原發(fā)免疫性血小板減少癥關(guān)鍵基因與通路的篩選及中藥研究①

烏日圖那順 布仁巴圖 （內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，通遼028000）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性自身免疫性出血疾病，臨床上多表現(xiàn)皮膚、黏膜和內(nèi)臟出血等癥狀，主要病理特征為外周血小板減少、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)正?；蛟龆嗷虬橛谐墒煺系K［1-3］。導(dǎo)致血小板減少的原因有很多，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為體液免疫異常導(dǎo)致B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗血小板自身抗體，引起血小板損傷，是血小板減少的主要原因［4］。也有學(xué)者認(rèn)為ITP 患者血小板減少與血小板反應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞具有促進(jìn)抗血小板自身抗體應(yīng)答的活性，并參與ITP患者致病性抗血小板自身抗體產(chǎn)生有關(guān)［5］。ITP 還與某些基因的異常表達(dá)有關(guān)，表明存在更深層次的發(fā)病機(jī)制，有研究表明ITP 患兒Treg 細(xì)胞糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）表達(dá)下調(diào)，治療改善后表達(dá)恢復(fù)正常［6］。但具體的致病機(jī)制尚不完全清楚。目前，ITP 的治療集中于使用類固醇、免疫球蛋白、免疫抑制劑和脾切除術(shù)預(yù)防血小板破壞。然而，這些治療方法伴有較大的副作用，如感染和出血［7］。中醫(yī)藥治療ITP具有獨(dú)特的優(yōu)勢，尚未發(fā)現(xiàn)顯著的不良反應(yīng)，中藥本身歷史悠久，臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)豐富，是治療ITP 的優(yōu)先推薦用藥，如血寶丸（由胡黃連、梔子、西紅花、天然牛黃等14味藥材配伍而成，具有清熱解毒、涼血止血的功效，于2019年被內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為院內(nèi)制劑，編號：內(nèi)藥制字M180600017）。有學(xué)者采用數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)補(bǔ)虛藥、止血藥、清熱藥對ITP 具有良好的療效［8］。但具體哪些中藥通過怎樣的生物學(xué)途徑發(fā)揮治療作用還不是特別清楚。本研究擬通過生物信息學(xué)方法對GEO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的原始數(shù)據(jù)芯片進(jìn)行miRNA 差異性分析，挖掘差異性表達(dá)顯著的miRNA，并預(yù)測其潛在靶基因與信號通路，通過關(guān)鍵基因預(yù)測具有治療ITP 作用的潛在中藥，旨在揭示其可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的獲得 以primary immune thrombocytopenia 為關(guān)鍵詞，設(shè)置種屬為homo sapiens，在GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm）中進(jìn)行檢索，獲得GSE80401 基因表達(dá)譜，共包含16 例樣品基因芯片數(shù)據(jù)，其中病例組10 例，對照組6 例。該片段平臺為GPL18402（Agilent-046064 Unrestricted_Human_miRNA_V19.0_Microarray）。通過R 語言“Limmar”包比較對照組與ITP 組的差異miRNA，以調(diào)整P<0.05 及|logFC|≥1 為篩選差異miRNA 的標(biāo)準(zhǔn)，其中l(wèi)ogFC≥1 代表表達(dá)上調(diào)，logFC≤-1 代表表達(dá)下調(diào)。使用pheatmap R 包對差異miRNA 進(jìn)行熱圖繪制。在熱圖中，紅色代表miRNA 在該樣品中高表達(dá)，藍(lán)色代表miRNA 在該樣品中低表達(dá)。使用ggplot2 R包對差異miRNA 進(jìn)行火山圖繪制。在火山圖中，紅色代表上調(diào)miRNA，綠色代表下調(diào)miRNA。

1.2 ITP 靶點(diǎn)挖掘 GeneCards （htttp：//www.genecards.org）是一個能提供基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄、遺傳和功能上所有已知預(yù)測的人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫。以primary immune thrombocytopenia 或ITP 為關(guān)鍵詞，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫查詢篩選，獲得ITP 的相關(guān)治療靶點(diǎn)。

1.3 miRNA 靶基因預(yù)測 通過miRTarBase（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）、miRDB（http：//mirdb.orhttp：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/g）、TargetScan human 8.0（http：//www.Targetscan.org）3 個靶基因數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測差異miRNA，對三者的預(yù)測結(jié)果繪制韋恩圖，得到交集基因。將上述基因與1.2 中獲取的ITP 基因交叉映射，得到映射靶基因。

