基于生物信息學(xué)方法分析SHCBP1基因在肺腺癌中的表達(dá)及臨床意義①

連巖巖 萬宇翔 李麗玲 張春光 黃金昶 （北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京100029）

肺癌是發(fā)病率及病死率最高的癌癥之一，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是一種常見的肺癌病理亞型，其發(fā)病隱匿，具有早期轉(zhuǎn)移趨勢，確診時(shí)多處于晚期，五年生存率僅為15%［1-3］。因此，挖掘新的與LUAD 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，對于改善患者預(yù)后具有重要意義。

SHC 蛋白被認(rèn)為是與細(xì)胞表面受體相關(guān)的結(jié)合蛋白，在信號傳導(dǎo)和疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，SHC 的SH2 結(jié) 構(gòu) 域 結(jié) 合 蛋 白1（SHC SH2-binding protein 1，SHCBP1）是SHC 蛋白SH2 結(jié)構(gòu)域上的重要連接蛋白［4］。SHCBP1參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并可調(diào)節(jié)FGF、NF-κB、PI3K/AKT、TGF-β1/Smad 等多種信號通路［4］。目前關(guān)于SHCBP1 在LUAD 中表達(dá)的相關(guān)研究較少，本研究利用多種常用公共數(shù)據(jù)庫中LUAD 的臨床數(shù)據(jù)，挖掘SHCBP1在LUAD 中的表達(dá)水平及其與LUAD預(yù)后的關(guān)系，并評估SHCBP1與腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞、免疫標(biāo)志物及免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性，為臨床進(jìn)一步深入探究SHCBP1在LUAD發(fā)生發(fā)展中的作用及免疫細(xì)胞浸潤提供參考。

1 資料與方法

1.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫 Oncomine 數(shù)據(jù)庫（https：//www.oncomine.org）是目前世界上最大的在線癌基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，可對正常組織和腫瘤組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析［5］。根據(jù)本研究需求，設(shè)定具體篩選條件：①gene：輸入SHCBP1；②Analysis Type：選擇Cancer vs Normal Analysis；③Cancer Type：選擇Lung Cancer；④Data Type：mRNA；⑤臨 界 值 設(shè) 定：P<0.000 1，F(xiàn)OLD CHANGE>2，GENE RANK=10%，分析SHCBP1 mRNA 在腫瘤組織與正常組織間的表達(dá)差異。

1.2 TIMER 數(shù) 據(jù) 庫 TIMER 數(shù) 據(jù) 庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）提供了腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的全面分析和可視化功能，可系統(tǒng)性地分析不同癌癥類型免疫細(xì)胞浸潤［6］。通過反卷積方法估算腫瘤組織中6 種免疫細(xì)胞（B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）浸潤的豐度。本研究用Diff Exp 模塊分析SHCBP1 mRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異；Gene 模塊分析SHCBP1 mRNA 表達(dá)和各種免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系；Survival 模塊分析腫瘤免疫細(xì)胞浸潤水平對LUAD 患者預(yù)后的影響；Correlation 模塊分析SHCBP1 mRNA與LUAD免疫浸潤細(xì)胞標(biāo)志物、免疫檢查點(diǎn)之間的相關(guān)性。

1.3 GEPIA 數(shù)據(jù)庫 GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）是由北京大學(xué)開發(fā)的交互式Web 服務(wù)器，提供基因差異表達(dá)分析、輪廓圖繪制、相關(guān)性分析、生存分析等功能［7］。本研究應(yīng)用GEPIA 分析SHCBP1 mRNA 在LUAD 組織中的表達(dá)水平及其對LUAD 患者預(yù)后的影響，進(jìn)一步分析SHCBP1 mRNA與免疫檢查點(diǎn)間的關(guān)系。

1.4 UALCAN 數(shù) 據(jù) 庫 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）是癌癥基因組學(xué)門戶網(wǎng)站［8］，數(shù)據(jù)主要來源于TCGA 數(shù)據(jù)庫，可用于分析基因在腫瘤和正常樣本中的差異性表達(dá)，同時(shí)可以比較不同腫瘤臨床特征與基因表達(dá)的相關(guān)性。使用該網(wǎng)站分析LUAD患者的臨床特征與SHCBP1 mRNA表達(dá)情況。

1.5 Kaplan-Meier plotter 數(shù) 據(jù) 庫 Kaplan-Meier plotter （www.kmplot.com）在線數(shù)據(jù)庫是一個(gè)腫瘤預(yù)后分析的在線網(wǎng)站［9］，用于評估SHCBP1 mRNA表達(dá)對LUAD患者預(yù)后的影響。

