(fā)生與解除同樣關(guān)系密切。而且,研究證明,腦部是柞蠶滯育蛹接受光刺激的器官[19]。

2.1.2 溫度的影響

溫度對(duì)滯育的影響僅次于光周期,高溫對(duì)滯育產(chǎn)生抑制作用[7],低溫有利于維持滯育[20],且低溫是蛹滯育解除蛹滯育的必要條件,未經(jīng)低溫處理的滯育蛹,利用光周期無法解除滯育,且與光照感受器官相同,接受溫度感應(yīng)的器官也在柞蠶腦部[20]。

2.2 生物因子的影響

影響柞蠶滯育的生物因子主要是食料因子。相關(guān)研究表明,柞蠶滯育蛹的產(chǎn)生與否,隨幼蟲營(yíng)養(yǎng)期積累的多少而定,積累多的蛹滯育,積累少的蛹不滯育,而營(yíng)養(yǎng)積累的多少,又取決于壯蠶期每天攝食時(shí)間的長(zhǎng)短以及柞葉柔嫩程度,而攝食時(shí)間長(zhǎng)短以及柞葉柔嫩程度又與環(huán)境條件密切相關(guān)[21],可見食料因子是作為光周期和溫度反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子對(duì)昆蟲滯育發(fā)生影響的。

3 柞蠶滯育的生理生化基礎(chǔ)

3.1 滯育的激素調(diào)控作用

目前對(duì)昆蟲滯育調(diào)控機(jī)制的闡明主要從神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激素調(diào)節(jié)層面,其調(diào)控機(jī)理因滯育蟲態(tài)不同也各不相同。蛹滯育主要發(fā)生在鱗翅目昆蟲和雙翅目昆蟲中,由腦、前胸腺、咽側(cè)體三者相互作用,參與調(diào)控的激素最主要是促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone, PTTH)、蛻皮激素(Molting hormone, MH)[22,23]。

在柞蠶的滯育誘導(dǎo)過程中,當(dāng)柞蠶幼蟲腦接收到能引起滯育的環(huán)境信號(hào)以后,蛹腦的PTTH的合成和釋放就減少,從而使前胸腺停止分泌MH,使得蛹的發(fā)育停滯,從此進(jìn)入了滯育期[24]。

在柞蠶蛹解除滯育過程中,由腦合成的PTTH增加,促使前胸腺合成分泌MH,MH先后和一些受體復(fù)合物結(jié)合,誘導(dǎo)一些早期基因的轉(zhuǎn)錄,這些基因的轉(zhuǎn)錄激活了一系列參與蛻皮和變態(tài)過程[25],蛹期血淋巴中MH滴度下降后,促使由腦合成釋放羽化激素(Eclosion hormone, EH),來調(diào)節(jié)氣門腺蛻殼啟動(dòng)激素(Ecdysis triggering hormone, ETH)的分泌,最終在這一系列的激素調(diào)控下完成蛻皮及羽化過程[26]。

3.2 滯育的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)備與代謝

柞蠶體內(nèi)的物質(zhì)代謝,是蛹體滯育與否的物質(zhì)基礎(chǔ),柞蠶唯一攝取食物的時(shí)期為幼蟲期,其中五齡期占取食量的80%以上[27],因此五齡幼蟲期奠定了柞蠶蛹滯育的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2.1 脂類物質(zhì)代謝

滯育性柞蠶體內(nèi)游離脂肪的含量在五齡盛食期以后顯著高于非滯育性柞蠶,而游離脂肪是可利用的能源物質(zhì),說明滯育性柞蠶體內(nèi)大量積累游離脂肪是為了滯育做準(zhǔn)備[27]。

3.2.2 糖類物質(zhì)代謝

目前滯育昆蟲的糖原代謝途徑主要分為糖醇積累型和海藻糖積累型這2種類型,因昆蟲種類而異[28]。柞蠶屬于海藻糖積累型,滯育性柞蠶自五齡盛食期開始體內(nèi)大量積累脂肪體糖原,進(jìn)入滯育后糖原轉(zhuǎn)化為海藻糖,滯育解除后海藻糖又轉(zhuǎn)化為糖原。表明蛹體脂肪體糖原與血淋巴海藻糖之間互相轉(zhuǎn)化,且這種轉(zhuǎn)化受溫度影響,接觸低溫越早,溫度越低,海藻糖積累速度越快,積累量越高,峰期持續(xù)時(shí)間也越長(zhǎng),可以加深滯育強(qiáng)度,有利于維持滯育[20]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①斜視（顯斜視）；②任何眼部器質(zhì)性疾病，如白內(nèi)障、上瞼下垂等；③伴有顱內(nèi)疾病；④眼部手術(shù)史。