1.4 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與Hub 基因的獲取 將映射靶基因分別通過String 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）、Cytoscape軟件的CytoHubba 插件、MCODE 插件進(jìn)行PPI 分析（篩選標(biāo)準(zhǔn)：combined score>0.4）、網(wǎng)絡(luò)分析（Cyto-Hubba 根據(jù)nodes 在網(wǎng)絡(luò)中的屬性進(jìn)行排名，包含12 種拓?fù)浞治龇椒?，具有高degree 的蛋白更傾向于關(guān)鍵蛋白，以degree 對節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排名）、模塊分析等方式綜合篩選（Hub gene）基因，選擇物種為homo sapiens。

1.5 基因本體論分析及KEGG 通路富集分析 對核心基因進(jìn)行注釋，通過DAVID6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）和OmicsBean（http：//www.omicsbean.cn/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能富集分析（GO 基因本體論）和KEGG 通路富集分析，GO 分析包含3 個方面：細(xì)胞組分（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學(xué)過程（biological process，BP）。

1.6 靶點(diǎn)對接及中藥預(yù)測 將篩選出的核心基因與醫(yī)學(xué)本體信息檢索數(shù)據(jù)庫Coremine Medical（http：//www.coremine.com/）相互映射，篩選出核心基因相關(guān)治療中藥，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA 基于GSE80401 的基因片段原始數(shù)據(jù)，以調(diào)整P<0.05 及|logFC|≥1 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到72個差異表達(dá)miRNA，上調(diào)miRNA 55個，下調(diào)miRNA有17個，見圖1、圖2。

圖1 ITP患者與健康對照差異miRNA火山圖Fig.1 Volcano plots of differential expressed miRNA between ITP patients and healthy controls

圖2 差異miRNA熱圖分析Fig.2 Differential miRNA heat map analysis

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與Hub 基因獲取 在Genecards數(shù)據(jù)庫通過分?jǐn)?shù)>1 標(biāo)準(zhǔn)篩選，合并2 個關(guān)鍵詞搜索的基因，共3 936 個靶點(diǎn)。使用miRDB、miRTar-Base、TargetScan 3個數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測差異miRNA的靶基因，取交集，共2 454 個靶基因。其中上調(diào)、下調(diào)靶基因各1 015 個，將上調(diào)和下調(diào)靶基因分別和Genecards 的ITP 靶點(diǎn)取交集，得到上調(diào)的映射靶基因235 個，下調(diào)的映射靶基因233 個。差異基因經(jīng)去重后共422個。

將上調(diào)和下調(diào)靶基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 分析，使用Cytoscape 軟件CytoHubba 對其 進(jìn)一步分析，篩選關(guān)鍵基因，結(jié)果顯示，上調(diào)基因Cyto-Hubba 分析后依據(jù)degree 排名前15 的關(guān)鍵基因?yàn)門P53、ACTB、KRAS、CCND1、HIF1A、CREB1、MAPK1、PIK3R1、GRB2、CD44、MAPK8、ACTG1、CDK2、CDKN1A和BCL2L1，使用Cytoscape 軟件的MCODE模塊對其進(jìn)行分析后得到7 個重要模塊；第1 個模塊 主 要 包 括CD44、TCHP、CDK2、AURKA、SP1、YAP1、CREB1、ETS1、NR3C1、CDKN1A、MAPK1、LYN、BCL2L1、PIK3R1、MAPK8、MET、GRB2、CDKN1B、XIAP、CCND2、HNF4A、CCND3、CCND1共23 個基因。該模塊主要與人T 細(xì)胞白血病病毒1 感染、PI3K-Akt 信號通路和FoXO 信號通路最相關(guān)。上調(diào)基因中CytoHubba 按degree 排名前15 和MCODE 第1 個模塊得到的基因取交集，共得到10個基因：BCL2L1、CCND1、CD44、CDKN1A、CREB1、GRB2、MAPK1、MAPK8、PIK3R1和CDK2。

