DCs、B10 細(xì)胞和Th17/Treg 失衡在慢性阻塞性肺疾病患者致病中的作用機(jī)制及其與肺功能的關(guān)聯(lián)性①

陸燕芳 吳雅娟 鄭江南 李靈芝 張劍鋒 （蘇州市第九人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，蘇州 215200）

我國慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者人數(shù)不斷上升，其中約50%為60歲以上的老年人，是老年人主要病死因素之一［1-2］。COPD 以氣流長期受限為主要特點(diǎn)，多繼發(fā)于慢性氣管炎、肺氣腫等疾病的慢性肺損害，若不及時干預(yù)可進(jìn)展成為呼吸衰竭或肺源性心臟病［3-4］。過去認(rèn)為COPD的主要致病因素由大氣污染導(dǎo)致［5］。隨著COPD 病因?qū)W研究發(fā)展，目前越來越多學(xué)者認(rèn)為COPD 屬于自身免疫性疾病。在COPD進(jìn)展過程中，大量免疫細(xì)胞被募集到患者肺部，造成局部炎癥、免疫反應(yīng)，促使肺損傷加重。研究發(fā)現(xiàn)，COPD 患者外周血中存在多種免疫細(xì)胞數(shù)量及表達(dá)異常，如樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等［6-7］。研究表明，DCs 可在氣管構(gòu)成防御系統(tǒng)，一旦氣管上皮受到侵襲，將趨化到此區(qū)域攝入抗原，然后將抗原提呈至相應(yīng)的T細(xì)胞，在局部發(fā)揮免疫調(diào)控作用［8］。CD1dhiCD5+CD19+B 細(xì)胞是目前研究較熱的新型調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞，被稱為B10細(xì)胞。B10 細(xì)胞通過分泌IL-10 對免疫功能起負(fù)向調(diào)節(jié)作用［9］。外周血輔助性T 細(xì)胞17（helper T cell 17，Th17）通過分泌IL-17 在局部發(fā)揮促炎效應(yīng)，而調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是CD4+T 細(xì)胞亞群，通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在局部發(fā)揮抑炎效應(yīng)［10-11］。在COPD 研究中，上述免疫細(xì)胞與COPD 進(jìn)展之間的機(jī)制聯(lián)系報道還很少。本研究旨在探討DCs、B10細(xì)胞和Th17/Treg 失衡在COPD 患者致病中的作用機(jī)制及其與肺功能的關(guān)聯(lián)性，為臨床COPD 病情評估、預(yù)測及診斷提供重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013 年修訂版）》［12］，前瞻性選取蘇州市第九人民醫(yī)院2019 年5 月至2021 年12 月診治的93 例COPD 患者，男50 例，女43 例，年齡63～78 歲。每位患者均隨訪1年，觀察急性加重期COPD（acute exacerbation of COPD，AECOPD）發(fā)生情況。依據(jù)《慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）診治中國專家共識（2017 年更新版）》［13］將其分為COPD 穩(wěn)定期組與AECOPD 組。急性加重期是指在疾病過程中，患者短期內(nèi)咳嗽、咯痰、氣短和/或喘息加重，痰量增多，呈膿性或黏液膿性，可伴有發(fā)熱等炎癥明顯加重表現(xiàn)，需改變基礎(chǔ)治療者。另外選取50例同期健康體檢者為對照組，男30 例，女20 例，年齡63～77 歲。COPD 患者與對照組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between two groups

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡<80歲；符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》標(biāo)準(zhǔn)［12］；近期未服用激素類藥物；意識清晰并能配合；患者和家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有肺部良、惡性腫瘤；伴有哮喘；伴有肺部嚴(yán)重病變或支氣管病變；伴有膿胸；伴有氣胸；伴有肺栓塞；伴有心衰；伴有胸部手術(shù)史；合并精神疾??；中途退出治療或退出本研究，病歷資料不全。全部研究者均知情同意，并經(jīng)蘇州市第九人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（KY2019-016-01）。

1.1.3 試劑與儀器 FACS Calibur 流式細(xì)胞儀（B13581）購于美國BD 公司；IL-12、IL-10、IL-17A 與TGF- β1 ELISA 試 劑 盒（201810254、201901033、201901025、201805102）購于上海碧云天生物科技公司；胎牛血清（S21102851）購于美國Gibco 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基（H2015147）購于美國Hyclone 公司。肺功能檢測儀（C300 型號）購于日本CHEST公司。