1.6 STRING 數(shù)據(jù)庫 通過STRING 數(shù)據(jù)庫分析與SHCBP1 有相關(guān)作用的基因及蛋白，并進(jìn)行KEGG通路富集分析，以期預(yù)測SHCBP1 發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 SHCBP1 在常見惡性腫瘤中的表達(dá)情況 在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)篩選條件分析了不同腫瘤和各正常組織中SHCBP1 mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果提示共有293 項(xiàng)不同類型的研究結(jié)果（圖1A），其中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的研究結(jié)果有54 項(xiàng)，SHCBP1 mRNA 表達(dá)增高的研究有49 項(xiàng)，表達(dá)降低的研究有5項(xiàng)，紅框中是SHCBP1 mRNA 在肺癌中的差異表達(dá)情況，顯示SHCBP1 mRNA 在肺癌中高表達(dá)。采用TIMER 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步比較SHCBP1 mRNA 在不同腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)LUAD 中SHCBP1 mRNA 表達(dá)明顯高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖1B）。

圖1 SHCBP1 mRNA在不同腫瘤中的表達(dá)Fig.1 Expression of SHCBP1 mRNA in different tumors

2.2 LUAD 中SHCBP1 mRNA 的表達(dá)情況 在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中，通過上述檢索條件，共找到3 項(xiàng)關(guān)于LUAD 和正常肺組織中SHCBP1 芯片表達(dá)的研究（表1）。薈萃比較結(jié)果提示（圖2A），相比正常肺組織，SHCBP1 mRNA 在LUAD 中的表達(dá)顯著升高（Median Rank=594，P<0.000 1）。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫，在LUAD 組織中進(jìn)一步驗(yàn)證SHCBP1 的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果證實(shí)SHCBP1 mRNA 在LUAD 組織中表達(dá)明顯升高（圖2B）。

表1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中SHCBP1 在LUAD 與正常肺組織中的表達(dá)水平Tab.1 Expression level of SHCBP1 in Oncomine database in LUAD and normal lung tissues

圖2 SHCBP1 mRNA在LUAD中的表達(dá)Fig.2 SHCBP1 mRNA expression in LUAD

2.3 SHCBP1 與LUAD 臨床特征的關(guān)系 通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫對LUAD 患者的SHCBP1 mRNA 水平與臨床特征的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與正常肺組織相比，SHCBP1 mRNA 在高加索人、非裔美國人、亞洲人種均表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而各人種間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A）；吸煙患者與戒煙患者SHCBP1 mRNA 表達(dá)均明顯上升（P<0.01），提示SHCBP1 mRNA 表達(dá)上升與有吸煙史密切相關(guān)（圖3B）；男性和女性SHCBP1 mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）；SHCBP1 mRNA 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，N0、N1、N2 期SHCBP1 mRNA表達(dá)均顯著高于正常肺組織（P<0.000 1），N3與N2相比有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3D）；Ⅰ期與Ⅲ期和Ⅳ期SHCBP1 mRNA 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅲ期與Ⅳ期SHCBP1 mRNA 表達(dá)相比有上升趨勢，提示分期越晚SHCBP1 mRNA 表達(dá)水平越高（圖3E），表明可依據(jù)SHCBP1 mRNA 表達(dá)水平作為判斷分期的指標(biāo)；存在TP53 突變的LUAD 組織中SHCBP1 mRNA 表達(dá)明顯高于不存在TP53突變的LUAD組織（P<0.000 1，圖3F）。

圖3 SHCBP1 mRNA與LUAD患者臨床特征的關(guān)系Fig.3 Relationship between SHCBP1 mRNA and clinical features of LUAD patients

2.4 SHCBP1 mRNA 表達(dá)與LUAD 患者預(yù)后的關(guān)系 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析SHCBP1 mRNA 表達(dá)與LUAD 患者預(yù)后的關(guān)系。預(yù)后分析結(jié)果顯示，與SHCBP1 mRNA 低表達(dá)組相比，SHCBP1 mRNA 高表達(dá)組LUAD 患者總生存期顯著降低（HR=1.8，P<0.001，圖4A），結(jié)果通過Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫得到驗(yàn)證（HR=1.72，P<0.000 1，圖4B），表明SHCBP1 mRNA高表達(dá)的LUAD患者預(yù)后較差。

圖4 SHCBP1 mRNA表達(dá)與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系Fig.4 Relationship between expression of SHCBP1 mRNA and prognosis of LUAD patients

2.5 SHCBP1 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及KEGG 通路富集分析 通過STRING 數(shù)據(jù)庫對SHCBP1 進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，根據(jù)蛋白關(guān)聯(lián)性共獲得與SHCBP1 相關(guān)的蛋白10個(gè)，該網(wǎng)絡(luò)平均連接度為8.36，SHCBP1的連接度為10，為網(wǎng)絡(luò)的核心（圖5）。KEGG 通路富集發(fā)現(xiàn)，存在5個(gè)與免疫密切相關(guān)的條目（表2）。

