TRIB3 激活Wnt/β-catenin 信號通路對喉癌TU686 細胞體外生長增殖及移植瘤小鼠外周免疫抑制分子表達的影響①

程忠強 蔣成義 王 偉 強化龍 詹曉東 袁潤生

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，蚌埠 233003）

Tribbles 假激酶3（Tribbles homolo 3，TRIB3）作為假性激酶，由于結構上缺乏ATP 結合位點及催化殘基，不具備激酶相關活性，但作為銜接蛋白或支架蛋白調節(jié)細胞有絲分裂，阻滯細胞周期，調控多種信號通路［1-2］。在多種惡性腫瘤中TRIB3 高表達可促進細胞的生長增殖，如在腦膠質瘤中TRIB3 可通過激活β-catenin 信號通路促進膠質瘤細胞增殖［3］；在結直腸癌中可通過TRIB3/β-catenin 信號通路促進細胞增殖，阻斷信號通路后可增強化療敏感性［4］。

在正常組織中，β-catenin 與軸蛋白、酪氨酸激酶1α 等形成破壞復合體，Wnt/β-catenin 信號通路處于抑制狀態(tài)［5］。在喉癌中，Wnt/β-catenin 信號通路處于激活狀態(tài)，β-catenin 等破壞復合體無法聚合，則聚合于細胞核或細胞質中，從而促進下游相關基因如Cyclin-D1 及C-myc 表達，發(fā)揮促進細胞增殖等作用，多種喉癌的治療措施均可以Wnt/β-catenin 為靶點抑制腫瘤生長［6］。但在治療過程中，免疫抑制是導致治療失敗的主要原因，腫瘤細胞分泌多種免疫抑制分子使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，故降低免疫抑制分子表達也是治療的有效手段之一［7］。在基因表達譜數據動態(tài)分析數據庫中發(fā)現TRIB3在頭頸部腫瘤中表達異常，如鼻咽癌中TRIB3表達明顯升高，并通過激活β-catenin 信號通路促進細胞的增殖及遷移［8］。但目前尚未在喉癌中證實其作用。為此本研究擬明確喉癌中TRIB3 的表達狀態(tài)，通過構建敲低TRIB3表達的體內、體外模型，研究TRIB3對喉癌的作用，并觀察其對外周免疫抑制分子表達的影響，以期成為喉癌治療的新靶標。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 實驗細胞系及組織 喉癌TU686 細胞及人永生化表皮細胞系HaCat購自上海生命科學研究院細胞資源中心。20 例喉癌患者的腫瘤組織及對應癌旁組織來自蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，所有組織標本于液氮中保存。本研究經蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫科批字［2023］第53號），所有相關患者均簽署知情同意書。

1.1.2 實驗動物 6周齡雄性BALB/c 裸鼠12只購自河南省醫(yī)學實驗動物中心［SCXK（豫）2021-0018］，飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院SPF級動物房中，室溫（22±2） ℃，自由進食飲水，12 h/12 h 明暗環(huán)境節(jié)律。動物實驗由蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫科批字［2023］第53號）。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清（批號：BC20220530）購自南京Bio Channel 公司；TRIB3 抗體（批號：ab75774）、Wnt抗體（批號：ab63934）、Cyclin-D1抗體（批號：ac853）、C-myc 抗體（批號：ab51156）、βcatenin 抗體（批號：ab0023）、p-β-catenin 抗體（批號：ab4030）、GAPDH 抗體（批號：ab181602）購自美國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（批號：23002492）購自武漢三鷹技術有限公司；TRIB3 siRNA 購自廣州銳博公司；CCK-8 試劑盒（批號：2022060721）購自上海圣爾生物有限公司；流式細胞學試劑盒（批號：E0015-1643）購自美國eBioscience 公司；Trizol 試劑（批號：RR420A）、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNase HPlus）（2×）（批 號：RR390A）、反轉錄試劑盒（5×Prime Script RT Master Mix）（批號：RR037A）購自日本TaKaRa 公司；TRIB3及GAPDH 引物購自上海生工生物；IL-4（批號：20210513）、IL-6（批號：20200823）、IL-10（批號：20210609）、TGF-β（批號：20220115）、前列腺素（prostaglandin E2，PGE2）（批號：20220309） ELISA試劑盒購自武漢基因美生物有限公司；TRIB3 低表達慢病毒包裝質粒購自上海吉凱化學技術有限公司。其余所用實驗試劑均購自國產相關試劑公司。

1.1.4 主要儀器 Western blot 電泳儀購自美國Bio-Rad公司；Western blot成像系統(tǒng)購自美國Alpha-Innotech 公司；熒光定量PCR 儀及恒溫培養(yǎng)箱購自賽默飛有限公司；流式細胞儀購自美國BD 公司；超凈工作臺購自美國Sigma 公司；倒置顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 體外實驗