1.2 方法

1.2.1 DCs、B10、Th17、Treg 細(xì) 胞 與Th17/Treg 檢測 采集所有初次入院患者AECOPD 發(fā)生時及健康體檢者的空腹外周靜脈血約5 ml，通過淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞，密度梯度離心法獲得外周血中單個核淋巴細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）。以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基將PBMCs 密度調(diào)整至1×109個/L。各取1 ml 細(xì)胞懸液加入相應(yīng)流式管內(nèi)，以熒光抗體進(jìn)行染色，并設(shè)置相應(yīng)對照組。細(xì)胞與抗體充分混勻后，室溫避光孵育1 h。應(yīng)用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀分別檢測DCs、B10、Th17、Treg細(xì)胞與Th17/Treg。

1.2.2 ELISA 應(yīng)用ELISA 檢測上述外周血血清中IL-12、IL-10、IL-17A 與TGF-β1 水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定450 nm 處的吸光度，均設(shè)3個復(fù)孔，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定各樣本濃度。

1.2.3 肺功能檢測 應(yīng)用肺功能檢測儀檢測秒用力呼氣量1（forced expiratory volume in 1 second to the expected value，F(xiàn)EV1）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、用力肺活量占預(yù)計值百分比（percentage of forced vital capacity to the expected value，F(xiàn)VC%）、第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比（percentage of forced expiratory volume in 1 second to the expected value，F(xiàn)EV1%）。

1.2.4 評價指標(biāo) 比較COPD 穩(wěn)定組或AECOPD組患者的病程、改良英國醫(yī)學(xué)研究學(xué)會呼吸困難指數(shù)（mMRC）分級、COPD 評估測試（CAT）評分、BODE指數(shù)評分、6 min 步行距離（6MWD）、動脈血氧分壓（PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）；比較對照組、COPD 穩(wěn)定組與AECOPD 組FEV1、FVC、FEV1/FVC、FEV1 占預(yù)計值百分比（FEV1/Pred）；比較對照組、COPD 穩(wěn)定組與AECOPD 組外周血DCs、B10、Th17、Treg 細(xì)胞及Th17/Treg；比較對照組、COPD 穩(wěn)定組與AECOPD 組外周血IL-12、IL-10、IL-17A 與TGF-β1表達(dá)水平；分析AECOPD 組外周血DCs、B10 細(xì)胞和Th17/Treg 失衡與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性；Logistic 回歸分析AECOPD發(fā)生的獨(dú)立危險因素。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 以SPSS21.0 軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，以Kolmogorov-Smirnov法檢驗(yàn)其分布特征，計數(shù)資料以［n（%）］表示，χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，t檢驗(yàn)。三組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），F(xiàn)檢驗(yàn)。偏態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，三組間比較采用Kruskal-Wallis 和檢驗(yàn)。在相關(guān)性分析中，符合正態(tài)分布采用Pearson 分析，偏態(tài)分布采用Spearman 分析。Logistic 回歸分析AECOPD 發(fā)生的獨(dú)立危險因素。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪AECOPD 事件 本研究均獲得隨訪，平均隨訪時間為1 年，其中38 例患者發(fā)生AECOPD 事件占40.86%，男20例，女18例，年齡67～77歲，平均（72.76±5.40）歲，55 例（59.14%）患者未發(fā)生AECOPD事件。

2.2 COPD 穩(wěn)定組與AECOPD 組患者病程、mMRC分級、CAT 評分、BODE 評分、6MWD、PaO2、PaCO2的比較 AECOPD 組患者病程、mMRC 分級、CAT 評分、BODE 評分、PaCO2均明顯高于COPD 穩(wěn)定組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而6MWD 和PaO2均明顯低于COPD 組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 COPD穩(wěn)定組或AECOPD組患者病程、mMRC分級、CAT評分、BODE評分、6MWD、PaO2、PaCO2比較（±s）Tab.2 Comparison of disease course， mMRC grade， CAT score， BODE score， 6MWD， PaO2， PaCO2 of patients in COPD stable phase group or AECOPD group （±s）