下調(diào)基因依據(jù)degree 排名前15 的關(guān)鍵基因?yàn)镃TNNB1、GAPDH、PTEN、STAT3、VEGFA、MTOR、SMAD4、FoXO3、HSPA8、IGF1、FGF2、CAV1、SMAD2、TLR4和MET，MCODE 分析后得到4 個重要模塊，第1 個 模 塊 主 要 包 括TGFBR2、JAG1、E2F1、IGF1、SMAD2、BMP2、TLR4、SKP2、RB1、SMAD4、CYCS、CAV1、CDC25A、FGF2、NFE2L2、APP、IRS1、TGFβ2、GSK3β、VEGFA、MMP2和PPARA共22個基因。該模塊主要與對缺氧的反應(yīng)和傷口愈合生理學(xué)過程關(guān)系密切，和細(xì)胞周期通路最相關(guān)。下調(diào)基因中Cyto-Hubba按degree排名前15和MCODE第1個模塊下的得到的基因取交集，共得到7 個基因：CAV1、FGF2、IGF1、SMAD2、SMAD4、TLR4和VEGFA。

2.3 核心基因GO分析和KEGG富集分析 將17個核心基因通過OmicsBean 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BP 分析，發(fā)現(xiàn)排名前10 的BP 是磷酸化修飾（protein phosphorylation）、細(xì)胞對有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)（cellular response to organic substance）、有機(jī)物反應(yīng)（Respense to organic substance）、細(xì)胞因子刺激（cellular response to cytokine stimulus）、傷口愈合（wound healing）、化學(xué)刺激（cellular response to chemical stimulus）、細(xì)胞因子（response to cytokine）、氮化合物（response to nitrogen compound）、對細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)（cellular response to growth factor stimulus）和非生物刺激（response to abiotic stimulus）（圖3）。17 個核心基因可能參與細(xì)胞內(nèi)囊泡（intracellular vesicle）、細(xì)胞質(zhì)（cytosol）、細(xì)胞質(zhì)小泡（cytoplasmic vesicle）、細(xì)胞連接（cell junction）、激活素反應(yīng)因子復(fù)合物（activin responsive factor complex）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物（cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex）、內(nèi)膜系統(tǒng)（endomembrane system）、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器部分（intracellular organelle part）、細(xì)胞器部分（organelle part）和胞質(zhì)部分（cytoplasmic part）組成（圖4）。17 個核心基因主要涉及的MF 排名前10 的為高分子復(fù)合物結(jié)合（macromolecular complex binding）、蛋白結(jié)合（protein binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、蛋白復(fù)合體結(jié)合（protein complex binding）、分子功能調(diào)節(jié)器（molecular function regulator）、相同蛋白質(zhì)結(jié)合（identical protein binding）、蛋白質(zhì)異二聚活性（protein heterodimerization activity）、蛋白激酶結(jié)合（protein kinase binding）和激酶結(jié)合（kinase binding）（圖5）。17 個核心基因主要涉及的通路排名前10 的為癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、FoXO 信號通路（FoXO signaling pathway）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人T 細(xì)胞白血病病毒1 感染（Human T-cell leukemia virus 1 infection）、內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、黏著斑（focal adhesion）、松弛素信號通路（relaxin signaling pathway）、慢性髓系白血?。╟hronic myeloid leukemia）、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路（signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）（圖6）。將上述BP、通路和蛋白構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氮化合物、磷酸化修飾、細(xì)胞因子和化學(xué)刺激處于網(wǎng)絡(luò)核心位置，涉及蛋白主要包括MAPK1、MAPK8和CDKN1A。

圖3 ITP患者與健康對照差異基因的BP分析Fig.3 BP analysis of differential genes between ITP patients and healthy controls

圖4 ITP患者與健康對照差異基因的CC分析Fig.4 CC analysis of differential genes between ITP patients and healthy controls

圖5 ITP患者與健康對照差異基因的MF分析Fig.5 MF analysis of differential genes between ITP patients and healthy controlsl

圖6 ITP患者與健康對照差異基因-通路-BP網(wǎng)絡(luò)分析Fig.6 Differential gene-pathway-BP network analysis of ITP patients and healthy controls