表2 SHCBP1相互作用蛋白的KEGG通路富集分析Tab.2 KEGG pathway enrichment analysis of SHCBP1 interacting proteins

圖5 SHCBP1相關(guān)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Protein-protein interaction network of SHCBP1 related genes

2.6 LUAD 中免疫細(xì)胞浸潤水平與SHCBP1 mRNA表達(dá)的關(guān)系 利用TIMER 數(shù)據(jù)庫檢測LUAD 中腫瘤免疫細(xì)胞浸潤水平與SHCBP1 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性（圖6）。在LUAD 中，SHCBP1 mRNA 表達(dá)與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)（cor=-0.098，P<0.05），與B細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)（cor=-0.141，P<0.01），與CD8＋T細(xì)胞（cor=0.120，P<0.01）、中性粒細(xì)胞（cor=0.243，P<0.000 1）和樹突狀細(xì)胞（cor=0.132，P<0.01）的浸潤呈正相關(guān)。

圖6 LUAD中免疫細(xì)胞浸潤水平與SHCBP1 mRNA表達(dá)的關(guān)系Fig.6 Relationship between immune cell infiltration level and SHCBP1 expression in LUAD

2.7 LUAD中SHCBP1 mRNA表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤程度對預(yù)后的影響 利用TIMER 數(shù)據(jù)庫生成Kaplan-Meier 曲線，以研究SHCBP1 mRNA 表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤程度對LUAD 預(yù)后的影響（圖7）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B 細(xì)胞浸潤（P<0.001）、樹突狀細(xì)胞浸潤（P=0.048）和SHCBP1 mRNA 表 達(dá)（P<0.001）與LUAD 預(yù)后顯著相關(guān)，B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤低的LUAD 患者預(yù)后較差，SHCBP1 高表達(dá)的LUAD 患者預(yù)后較差。

2.8 LUAD中SHCBP1 mRNA表達(dá)與不同類型免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性 本研究利用TIMER 數(shù)據(jù)庫探討了LUAD 中SHCBP1 mRNA 表達(dá)水平與不同類型免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性，包括CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、輔助性T 細(xì)胞17、Treg 細(xì)胞和T 細(xì)胞耗竭標(biāo)志物（表3）。經(jīng)腫瘤純度校正后發(fā)現(xiàn)，LUAD 中的SHCBP1 表達(dá)水平與CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、M2 型巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞耗竭表面標(biāo)志物呈正相關(guān)（0.1≤cor≤1.0，P<0.05）。

表3 LUAD中SHCBP1與免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性Tab.3 Correlation between SHCBP1 and immune cell markers in LUAD

2.9 SHCBP1 mRNA與LUAD免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系由于PD-1/PD-L1 和CTLA-4 是負(fù)責(zé)腫瘤免疫逃逸的重要免疫檢查點(diǎn)。考慮到SHCBP1 在LUAD 中的潛在致癌作用，應(yīng)用TIMER 評估了SHCBP1 mRNA 與PD-1、PD-L1 和CTLA-4 的關(guān)系。經(jīng)腫瘤純度校正后發(fā)現(xiàn)，SHCBP1表達(dá)與LUAD中PD-1、PD-L1和CTLA-4的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（圖8A、C、E），且結(jié)果通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫得到了驗(yàn)證（圖8B、D、F）。提示腫瘤免疫逃逸可能與SHCBP1介導(dǎo)的LUAD發(fā)生有關(guān)。

圖8 SHCBP1與LUAD中PD-1、PD-L1和CTLA-4的相關(guān)性Fig.8 Correlation of SHCBP1 expression with PD-1， PDL1 and CTLA-4 expressions in LUAD

3 討論

本研究利用多個(gè)數(shù)據(jù)庫分析了LUAD 組織和正常肺組織中SHCBP1 的表達(dá)水平及其與LUAD 臨床特征、預(yù)后及腫瘤免疫浸潤的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，SHCBP1 mRNA 在LUAD 中高表達(dá)，且SHCBP1 mRNA 表達(dá)與有吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TP53 突變密切相關(guān)。HU 等［13］研究發(fā)現(xiàn)吸煙顯著影響P53 信號通路，可能有助于LUAD 的發(fā)病。此外本研究發(fā)現(xiàn)LUAD分期越晚，SHCBP1 mRNA表達(dá)水平越高，提示可依據(jù)SHCBP1 表達(dá)水平作為判斷分期的指標(biāo)。生存分析發(fā)現(xiàn)SHCBP1 mRNA 的高表達(dá)與LUAD 患者較差的總生存期顯著相關(guān)。WANG 等［14］研究發(fā)現(xiàn)SHCBP1 的表達(dá)可能在肺癌中上調(diào)；ZOU 等［15］研究發(fā)現(xiàn)SHCBP1 高表達(dá)的肺癌患者預(yù)后較差。這些結(jié)果與本研究的發(fā)現(xiàn)大致相符，提示SHCBP1 高表達(dá)與LUAD 的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。

