川續(xù)斷皂苷Ⅵ對M1/M2型巨噬細胞極化的調節(jié)作用及機制①

羅進芳 劉 明 楊 虹 錢海兵 （貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，貴陽 550025）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，基因和環(huán)境因素均會影響其發(fā)生發(fā)展［1］。RA 疾病發(fā)展過程中，多種因素會打破處于動態(tài)平衡的M1/M2 型巨噬細胞，引起數量和比例失衡，導致M1 型促炎巨噬細胞不斷增多，從而加劇炎癥反應［2-3］。

M1巨噬細胞主要分泌促炎細胞因子，如TNF-α引起關節(jié)損傷，抑制M1 型巨噬細胞極化可以改善關節(jié)炎［4］。M2 巨噬細胞釋放大量抗炎細胞因子促進組織重塑和修復，抑制RA 的進展［5］。因而，研究中醫(yī)藥調節(jié)巨噬細胞極化發(fā)揮抗炎作用治療RA 具有重要臨床指導意義和研究價值。

續(xù)斷，又名川續(xù)斷，是川續(xù)斷科植物川續(xù)斷（Dispsalus asper wall.ex.Henry）的干燥根，具有補肝腎、強筋骨等療效［6］。續(xù)斷常作為骨傷科用藥被用于骨折愈合、風濕痹痛等的治療［7］。研究表明，續(xù)斷總皂苷對膝骨關節(jié)炎模型大鼠具有明顯的保護作用［8］。川續(xù)斷皂苷Ⅵ是續(xù)斷的主要有效成分之一，研究表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可以抑制一氧化氮合酶（iNOS）和一氧化氮（NO）發(fā)揮其抗炎作用［9］。

但目前未見川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過調節(jié)巨噬細胞極化發(fā)揮其抗炎作用的研究報道。本研究以巨噬細胞RAW264.7 為實驗研究對象，探討川續(xù)斷皂苷Ⅵ對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或IL-4 誘導條件下RAW264.7 巨噬細胞向M1/M2 極化的調節(jié)作用和機制，為川續(xù)斷皂苷Ⅵ抗炎作用提供更多參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 RAW264.7 細胞株為小鼠來源巨噬細胞株，購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑 川續(xù)斷皂苷Ⅵ，分析標準品，HPLC≥98%，購于德斯特生物技術有限公司；胎牛血清、DMEM購于Gibco公司；LPS購于Sigma公司；IL-4購于Peprotech 公司；TNF-α 和IL-6 ELISA 檢測盒購于eBioscience 公司；RNA 提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購于北京索萊寶公司；RNA 逆轉錄試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix 均購于Roche 公司；精氨酸酶-1（Arginase-1，Arg-1）、iNOS、TNF-α、HO-1 及內參βactin 引物均由生工生物工程股份有限公司合成；iNOS一抗購于Cell Signaling Technology公司；β-actin一抗購于Santa Cruz BioTechnology 公司；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購于Absin；StarSignal 超敏化學發(fā)光檢測試劑盒購于北京索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7 細胞培養(yǎng) RAW264.7 細胞用含有10%胎牛血清、1 000 U/L 青霉素和鏈霉素的完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。RAW264.7細胞生長至90%左右融合狀態(tài)時進行傳代。常規(guī)傳代培養(yǎng)3 次后，取對數生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT 方法檢測川續(xù)斷皂苷Ⅵ對RAW264.7細胞增殖活性影響 巨噬細胞按照1.4×104個/孔接種到96 孔細胞培養(yǎng)板內，每孔添加100 μl細胞懸浮液，培養(yǎng)過夜后，棄上清液，加入含有1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的細胞培養(yǎng)液各100 μl，置于37 ℃培養(yǎng)箱內孵育培養(yǎng)18 h后，取出培養(yǎng)板，每孔分別加入10 μl MTT 溶液（5 g/L），37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后加100 μl 10%SDS-HCl 溶液。酶標儀測定570 nm（參比波長為650 nm）OD 值。計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組OD 值-空白對照組OD）/（對照組OD 值-空白對照組OD）×100%。