3.2.3 氨基酸變化

柞蠶滯育蛹體內(nèi)共有16種氨基酸,其中脯氨酸含量最高[29],進(jìn)一步說明脯氨酸與昆蟲耐寒性相關(guān)[30]。柞蠶滯育蛹血淋巴中的游離氨基酸含量隨著滯育的解除而逐漸降低,說明柞蠶蛹解除滯育后發(fā)育至成蟲階段,需要消耗大量的游離氨基酸,可見游離氨基酸作為代謝的中間產(chǎn)物,用于滯育期間和滯育解除后昆蟲的合成代謝與分解代謝[31]。

3.2.4 蛋白質(zhì)變化

蛋白質(zhì)含量與昆蟲滯育的誘導(dǎo)和解除密切相關(guān)[32],滯育性柞蠶體內(nèi)蛋白質(zhì)的增加在五齡盛食期以后顯著多于非滯育性柞蠶[33],說明柞蠶體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化與發(fā)生滯育相關(guān)。

此外,滯育昆蟲在進(jìn)入滯育前還會(huì)積累一種特殊的貯藏蛋白來存貯氨基酸,這些蛋白在滯育期間持續(xù)合成,維持較高濃度,且滯育終止后即消失,它被認(rèn)為與滯育的發(fā)生有關(guān),因而被稱為滯育關(guān)聯(lián)蛋白(DAP)[34,35]。目前已在多種昆蟲滯育蟲態(tài)的血淋巴或脂肪體中發(fā)現(xiàn)DAP的存在,柞蠶體內(nèi)同樣有DAP的存在,但是其具體作用機(jī)制還不明確[36,37]。

4 柞蠶滯育調(diào)控的分子機(jī)制

4.1 促前胸腺激素基因克隆及表達(dá)

李慧君克隆了柞蠶促前胸腺激素基因ApPTTH,通過表達(dá)分析,得到一些重要發(fā)現(xiàn)[24]:①在柞蠶5齡早期幼蟲的腦組織中檢測(cè)到ApPTTH的表達(dá),這與ApPTTH參與滯育的誘導(dǎo)有關(guān),在其卵巢組織也檢測(cè)到ApPTTH的表達(dá),但其表達(dá)機(jī)理有待研究;②qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ApPTTH的表達(dá)量在滯育過程中變化不大,而在解除滯育要進(jìn)入成蟲發(fā)育時(shí)ApPTTH的表達(dá)量升高而達(dá)到最大值,說明ApPTTH的表達(dá)及合成對(duì)滯育蛹解除滯育及成蟲發(fā)育至羽化具有有重要作用。

4.2 蛻皮激素受體相關(guān)基因克隆及表達(dá)

在柞蠶中已經(jīng)克隆了兩個(gè)蛻皮激素受體相關(guān)基因,ApEcRB1和ApUSP1。對(duì)這兩個(gè)基因的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明,柞蠶幼蟲蛻皮期間,ApEcRB1呈上調(diào)表達(dá),可見ApEcRB1在此期間參與蛻皮激素信號(hào)的接收,2個(gè)基因在化蛹期均呈現(xiàn)大幅度上調(diào)表達(dá)的規(guī)律,反映出這兩個(gè)基因在柞蠶變態(tài)發(fā)育中發(fā)揮作用;利用蛻皮激素誘導(dǎo)滯育蛹羽化的試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)滯育蛹中2個(gè)基因的表達(dá)量在注射20-羥基蛻皮甾酮(20E)后均明顯下降,在羽化前期表達(dá)量開始上升,且在蛹發(fā)育16 d(羽化前1 d)達(dá)最高,說明這 2個(gè)蛻皮激素受體基因的表達(dá)與羽化過程中的形態(tài)變化有關(guān)聯(lián),可能參與了組織器官的形成[38]。

4.3 代謝調(diào)節(jié)的分子機(jī)制

昆蟲滯育機(jī)制的研究表明其主要受激素調(diào)節(jié),但是這些激素所涉及的信號(hào)通路,包括昆蟲進(jìn)入滯育前的生理準(zhǔn)備,滯育維持需要的生理生化反應(yīng)及滯育的打破,都需要相關(guān)酶類和蛋白質(zhì)的參與和協(xié)作。

4.2.1 海藻糖酶參與的調(diào)節(jié)機(jī)制

作為昆蟲的血糖,海藻糖(trehalose)含量及海藻糖酶(trehalase,Treh)活力變化與昆蟲滯育、滯育的解除和發(fā)育密切相關(guān)[39]。為了利用海藻糖,昆蟲的許多組織擁有海藻糖酶,通過基因克隆、蛋白純化和酶活性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)昆蟲存在兩種不同類型海藻糖酶基因( Trehalase,Treh)。目前在柞蠶上已經(jīng)克隆獲得了兩個(gè)可溶性海藻糖酶基因(Treh1):ApTreh1A、ApTreh1B,和一個(gè)具有跨膜結(jié)構(gòu)的膜結(jié)合型海藻糖酶基因(Treh2):ApTreh2。通過表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),各組織中ApTreh2比ApTreh1的分布更廣且表達(dá)量更高。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明,長(zhǎng)光照處理后,柞蠶蛹脂肪體中ApTreh1A和ApTreh1B在21d時(shí)表達(dá)量都快速升高,ApTreh2 伴隨滯育的解除表達(dá)量逐漸升高,在28 d 時(shí)達(dá)到峰值,42d 時(shí)再次出現(xiàn)一個(gè)小高峰。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3個(gè)基因在柞蠶光照解除滯育及發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用,而且因在柞蠶滯育和發(fā)育過程中,各組織糖代謝途徑有所不同,3個(gè)基因的調(diào)控功能也不相同[40]。