肺癌的發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞間的相互作用，腫瘤浸潤免疫細(xì)胞在促進(jìn)或抑制腫瘤生長中起重要作用，癌癥的惡性表型與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞密切相關(guān)［16-17］。通過STRING 構(gòu)建SHCBP1 相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行KEGG 通路富集分析，結(jié)果顯示有5 條通路與免疫密切相關(guān)，包括病毒致癌、人類T細(xì)胞白血病病毒1 感染、細(xì)菌入侵上皮細(xì)胞、NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、乙型肝炎通路，SHCBP1 可能通過調(diào)控上述通路影響LUAD 的發(fā)生發(fā)展和免疫浸潤。本研究進(jìn)一步挖掘了SHCBP1 mRNA 與LUAD 免疫浸潤的關(guān)系，結(jié)果顯示SHCBP1 mRNA 的表達(dá)水平與腫瘤純度、B 細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)，與CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)。提示SHCBP1可能參與對LUAD 腫瘤微環(huán)境的免疫應(yīng)答，尤其是對B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的免疫應(yīng)答。另外，經(jīng)腫瘤純度校正后發(fā)現(xiàn)SHCBP1 mRNA 的表達(dá)與大部分免疫標(biāo)志物顯著相關(guān)，尤其與CD8+T細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞耗竭表面標(biāo)志物表達(dá)水平有很強(qiáng)的正相關(guān)性，表明SHCBP1 可能通過調(diào)節(jié)以上免疫細(xì)胞影響LUAD 的免疫浸潤。越來越多的證據(jù)表明，高水平CD4+T、CD8+T、樹突狀細(xì)胞和B 細(xì)胞浸潤的LUAD 患者預(yù)后較好［18-19］。本研究經(jīng)TIMER 數(shù)據(jù)庫生存分析發(fā)現(xiàn)，B 細(xì)胞浸潤低的LUAD 患者預(yù)后較差。肺癌發(fā)展的所有階段均觀察到腫瘤浸潤性B細(xì)胞，其分泌抗體激活補(bǔ)體級聯(lián)和NK 細(xì)胞以殺死腫 瘤 細(xì) 胞［16，20］。M2 極 化 的 巨 噬 細(xì) 胞 在 體 內(nèi) 促 進(jìn)LUAD 細(xì)胞的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移［21］。因此，SHCBP1過表達(dá)可能抑制LUAD 中B 細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞浸潤，并最終加速LUAD進(jìn)展。SHCBP1在LUAD 患者中的高表達(dá)可能觸發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)，提示SHCBP1在LUAD的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。

腫瘤免疫逃逸使腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，導(dǎo)致其增殖和轉(zhuǎn)移［22］。免疫治療的療效不僅需要腫瘤微環(huán)境中有足夠的免疫細(xì)胞浸潤，還取決于免疫檢查點(diǎn)的充分表達(dá)［23］。有研究表明具有TP53 突變的非小細(xì)胞肺癌患者在接受免疫檢查點(diǎn)阻斷治療后有更好的預(yù)后，CD8+T細(xì)胞浸潤水平較高的患者更有可能從免疫治療中獲益，并且有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤PD-L1 表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著正相關(guān)［24-26］。本研究中SHCBP1 mRNA表達(dá)與TP53 突變和CD8+T 細(xì)胞浸潤顯著正相關(guān)。因此本研究評估了SHCBP1 mRNA 與免疫檢查點(diǎn)間的關(guān)系，結(jié)果表明SHCBP1 mRNA 高表達(dá)與LUAD中的PD-1、PD-L1和CTLA-4呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明SHCBP1可能通過增加免疫檢查點(diǎn)表達(dá)發(fā)揮其致癌作用，靶向SHCBP1 可能提高LUAD 免疫治療的療效。

綜上所述，本研究探討了SHCBP1 作為LUAD生物標(biāo)志物的潛力及其在腫瘤細(xì)胞浸潤中發(fā)揮的作用。但受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)限制本研究也存在一定的局限性，SHCBP1 mRNA 轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)的一致性仍有待進(jìn)一步明確，未來仍需應(yīng)用分子生物學(xué)方法通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。