1.2.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ作用于LPS誘導的RAW264.7細胞 取對數生長期RAW264.7 細胞進行細胞計數后，調整細胞密度，按3×105個/ml 密度2 ml/孔接種于6 孔板，實驗分組設正常組、LPS 組、LPS+ASD（5 μmol/L）組、LPS+ASD（10 μmol/L）組、LPS+ASD（20 μmol/L）組，培養(yǎng)細胞生長至80% 融合狀態(tài)時，按照實驗分組給藥組加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ至終濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L，加藥1 h 之后，LPS 組與給藥組均加LPS 至終濃度為100 ng/ml，正常組加等體積的培養(yǎng)基，加入LPS 后繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后，分別收集培養(yǎng)基、細胞、細胞上清液于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ作用于IL-4 誘導的RAW264.7細胞 取對數生長期RAW264.7細胞計數后，調整細胞密度，按3×105個/ml 的密度，2 ml/孔接種于6 孔板，實驗分組設正常組、IL-4 組、IL-4+ASD（5 μmol/L）組、IL-4+ASD（10 μmol/L）組、IL-4+ASD（20 μmol/L）組。培養(yǎng)細胞生長至90%融合狀態(tài)時給藥組加入不同濃度的川續(xù)斷皂苷Ⅵ至終濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L，加藥干預1 h之后，IL-4 組與給藥組均加IL-4 至終濃度10 ng/ml，正常組加等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，收集細胞于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 檢測細胞上清中TNF-α、IL-6 和NO 分泌量 收集1.2.3 中細胞培養(yǎng)上清液，參照ELISA 檢測試劑盒說明書分別檢測細胞上清中TNF-α、IL-6含量。參照Griess 試劑盒說明書檢測細胞上清中NO的含量。

1.2.6 熒光定量PCR檢測TNF-α、IL-6、HO-1、Arg-1和SOCS2 基因表達 按照實驗分組收集細胞，按照提取RNA 試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA，將RNA 按照按逆轉錄試劑盒說明書操作步驟，各組取1 μg RNA逆轉錄成cDNA。熒光定量PCR實驗按照SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行，反應條件為：95 ℃、30 s（預變性），95 ℃、5 s（變性），60 ℃、30 s（退火），40 個循環(huán)，β-actin 為內參對照。反應體系包括：SYBR Green 染料10 μl、正反向引物各1 μl、PCR 專用的無菌水7 μl、cDNA 模板1 μl。采用2-ΔΔCt法分析各組樣本中TNF-α、IL-6、HO-1、Arg-1和SOCS2 mRNA相對表達水平（目的基因相對表達均進行歸一化處理）。熒光定量PCR 引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Fluorescence quantitative PCR primer sequences

1.2.7 Western blot 檢測iNOS 和p-p65 蛋白表達按照1.2.3 實驗分組，加不同濃度的川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理細胞1 h之后，按照實驗分組分別加入LPS共同孵育，加LPS 刺激細胞30 min，檢測p-p65 蛋白或18 h檢測iNOS 蛋白后，分別收集提取加藥處理后的細胞，按照RIPA 試劑說明書提取細胞總蛋白，BSA法進行蛋白定量后，按照50 μg/孔的蛋白上樣量經SDS-PAGE 電泳將蛋白分離轉至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉室溫孵育2 h，經TBST 洗滌3 次，分別加一抗，4 ℃孵育過夜，經TBST 洗滌3 次，每次5 min；室溫二抗（辣根過氧化物酶標記，稀釋比例為1∶2 000）孵育1～2 h，TBST 沖洗，ECL 顯影發(fā)光。以 Image 分析條帶的灰度值。β-actin 作為參照，用目的蛋白灰度值除以內參蛋白灰度值，并進行歸一化處理后，分析計算iNOS、p-p65蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數據用 GraphPad Prism7統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，數據用±s表示，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對RAW264.7 細胞活力的影響 不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ作用于RAW264.7 巨噬細胞后，MTT 結果顯示（圖1），1.25～20 μmol/L 的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對RAW264.7 巨噬細胞無明顯細胞毒性作用，40、80 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ明顯抑制RAW264.7 巨噬細胞增殖，說明高濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ對RAW264.7 巨噬細胞有明顯細胞毒性作用，選擇5、10、20 μmol/L安全濃度的川續(xù)斷皂苷Ⅵ用于后續(xù)實驗研究。

圖1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對RAW264.7巨噬細胞活力的影響Fig.1 Effect of Asperosaponin Ⅵ on cell viability of RAW264.7 cells