1.2.1.1 細胞培養(yǎng)及轉染 TU686 及HaCat 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640中，置于37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞轉染實驗：將TU686 細胞均勻接種于6 孔板中，分為陰性對照組（NC組）及敲低TRIB3組（sh-TRIB3組），待細胞增至70%時棄去培養(yǎng)上清，PBS 清洗后各孔加入無血清1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；將250 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基與160 pmol 的siRNA 或NC-RNA 充分混勻至1.5 ml EP 管中；另取一只1.5 ml EP 管，將250 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基與5 μl Lipofectamine 2000混勻，室溫靜置5 min；再將上述兩個EP管中的內容混合，室溫靜置30 min。將混勻的液體加入上述6孔板內，6 h后PBS清洗，更換完全培養(yǎng)基。

1.2.1.2 Western blot 檢測蛋白表達 將喉癌組織、癌旁組織及經1.2.1.1 轉染后的細胞分別加入蛋白酶抑制劑和PMSF，離心取上清，加入上樣緩沖液，充分混勻后煮沸變性，-20 ℃冰箱冷凍。配制10%SDS-PAGE 凝膠，待膠凝之后放置于電泳液中，加入20 μl細胞總蛋白，設置電壓120 V分離80 min，隨后設置80 V 分離60 min，取出玻璃板，按照目標蛋白的分子量取膠，使用轉膜夾及轉膜液將膠上的蛋白轉至PVDF 膜，將其放置于5%BSA 溶液中脫色封閉，TBS 清洗10 min×3 次，脫脂牛奶封閉4 h，清洗后放入對應一抗中，4 ℃孵育過夜，次日取出后條帶搖床清洗，隨后二抗4 ℃孵育1 h，洗膜。將膜均勻涂抹AB（1∶1）顯影液，放入顯影系統(tǒng)，使用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.1.3 實時熒光定量PCR 利用Trizol 試劑提取喉癌、癌旁組織及經1.2.1.1 轉染后的細胞總RNA，將總RNA 反轉錄為cDNA。利用實時熒光定量PCR儀進行擴增，取2 μl cDNA為模板，配制25 μl Real-time PCR 反 應 體 系 進 行 擴 增：2×Super Real Premix 12.5 μl；正、反向引物（10 μmol/L）各0.75 μl；RNase-free ddH2O 9 μl。擴增條件為：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)。TRIB3-F：5'-GCTTTGTCTTCGCTGACCGTGA-3'，TRIB3-R：5'-CTGAGTATCTCAGGTCCCACGT-3'；內參GAPDH-F：5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，GAPDH-R：5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。

1.2.1.4 CCK-8 實驗檢測增殖能力 將1.2.1.1轉染處理的細胞消化后接種于96孔板，待細胞貼壁后分別于0 h、24 h、48 h 及72 h 在各孔中加入10 μl CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，將96 孔板置于酶標儀上測定450 nm處吸光度值。

1.2.1.5 細胞集落實驗 將1.2.1.1 轉染處理的細胞消化后，以10 000 個/孔接種于6 孔板，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，7 d后倒置顯微鏡觀察細胞集落形成情況并拍照。

1.2.1.6 細胞周期檢測 將1.2.1.1 轉染處理的細胞消化后收集至EP管中，PBS清洗后，1 500 r/min離心5 min，去除上清，每管加入2 ml 預冷的75%乙醇，振蕩混勻，置于-20 ℃冰箱固定過夜，1 500 r/min離心5 min 后去除上清，PBS 清洗重懸，加入5 μl 碘化丙啶及RNA 酶，室溫孵育30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.2 體內實驗

1.2.2.1 移植瘤小鼠模型構建 12只雄性BALB/c裸鼠適應性喂養(yǎng)后，隨機分為Control sgRNA 組和TRIB3 sgRNA 組。設計構建TRIB3 低表達（TRIB3+ShNC）及對照（Vector+shNC）的TU686細胞系，100 μl PBS懸浮后（3×106個細胞/皮下瘤）注入腋窩，期間觀察小鼠生存狀態(tài)，注射5 周后，眼球取血處死小鼠，去除瘤體，稱重并測量瘤體體積。

1.2.2.2 ELISA 檢測外周免疫抑制分子含量 將1.2.2.1 收集的血液離心取上清。按照試劑盒說明書檢測兩組血清中免疫抑制因子IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β、PGE2含量。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有數據應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用±s表示，兩組間比較釆用t檢驗，Pearson 分析比較蛋白表達的相關性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TU686 細胞及喉癌組織中TRIB3 表達 與正常細胞相比，喉癌TU686 細胞中高表達TRIB3（圖1A、B）；與癌旁組織相比，喉癌組織中TRIB3 蛋白及mRNA 表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，圖1C、D）。