表2 COPD穩(wěn)定組或AECOPD組患者病程、mMRC分級、CAT評分、BODE評分、6MWD、PaO2、PaCO2比較（±s）Tab.2 Comparison of disease course， mMRC grade， CAT score， BODE score， 6MWD， PaO2， PaCO2 of patients in COPD stable phase group or AECOPD group （±s）

Groups n CAT/score 6MWD/m PaO2/mmHg PaCO2/mmHg COPD stable phase AECOPD 55 38 t P Disease duration/year 9.12±1.88 10.37±2.59 2.546 0.013 mMRC grading/score 2.04±0.40 3.23±0.34 15.431<0.001 16.31±3.48 26.54±4.67 11.474<0.001 BODE score/score 3.43±0.93 7.73±2.43 10.381<0.001 342.11±55.13 189.43±43.40 14.920<0.001 86.35±3.22 67.91±7.41 14.410<0.001 38.52±5.07 47.43±7.15 6.614<0.001

2.3 三組患者FEV1、FVC、FEV1/FVC 與 FEV1/Pred水平比較 三組患者外周血FEV1、FVC、FEV1/FVC 與FEV1/Pred 水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。AECOPD 組患者的FEV1、FVC、FEV1/FVC 與FEV1/Pred 水平明顯低于COPD 穩(wěn)定期組與對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；COPD 穩(wěn)定期患者FEV1、FVC、FEV1/FVC 與 FEV1/Pred 水平低于健康對照，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 三組患者FEV1、FVC、FEV1/FVC 與 FEV1/Pred 水平比較Fig.1 Comparison of FEV1，F(xiàn)VC，F(xiàn)EV1/FVC and FEV1/Pred levels among three groups

2.4 三組外周血DCs、B10、Th17、Treg細(xì)胞與Th17/Treg 比較 三組患者外周血DCs、Th17、Treg 細(xì)胞與Th17/Treg 比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。AECOPD 組患者的DCs、B10 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞比例明顯低于COPD 穩(wěn)定期組及對照組，而Th17 表達(dá)水平與Th17/Treg 明顯高于COPD 穩(wěn)定期組與對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；COPD 穩(wěn)定期患者的DCs、B10、Treg 細(xì)胞明顯低于對照組，而Th17 表達(dá)水平與Th17/Treg明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 三組外周血DCs、B10、Th17、Treg細(xì)胞與Th17/Treg比較（±s）Tab.3 Comparison of DCs， B10， Th17， Treg cells and Th17/Treg ratios in peripheral blood of three groups （±s）

表3 三組外周血DCs、B10、Th17、Treg細(xì)胞與Th17/Treg比較（±s）Tab.3 Comparison of DCs， B10， Th17， Treg cells and Th17/Treg ratios in peripheral blood of three groups （±s）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with COPD stable group， 2）P<0.05.

Th17/Treg 0.31±0.09 1.36±0.711）2.65±0.931）2）138.869<0.001 Groups Control COPD stable AECOPD F/H P n 50 55 38 DCs/%0.23（0.16，0.29）0.18（0.14，0.22）1）0.09（0.07，0.13）1）2）156.368<0.001 B10/%2.45（1.76，2.98）1.25（0.98，1.67）1）0.87（0.70，1.02）1）2）258.913<0.001 Th17/%1.22±0.21 5.43±0.421）7.12±0.541）2）2632.047<0.001 Treg/%6.43±1.11 4.32±0.881）2.75±0.431）2）193.617<0.001

2.5 三組外周血IL-12、IL-10、IL-17A 與TGF-β1 表達(dá)水平比較 三組患者外周血的IL-12、IL-10、IL-17A 與TGF-β1表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。AECOPD 組患者IL-12、IL-10 與TGFβ1 表達(dá)水平明顯低于COPD 穩(wěn)定期組與對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而IL-17A 水平明顯高于COPD 穩(wěn)定期組與對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；COPD 穩(wěn)定期患者IL-12、IL-10 與TGF-β1表達(dá)水平明顯低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而IL-17A 水平明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

圖2 三組患者外周血的IL-12、IL-10、IL-17A 與TGF-β1表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of expression levels of IL-12， IL-10，IL-17A and TGF-β1 in peripheral blood of three groups