2.4 核心靶點(diǎn)對接及中藥預(yù)測 將17個基因映射到Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫，篩選治療ITP 的潛在中藥，結(jié)果顯示TLR4映射的中藥藥味最多，其次為CCND1和VEGFA。在眾多中藥中，人參同時(shí)作用于17個靶點(diǎn)，赤芍、當(dāng)歸和蜂毒同時(shí)作用于11個靶點(diǎn)，眼鏡蛇和補(bǔ)骨脂同時(shí)作用于9 個和8 個靶點(diǎn)，地黃和水牛角同時(shí)作用于7 個靶點(diǎn)，火麻仁同時(shí)作用于4 個靶點(diǎn)，菟絲子同時(shí)作用于3 個靶點(diǎn)，五靈脂同時(shí)作用于2 個靶點(diǎn)。提示上述藥物具有多靶點(diǎn)防治ITP的潛能，見表1、表2。

表1 基于ITP關(guān)鍵靶點(diǎn)的中藥預(yù)測結(jié)果Tab.1 Prediction results of traditional Chinese medicine based on ITP key targets

表2 ITP關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)中藥頻數(shù)統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistical frequency of traditional Chinese medicine related to key targets of ITP

3 討論

本研究通過提取GSE80401 的基因片段數(shù)據(jù)，研究對象為ITP 患者和健康對照的外周血。運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析，最終獲得17 個治療ITP 的關(guān)鍵基因，通過DAVID 6.8 功能注釋聚類分析獲得富集分?jǐn)?shù)最高的為4.14，包括蛋白聚糖、FoXO 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、人T 細(xì)胞白血病病毒1 感染等，富集分析結(jié)果表明排名最前的BP是細(xì)胞遷移的正 向 調(diào) 節(jié)，涉 及 的 蛋 白 有TLR4、GRB2、FGF2、CAV1、CDKN1A、IGF1、MAPK1、VEGFA和PI3KR1。

Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLPs）是在免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的受體蛋白，通過識別病原微生物、偶聯(lián)信號傳導(dǎo)途徑，啟動天然免疫和調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答，并在天然免疫和獲得性免疫中起橋梁作用［9］。本研究中has-miR-21-5p 表達(dá)下調(diào)，推測對應(yīng)的TLR4 也表達(dá)下調(diào)，表明其病毒清除能力和免疫應(yīng)答能力下降，和馬利敏等［10］報(bào)道的TLR4 在慢性ITP患兒中表達(dá)下降的結(jié)果相一致。