圖1 TU686細胞及喉癌組織中TRIB3表達Fig.1 Expression of TRIB3 in TU686 cells and laryngeal carcinoma tissue

2.2 TU686 細胞中敲低TRIB3 后結果驗證 與正常細胞相比，喉癌TU686 細胞中高表達TRIB3。與NC 組 相 比，轉 染TRIB3 siRNA 后TU686 細 胞 中TRIB蛋白及RNA表達量明顯減少（P<0.01，圖2）。

圖2 TU686細胞中敲低TRIB3后結果驗證Fig.2 Verify the results after TRIB3 knockdown in TU686 cells

2.3 敲低TRIB3 對TU686 細胞生長增殖的影響CCK-8 實 驗 結 果 顯 示，與NC 組 相 比，sh-TRIB3 組TU686細胞增殖活力顯著降低（P<0.01，圖3A）。集落克隆實驗結果顯示，sh-TRIB3 組細胞的集落克隆能力顯著降低（P<0.01，圖3B）。細胞周期實驗結果表明，與NC 組相比，sh-TRIB3 組細胞S 期細胞數占比較低，生長被阻滯于G1/S期（圖3C）。

圖3 敲低TRIB3對TU686細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of TRIB3 knockdown on proliferation ability of TU686 cells

2.4 敲低TRIB3 后對Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白的影響及其相關性分析 與NC 組相比，sh-TRIB3 組TU686 細胞中Wnt、β-catenin 及其下游效應蛋白Cyclin-D1 及C-myc 表達明顯下降，p-βcatenin 表達明顯上升（P<0.05 或P<0.01，圖4A）。相關性研究顯示，TRIB3 表達與Wnt、β-catenin、p-βcatenin 及其下游效應蛋白Cyclin-D1 表達呈明顯相關性（P<0.05，圖4B）。

圖4 敲低TRIB3 對Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白的影響及其相關性分析Fig.4 Effects of TRIB3 knockdown on Wnt/β-catenin signaling pathway related proteins and correlation analysis

2.5 裸鼠移植瘤模型驗證敲低TRIB3 對腫瘤生長及生存期的影響 如圖5 所示，與Control sgRNA 組相比，體內敲低TRIB3 后瘤體生長速度減慢，注射5周后，腫瘤的體積及重量均明顯降低（P<0.05）。

2.6 裸鼠移植瘤模型檢測敲低TRIB3 對外周免疫抑制分子表達的影響 與Control sgRNA 組相比，敲低TRIB3 后小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β、PGE2含量均明顯降低（P<0.05，表1）。

表1 各組小鼠外周血免疫抑制分子蛋白水平（±s，n=6， pg/ml ）Tab.1 Levels of immunosuppressive molecular protein in peripheral blood of mice in each group （±s，n=6， pg/ml ）

表1 各組小鼠外周血免疫抑制分子蛋白水平（±s，n=6， pg/ml ）Tab.1 Levels of immunosuppressive molecular protein in peripheral blood of mice in each group （±s，n=6， pg/ml ）

Note：Compared with Control sgRNA group， 1）P<0.01.

PGE2 21.69±3.79 10.67±1.381）Groups Control sgRNA TRIB3 sgRNA IL-4 56.66±6.41 32.82±6.621）IL-6 52.31±7.00 32.43±2.961）IL-10 58.56±7.84 40.20±4.691）TGF-β 404.40±15.00 317.39±45.041）

3 討論

蛋白激酶在人體中的主要作用是催化磷酸基從ATP 轉移到其底物，500 多種人類激酶組中約有10%已被認為是假性激酶［9］。TRIB3是TRIB家族成員，由于缺乏與ATP 親和位點及激酶活性的保守催化單元，故并無激酶活性，因此也被認為是假性激酶的一種，但可能通過競爭相同的肽底物和控制其生物活性調節(jié)其他激酶［10］。TRIB3表達于人體各個器官，在骨髓、外周血白細胞和甲狀腺中均有極高的表達水平［11］。TRIB3 負責調節(jié)眾多生理功能，包括細胞的壓力反應、細胞的分化和增殖、脂質和葡萄糖的代謝、上皮細胞向間充質細胞的轉變［12］。在惡性腫瘤中，TRIB3 可通過激活經典的信號轉導通路，或作為折疊蛋白，結合靶蛋白的E3 連接酶影響靶蛋白泛素化，進而調控細胞生長［13］。研究顯示TRIB3 在各種惡性腫瘤中均表達升高，可能是腫瘤形成過程中的關鍵因素，目前在肺癌、結直腸癌和乳腺癌中研究較多，但結果不一。研究表明，在乳腺癌中TRIB3 可同時作為致癌因素及抗癌因素，如TRIB3 mRNA 高表達表明乳腺癌預后較差，而TRIB3 蛋白高表達則有利于預后［14-15］。但在其他腫瘤中尚未發(fā)現此種預示作用。