2.6 AECOPD 組患者外周血DCs、B10 和Th17/Treg與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，外周血DCs、B10 細(xì)胞與FEV1、FVC、FEV1/FVC、FEV1/Pred水平均呈正相關(guān)（P<0.05），而Th17/Treg 與FEV1、FVC、FEV1/FVC 與FEV1/Pred 水平均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。見表4。

2.7 AECOPD 發(fā)生風(fēng)險的Logistic 回歸分析 去除對照組資料后，將2.2、2.3 中COPD 穩(wěn)定組或AECOPD 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量納入Logistic回歸模型，以老年人是否發(fā)生AECOPD 作為因變量（0=否，1=是），結(jié)果顯示，mMRC 分級、Th17/Treg 是AECOPD 發(fā)生的獨(dú)立危險因素（P<0.05），見表5。

表5 AECOPD發(fā)生風(fēng)險的Logistic回歸分析Tab.5 Logistic regression analysis of risk of AECOPD

3 討論

COPD 具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，以往研究表明，COPD 由內(nèi)在和外在環(huán)境共同作用導(dǎo)致［14］。當(dāng)患者發(fā)生感冒或受涼后，可出現(xiàn)AECOPD，尤其在冬季，經(jīng)常表現(xiàn)為活動后胸悶和氣短，到晚期胸悶、氣短情況可一直存在，小范圍活動即可導(dǎo)致癥狀加重［15-16］。在本研究中，隨訪1 年，有38 例COPD 患者發(fā)生AECOPD 事件，占40.86%。AECOPD 組的病程、mMRC 分級、CAT 評分、BODE 指數(shù)評分、PaCO2均明顯高于COPD 穩(wěn)定組，而6MWD 和PaO2均明顯低于COPD 組，這與劉兆陽［17］研究結(jié)果一致，提示AECOPD患者的呼吸功能大幅受限，病程越長，發(fā)生AECOPD 的概率越大。另外在肺功能的監(jiān)測中，發(fā)現(xiàn)三 組患者 外周血 的FEV1、FVC、FEV1/FVC 與FEV1/Pred 水平比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。AECOPD 組患者的FEV1、FVC、FEV1/FVC與FEV1/Pred 水平明顯高于COPD 穩(wěn)定期組與對照組；COPD 穩(wěn)定期患者的FEV1、FVC、FEV1/FVC 與FEV1/Pred 水平明顯高于對照組，說明AECOPD 事件發(fā)生后，患者的肺功能急劇惡化。因而積極尋找AECOPD 事件發(fā)生的預(yù)測治療對延緩COPD 肺功能損傷有重要意義。

隨著人們對感染、炎癥及免疫學(xué)的了解不斷加深，通過肺的局部病變，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞趨化至肺部，促進(jìn)肺免疫性損傷，造成肺功能惡化［18］。當(dāng)人體正常組織和生理微環(huán)境長期持續(xù)受到局部的物質(zhì)侵害時，可啟動機(jī)體免疫清除反應(yīng)，通過多種免疫細(xì)胞附著，殺滅微生物，然而長期過度免疫效應(yīng)可使其發(fā)生免疫過度，造成正常肺組織受損，使肺通氣及肺換氣功能大幅受限［19］。因而研究肺組織免疫損傷機(jī)制對老年COPD 的監(jiān)測、評估與治療具有重要意義。近年DCs 研究逐漸增加抗原呈遞細(xì)胞，由學(xué)者STEINMAN 在1973 年首次在小鼠淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)，通過能攝取與呈遞作用，使效應(yīng)T 細(xì)胞激活，啟動免疫清除作用，在治療哮喘等疾病中起到了很重要作用［20］。B10 細(xì)胞是負(fù)向調(diào)節(jié)性的B 細(xì)胞，主要分泌IL-10。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)相互作用因子1（stromal interaction molecule1，STIM1）可通過IL-10 調(diào)控B細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，小鼠體內(nèi)缺乏STIM時，B細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用，B10 細(xì)胞在自身免疫病調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［21］。Th17 主要誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通過分泌IL-17促炎因子，而Treg 則通過分泌等TGF-β 抑炎因子調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，維持外周免疫耐受，與免疫性疾病關(guān)系密切，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫性甲狀腺炎、COPD等，二者處于一種動態(tài)平衡［22-24］。