2.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對LPS 誘導下RAW264.7 細胞TNF-α、IL-6 基因和蛋白表達的影響 與正常對照組細胞比較，加LPS 刺激細胞6 h后明顯增加TNF-α和IL-6 基因表達水平，與LPS 組比較，加入5、10、20 μmol/L川續(xù)斷皂苷Ⅵ組均可不同程度抑制TNF-α和IL-6 基因表達，且隨著川續(xù)斷皂苷Ⅵ藥物濃度增加，對TNF-α 和IL-6 基因表達水平的抑制作用越明顯，其中10、20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組明顯抑制TNF-α和IL-6基因表達水平（P<0.01），見圖2A、B。與正常對照組比較，LPS 刺激RAW264.7 細胞18 h后明顯增加細胞上清中TNF-α和IL-6蛋白分泌量，與LPS組比較，加入5、10、20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組可不同程度抑制TNF-α 和IL-6 蛋白分泌量，且隨著川續(xù)斷皂苷Ⅵ藥物濃度增加，對TNF-α和IL-6的蛋白抑制作用越明顯（圖2C、D），10、20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組明顯抑制TNF-α 和IL-6 蛋白分泌（P<0.01）。

圖2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對LPS 誘導下RAW264.7 巨噬細胞TNF-α和IL-6蛋白和基因水平的影響Fig.2 Effect of Asperosaponin Ⅵ on TNF-α and IL-6 protein and gene levels in LPS stimulated RAW264.7 cells

2.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對LPS 誘導下RAW264.7 細胞iNOS和p-p65蛋白表達的影響 與正常對照組細胞比較，LPS 刺激細胞18 h 后明顯增加RAW264.7 細胞iNOS 蛋 白 表 達，與LPS 組 比 較，加 入5、10、20 μmol/L 濃度的川續(xù)斷皂苷Ⅵ均可不同程度抑制iNOS 蛋白表達水平，且隨著川續(xù)斷皂苷Ⅵ藥物濃度增加，對iNOS 蛋白的抑制作用越明顯（圖3A），10、20 μmol/L 的川續(xù)斷皂苷Ⅵ組明顯抑制LPS 誘導下iNOS蛋白表達（P<0.01）。

圖3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對LPS 誘導下RAW264.7 巨噬細胞iNOS和p-p65蛋白水平的影響Fig.3 Effect of Asperosaponin Ⅵ on iNOS and p-p65 protein in LPS stimulated RAW264.7 cells

與正常對照組細胞比較，加LPS 刺激細胞30 min后明顯增加RAW264.7細胞p-p65蛋白表達，與LPS組比較，提前1 h加入5、10、20 μmol/L 的川續(xù)斷皂苷Ⅵ可不同程度抑制p-p65 蛋白表達水平，且隨著川續(xù)斷皂苷Ⅵ藥物濃度增加，對p-p65 蛋白的抑制作用越明顯（圖3B），10、20 μmol/L 的川續(xù)斷皂苷Ⅵ抑制LPS誘導下p-p65蛋白表達（P<0.05）。

2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對LPS 誘導下RAW264.7 細胞HO-1基因表達和NO分泌的影響 與正常對照組細胞比較，LPS 刺激細胞6 h 后增加HO-1 基因表達水平，差異無統(tǒng)計學意義，與LPS 組比較，加入5、10、20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組均可不同程度增加HO-1基因表達，且隨著川續(xù)斷皂苷Ⅵ藥物濃度增加，對HO-1 基因表達水平的增加作用越明顯（圖4A），10、20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組明顯增加LPS 誘導下HO-1基因表達（P<0.01）。與正常對照組細胞比較，加LPS 刺激細胞18 h后明顯增加細胞上清中NO 分泌量（P<0.01），與LPS 組比較，加入5、10、20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組均可不同程度地抑制NO 釋放量，且隨著川續(xù)斷皂苷Ⅵ藥物濃度增加，對NO 的抑制作用越明顯（圖4B），10、20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組明顯抑制LPS誘導下NO的分泌量（P<0.01）。

圖4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對LPS 誘導下RAW264.7 巨噬細胞HO-1基因和NO水平的影響Fig.4 Effect of Asperosaponin Ⅵ on HO-1 gene and NO levels in LPS stimulated RAW264.7 cells

2.5 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對IL-4 誘導下RAW264.7 細胞Arg-1 和SOCS2 基因表達的影響 與正常對照組細胞比較，加IL-4 刺激細胞6 h 后明顯增加Arg-1 和SOCS2 基因表達，與IL-4 組比較，加入5、10、 20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組均可不同程度增加Arg-1（圖5A）和SOCS2（圖5B）基因表達，Arg-1 和SOCS2基因表達水平與川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度呈依賴性增長，20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組增加IL-4誘導下Arg-1的基因表達（P<0.05）。10、20 μmol/L 川續(xù)斷皂苷Ⅵ組明顯增加IL-4 誘導下SOCS2 的基因表達（P<0.01）。