4.2.2 柞蠶滯育關(guān)聯(lián)蛋白參與的調(diào)節(jié)機(jī)制

目前已在NCBI檢索獲得了兩個(gè)柞蠶滯育關(guān)聯(lián)蛋白(DAP)基因的序列,柞蠶滯育關(guān)聯(lián)蛋白基因2(diapause-associated protein 2,dap2),和柞蠶滯育關(guān)聯(lián)蛋白3(diapause-associated protein 2,DAP3)。序列比對(duì)分析顯示,DAP2與煙草天蛾和家蠶眼色素結(jié)合蛋白(OBP)同源性可達(dá)到56%和57%,其編碼基因在滯育蛹中的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平最高,推測(cè)其可能參與柞蠶滯育活動(dòng)中,但是具體的作用機(jī)制還不明確[36];DAP3基因主要在蛹期表達(dá),并隨著滯育進(jìn)程逐漸降低,通過與與家蠶滯育時(shí)鐘蛋白TIME-EA4的空間結(jié)構(gòu)比對(duì),表明兩者具有高同源性,推測(cè)其在滯育解除過程中可能發(fā)揮類似的功能[37]。

5 滯育在柞蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用

由于柞蠶的滯育對(duì)生產(chǎn)影響較大,還必須進(jìn)行深入研究,掌握其機(jī)制,在生產(chǎn)中加以調(diào)節(jié)控制,最大限度地利用自然資源,實(shí)現(xiàn)柞蠶生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。滯育在柞蠶生產(chǎn)應(yīng)用中的作用主要體現(xiàn)在以下三個(gè)方面。

一是改革柞蠶的放養(yǎng)系統(tǒng),創(chuàng)立“二化一放”放養(yǎng)技術(shù)和“一化二放”放養(yǎng)技術(shù)。這就需要充分掌握柞蠶的滯育誘導(dǎo)、維持和解除的技術(shù)方法,適時(shí)誘導(dǎo)柞蠶滯育,適當(dāng)加深其滯育強(qiáng)度,從而延長(zhǎng)柞蠶種繭的貯藏時(shí)期,在因?yàn)闊o霜期短而無法完成春秋兩季柞蠶放養(yǎng)的二化性地區(qū)實(shí)現(xiàn)“二化一放”放養(yǎng)技術(shù)[41],以及創(chuàng)建人工解除柞蠶滯育蛹的方法,適時(shí)打破其滯育,在溫度適宜的一化性蠶區(qū)增加一次秋季放養(yǎng)實(shí)現(xiàn)“一化二放”放養(yǎng)技術(shù)[42,43],從而充分利用各化性地區(qū)的氣候和豐富的柞樹資源。

二是選育柞蠶新品種,建立化性的綜合條件逆向選擇技術(shù)。這就需要研究柞蠶化性的遺傳規(guī)律,同時(shí)充分了解并利用季節(jié)、地點(diǎn)、光照、溫度、葉質(zhì)等最不利于柞蠶滯育的環(huán)境因子,從而選育在二化性地區(qū)能夠高滯育率的、化性穩(wěn)定的一化性品種[44]。

三是柞蠶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高效利用。已有研究表明,滯育蛹和輕度發(fā)育蛹培育的蠶蛹蟲草的出草率明顯高于用解除滯育蛹培育蠶蛹蟲草的出草率,且生產(chǎn)出的蛹蟲草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高[45],這與柞蠶滯育蛹體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累有關(guān),因此研究清楚柞蠶滯育的生理生化基礎(chǔ),對(duì)柞蠶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的應(yīng)用同樣非常重要。

6 小結(jié)與展望

柞蠶是以蛹滯育的經(jīng)濟(jì)昆蟲,充分了解掌握柞蠶的滯育特性、滯育的影響因子及滯育調(diào)控機(jī)制等,能夠進(jìn)一步補(bǔ)充豐富柞蠶的發(fā)育生物學(xué)和生理學(xué)研究,為實(shí)現(xiàn)柞蠶的滯育調(diào)控提供理論基礎(chǔ),最終為實(shí)際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

現(xiàn)在對(duì)于柞蠶的滯育研究已經(jīng)基本明確了包括滯育蟲態(tài)特征、滯育階段劃分、滯育發(fā)生條件、滯育解除手段在內(nèi)的諸多科學(xué)問題,但是對(duì)于生理代謝及分子調(diào)控機(jī)制還缺乏系統(tǒng)、深入的研究解釋,相信未來在這方面的研究會(huì)有所突破。