在頭頸部惡性腫瘤中，TRIB3 在鼻咽癌及口腔鱗狀細胞癌中表達異常升高，并分別激活β-catenin及AKT 信號通路促進細胞的增殖、遷移等［8，16］。喉癌作為常見的頭頸部腫瘤，臨床治療效果不佳，最終均會以復發(fā)或耐藥作為治療終點，因此在喉癌中尋找新的治療靶點可能是其治療的新思路之一［17］。本研究發(fā)現在喉癌細胞及腫瘤組織中存在TRIB3異常高表達，并可促進腫瘤細胞增殖，敲低TRIB3后細胞增殖被明顯抑制，腫瘤細胞被阻滯在G1/S 期，同時細胞集落生成能力降低。在體內實驗中也佐證了上述結果，敲低TRIB3 的移植瘤小鼠注射5 周后，瘤體大小、體積及重量均明顯降低，提示TRIB3可誘導腫瘤的生長增殖，通過靶向抑制TRIB3 可延緩瘤體生殖速度。Wnt/β-catenin信號通路的激活是腫瘤的發(fā)生機制之一，Wnt 及β-catenin 在多種腫瘤中表達升高，其中Wnt為胞外關鍵調控蛋白，β-catenin則在胞內發(fā)揮信號傳遞作用，影響下游功能蛋白Cyclin-D1 及C-myc 等的表達［18］。本研究結果顯示，TRIB3 促進Wnt/β-catenin 信號通路及下游蛋白如Cyclin-D1 及C-myc 等表達，而降低β-catenin 的磷酸化水平，敲低TRIB3 后則呈現相反的結果，提示TRIB3在喉癌中可激活Wnt/β-catenin 信號通路。相關性研究顯示，在正常及敲低TRIB3 細胞中TRIB3蛋白表達與Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達呈正相關，進一步證明TRIB3 在喉癌中通過激活Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用。

腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細胞可分泌多種免疫抑制分子，產生的免疫抑制可使體內的免疫細胞無法準確識別或殺傷腫瘤細胞，使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，腫瘤免疫檢查點抑制劑，如PD-1，即可通過恢復機體正常免疫功能達到抗腫瘤作用［19］。但由于腫瘤組織可分泌多種外周免疫抑制因子，尋找有效的降低免疫抑制因子的途徑也是抗腫瘤治療的思路之一。為此本實驗選取了5種常見的外周免疫因子，在移植瘤小鼠中探討TRIB3 與外周免疫抑制因子的關系。IL-4 高表達于多種腫瘤組織，參與炎癥反應的同時還可在腫瘤免疫中發(fā)揮作用，IL-4 可抑制Th1 細胞產生及γδT 細胞的活化與應答，在促進免疫抑制因子IL-10 生成的同時，自身向免疫功能較差的Vδ1T 細胞偏移，導致免疫抑制發(fā)生［20］。IL-6可抑制自然殺傷細胞及抗原呈遞細胞活性，阻礙免疫T 細胞功能，誘導Th2 細胞漂移，并與腫瘤的惡性程度相關，促進IL-10 及PGE2 合成，參與免疫逃逸，通過誘導血管生成等機制促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡［21］。IL-10 可通過抑制T 淋巴細胞的應答及活化、降低細胞黏附分子及協(xié)同刺激分子CD86表達、抑制抗原呈遞功能等引起腫瘤免疫逃逸環(huán)境［22］。除IL-10 的類似作用外，TGF-β 還可抑制Th1細胞因子的應答及細胞毒性T 淋巴細胞的分化裂解，抑制嗜中性粒細胞及NK 細胞功能，并誘導Th2細胞漂移，促進腫瘤免疫逃逸發(fā)生［23］。PGE2高表達于腫瘤組織中，通過抑制B、T 淋巴細胞增殖，抑制Th1 細胞因子的合成及NK 細胞功能，誘導并促進IL-10 產生及Th2 細胞因子合成，產生腫瘤免疫微環(huán)境，并使機體免疫功能發(fā)生障礙［24］。本研究表明體內 敲 除TRIB3 可 降 低IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β 及PGE2 表達，提示TRIB3 參與了腫瘤免疫反應，抑制TRIB3表達可逆轉腫瘤免疫微環(huán)境。

綜上所述，抑制TRIB3 表達可抑制喉癌細胞的生長增殖，此作用可能是通過激活Wnt/β-catenin 信號通路實現的，同時TRIB3 在體內可促進腫瘤免疫障礙生成。抑制TRIB3靶點的治療方式可為喉癌的防治提供新思路。