本研究中AECOPD 組患者Th17 細(xì)胞比例與Th17/Treg 明顯高于COPD 穩(wěn)定期組與對照組，而B10 細(xì)胞水平與Treg 細(xì)胞明顯低于COPD 穩(wěn)定期組與對照組；COPD穩(wěn)定期患者Th17細(xì)胞比例與Th17/Treg 明顯高于對照組，而DCs、B10 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞比例明顯低于對照組。此外，AECOPD 組患者IL-12與IL-10 表達(dá)水平明顯低于COPD 穩(wěn)定期組與對照組；COPD 穩(wěn)定期患者IL-12 與IL-10 表達(dá)水平明顯低于對照組。AECOPD 組患者的IL-17A 與TGF-β1表達(dá)水平明顯高于COPD 穩(wěn)定期組與對照組；COPD穩(wěn)定期患者的IL-17A 與TGF-β1 表達(dá)水平高于對照組，這與吳瑩瑩等［25］結(jié)果具有一定相似性，表明DCs、Th17、Treg 細(xì)胞及其相應(yīng)分泌因子在COPD 的發(fā)病以及急性加重中發(fā)揮重要作用。分析認(rèn)為，COPD 患者體內(nèi)的DCs、Th17、Treg 細(xì)胞與Th17/Treg的失衡狀態(tài)，使患者肺部長期處于慢性炎癥反應(yīng)，發(fā)生免疫損傷，使肺功能不斷破壞。而一旦機(jī)體發(fā)生強(qiáng)烈的病理性刺激時，COPD 將進(jìn)展至AECOPD，造成機(jī)體內(nèi)大量免疫細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量致炎因子，過多的免疫細(xì)胞及其因子造成級聯(lián)式肺損傷，使肺部炎癥反應(yīng)擴(kuò)散，使肺組織及全身多器官功能受損，誘發(fā)多器官功能障礙。

此外，Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，外周血DCs、B10 細(xì)胞與FEV1、FVC、FEV1/FVC、FEV1/Pred 水平均呈正相關(guān)，而Th17/Treg 與FEV1、FVC、FEV1/FVC與FEV1/Pred 水平均呈負(fù)相關(guān)，提示機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞群體紊亂促進(jìn)肺功能失調(diào)，造成肺的通氣量與換氣量均減少。DCs 與B10 細(xì)胞屬于輔助性免疫性細(xì)胞，介導(dǎo)免疫細(xì)胞功能激活與抑制，因而當(dāng)其數(shù)量增加時可激活過多的效應(yīng)細(xì)胞造成肺部的免疫損傷，抑制肺功能。研究表明，Th17/Treg 失衡參與COPD、支氣管哮喘、肺癌、肺纖維化等多種肺疾病的免疫過程，與多種慢性肺通氣障礙疾病具有相關(guān)性，相對于對照組，COPD 與AECOPD 患者的外周血Th17、Th17/Treg 均升高，Treg 下降，尤其在AECOPD患者，這些變化更明顯。通過Logistic多元回歸模型進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，mMRC 分級與Th17/Treg 是AECOPD發(fā)生風(fēng)險的獨(dú)立危險因素，提示這些指標(biāo)升高預(yù)示著COPD 肺功能惡化。說明COPD 患者外周血的Th17/Treg 處于平衡狀態(tài)對延緩患者肺損傷有重要作用，也預(yù)示著進(jìn)行體外人為干預(yù)Th17/Treg可能是抑制AECOPD 的重要途徑。因此，老年COPD 患者外周血DCs、B10 細(xì)胞和Th17/Treg 變化可作為COPD 是否進(jìn)展的預(yù)測指標(biāo)，這對減少AECOPD 發(fā)生有重要意義。

綜上所述，隨著COPD 進(jìn)展，DCs、Th17、Treg 細(xì)胞與Th17/Treg逐漸呈現(xiàn)失衡狀態(tài)，造成促炎因子及抗炎因子表達(dá)水平紊亂；外周血DCs、B10 細(xì)胞與肺功能水平均呈正相關(guān)，而Th17/Treg與肺功能水平均呈負(fù)相關(guān)，mMRC 分級、Th17/Treg 是AECOPD 發(fā)生的獨(dú)立危險因素。因此積極干預(yù)患者免疫功能失衡狀態(tài)對降低肺組織的免疫損傷，改善肺功能具有重要的臨床意義。