圖5 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對IL-4 誘導下RAW264.7 巨噬細胞Arg-1和SOCS2基因水平的影響Fig.5 Effect of Asperosaponin Ⅵ on Arg-1 and SOCS2 gene levels in IL-4 stimulated RAW264.7 cells

3 討論

巨噬細胞是一類重要的免疫細胞，在體內外不同環(huán)境影響下可極化為不同表型從而參與免疫調控［10］。巨噬細胞極化是一個動態(tài)變化、可被逆轉的過程，其參與了眾多免疫炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［11］。

LPS 是革蘭陰性菌細胞壁主要成分之一，具有較強的免疫刺激能力［12］。LPS 可誘導巨噬細胞向M1 型分化，產生促炎癥細胞因子，IL-4 可以誘導巨噬細胞向M2型分化［13］。

川續(xù)斷皂苷Ⅵ是中藥川續(xù)斷的主要活性成分，具有保護神經、抗骨質疏松、抗細胞凋亡等藥理作用［14］，雖然川續(xù)斷皂苷Ⅵ在藥理作用方面應用前景廣泛，但在炎癥方面的報道卻不多。有研究表明，M1巨噬細胞促進炎癥反應，LPS可以通過激活NF-κB等信號通路，促進M1 型巨噬細胞標志物TNF-α 表達［15-17］。iNOS、TNF-α、IL-6是M1型巨噬細胞的促炎因子，被證實會增強炎癥反應［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)，以LPS 刺激小鼠RAW264.7 細胞可致其M1 型巨噬細胞標志分子TNF-α、IL-6 分泌量增多及iNOS基因和蛋白表達升高；川續(xù)斷皂苷Ⅵ能明顯抑制LPS 誘導下小鼠RAW264.7 細胞分泌TNF-α 和IL-6，同時抑制iNOS 和TNF-α 基因表達水平。M1 型巨噬細胞產生大量NO，川續(xù)斷皂苷Ⅵ能顯著抑制M1 型巨噬細胞iNOS 蛋白表達，從而進一步下調NO 產生。以上研究結果表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ可以通過抑制LPS 誘導下小鼠RAW264.7 細胞的M1型極化發(fā)揮其抗炎作用。機制研究發(fā)現(xiàn)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ能抑制NF-κB 通路中p-p65 蛋白磷酸化水平，說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能抑制NF-κB 信號通路發(fā)揮其對M1 型巨噬細胞的抑制作用，從而發(fā)揮其抗炎作用。

核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路的激活可以抑制炎癥反應，Nrf2 通路可以通過與各種炎癥相關基因的近端調控區(qū)結合，直接抑制M1 型巨噬細胞誘導表達的炎癥基因［19-20］。激活Nrf2 信號通路可以抑制M1 巨噬細胞極化的同時促進M2 型巨噬細胞極化［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ能增加LPS 誘導狀態(tài)下細胞中Nrf2 通路下游的血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）基因水平，說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ很可能通過激活Nrf2 下游HO-1 基因表達發(fā)揮其對M1 巨噬細胞極化的抑制作用。

此外，Arg-1是M2型巨噬細胞的標志性分子［22］，本研究以IL-4 刺激小鼠RAW264.7 細胞致其M2 型巨噬細胞標志分子Arg-1 基因表達升高；在IL-4 誘導的M2 型細胞模型下，川續(xù)斷皂苷Ⅵ能增加Arg-1基因表達。提示川續(xù)斷皂苷Ⅵ能促進IL-4 誘導下小鼠RAW264.7細胞向M2型極化。M2型巨噬細胞參與組織修復，有研究表明細胞因子信號轉導抑制蛋 白-2（suppressor of cytokine signaling protein-2，SOCS2）缺失的巨噬細胞向M1 極化［23］。SOCS2 是調節(jié)M2 極化的關鍵轉錄因子，可以促進巨噬細胞向M2 極化［24］。本研究發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷皂苷Ⅵ能促進IL-4誘導下小鼠RAW264.7 細胞高表達SOCS2 基因，提示川續(xù)斷皂苷Ⅵ可能通過調節(jié)SOCS2 信號通路促進RAW264.7細胞向M2型極化。

綜上所述，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可以抑制RAW264.7巨噬細胞向M1 型極化，同時促進其向M2 型極化。川續(xù)斷皂苷Ⅵ可通過以上作用來調節(jié)M1/M2 型巨噬細胞極化發(fā)揮其抗炎免疫調節(jié)作用，但是川續(xù)斷皂苷Ⅵ對M1/M2 型巨噬細胞極化的調節(jié)作用機制仍有待后續(xù)深入研究。