生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2，GRB2）是與活化的表皮生長因子受體EGFR 相關(guān)的銜接蛋白，GRB2在各種受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑中通過募集輔助蛋白發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用［11］。研究報(bào)道，GRB2 在巨噬細(xì)胞的極化、吞噬功能、增殖和遷移等方面發(fā)揮重要作用，與人類巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）密切相關(guān)［12］。而ITP 發(fā)病機(jī)制之一就是血小板模糖蛋白特異性抗體介導(dǎo)的單核-巨噬細(xì)胞吞噬破壞血小板過多而引發(fā)［13］。本研究中has-miR-5196-5p 表達(dá)上調(diào)，推測對應(yīng)的GRB2 也表達(dá)上調(diào)，推測ITP 患者GRB2 高表達(dá)通過某些細(xì)胞因子刺激酪氨酸磷酸化參與信號通路的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)病毒的復(fù)制和擴(kuò)散。成纖維細(xì)胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）是一種旁分泌生長因子，正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)GF2以膜結(jié)合形式存在于基底膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)中，在傷口愈合過程中，F(xiàn)GF2 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)血管生成［14］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2與IL-17相互作用激活ERK1/2 通路，誘導(dǎo)炎癥因子和趨化因子的高表達(dá)，促進(jìn)了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫反應(yīng)過程［15］。本研究中hsa-miR-144-3p 表達(dá)下調(diào)，相應(yīng)的FGF2表達(dá)下調(diào)，推測ITP 患者中血管生成和修復(fù)存在異常。小窩蛋白（Caveolin-1，CAV1）是平滑肌細(xì)胞（SMCs）中主要的CAV1 同種型，CAV1 缺乏導(dǎo)致SMCs中CAV1的丟失。CAV1可負(fù)向調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如涉及TGF-β 受體1、一氧化氮合酶、蛋白激酶A、ERK1/2 和PI3K-AKT 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或增強(qiáng)下游效應(yīng)蛋白如IR、雌激素受體、蛋白質(zhì)脂肪酶C 和蛋白質(zhì)脂肪酶D［16-18］。本研究中，hsa-miR-106b-5p 表達(dá)下調(diào)，對應(yīng)CAV1 表達(dá)下調(diào)，TGF-β 和NOS 等可能被激活，從而抑制自身反應(yīng)性T 細(xì)胞和輔助T細(xì)胞的活化，促進(jìn)ITP的發(fā)展。研究表明，ITP患者的TGF-β1 較健康組明顯升高，與本研究的結(jié)果相吻合［19］。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（Cyclin-dependent kinase inhibitor 1，CDKN1A），具有最廣泛細(xì)胞周期依賴性激酶抑制活性，可通過調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)展，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)［20］。CDKNA1A是p53基因最重要的下游基因之一，是DNA 損傷后p53調(diào)控的細(xì)胞周期阻滯的主要調(diào)控元件。當(dāng)ITP 患者細(xì)胞受到各種損傷后，p53 基因作為轉(zhuǎn)錄因子啟動CNKN1A表達(dá)，CDKN1A表達(dá)上調(diào)，繼而使細(xì)胞周期阻滯在G1期，為細(xì)胞在進(jìn)入S 期前進(jìn)行DNA 損傷修復(fù)贏得時(shí)間［21］。胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor 1，IGF1）是一類結(jié)構(gòu)上類似胰島素原的多肽，在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，在細(xì)胞代謝、增殖、分化和凋亡中起作用［22］。體內(nèi)幾乎所有免疫細(xì)胞均存在IGF-1受體，對IGF-1的刺激產(chǎn)生反應(yīng)［23］。研究表明，血清IGF1在血小板升高患者中有明顯增高趨勢，本研究中，hsa-miR-4649-3p 表達(dá)下調(diào)，ITP 患者的血小板減少，IGF1 的表達(dá)下調(diào)，與之前的研究結(jié)果相吻合［24］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一種能被不同的細(xì)胞外刺激，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，MAPK1是MAP 激酶家族的成員之一，又稱細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK），是多種生化信號的整合點(diǎn)，參與多種細(xì)胞過程，如增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育。磷酸化后，可轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，使核靶點(diǎn)磷酸化，這種蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子獨(dú)立于其激酶活性［25］。本研究中，MAPK1表達(dá)上調(diào)，可能使ERK1、ERK2 級聯(lián)信號通路激活，加快ITP 患者細(xì)胞的生長和分化。血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用［26-27］。研究表明，ITP 患者血小板減少的原因可能和血管完整性受損和血管壁修復(fù)異常有關(guān)。本研究中hsa-miR-106b-5p 表達(dá)下調(diào)，相應(yīng)的VEGFA 表達(dá)下調(diào)，提示ITP 患者血管內(nèi)皮細(xì)胞存在損傷。和其他研究結(jié)果相吻合［28］。磷脂酰肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基alpha（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit alpha，PI3KR1），是PI3K 的 調(diào) 節(jié) 亞 基，PI3KR1 可 通 過PIK3CA 催化亞基相互作用維持PI3K 的低活性狀態(tài)。PI3K 屬于酯類的激酶，能磷酸化與膜相關(guān)的磷脂酸肌醇家族，在細(xì)胞的有絲分裂發(fā)生、細(xì)胞存活、分化和激活、細(xì)胞骨架的構(gòu)型與重塑以及囊胞的運(yùn)輸發(fā)揮著重要的作用［29］。本研究中PI3KR1 表達(dá)上調(diào)，可能使酪氨酸激酶激活，介導(dǎo)和協(xié)助NF-κB 核轉(zhuǎn)錄，造成炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的堆積，加速ITP的進(jìn)程［30］。

IPT 的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的病因是產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞成熟障礙所致，與巨核細(xì)胞分化周期密切相關(guān)。因此細(xì)胞周期相關(guān)機(jī)制的研究是ITP 的研究重點(diǎn)，除上述蛋白以外，與細(xì)胞周期通路相關(guān)的蛋白還包括SMAD2、SMAD4、CCND1、CDK2 和CDKN1A 5個蛋白，也在ITP患者和健康對照組中存在表達(dá)差異，例如：周期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）是必需的脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于磷酸受體c末端的堿性氨基酸。CDK2是CDK 酶家族的一員，是細(xì)胞G1/S 期轉(zhuǎn)換過程中的重要調(diào)控因子［31］。本研究中hsa-miR-765表達(dá)上調(diào)，對應(yīng)的CDK2 也相應(yīng)表達(dá)上調(diào)，推測CDK2 可能和cyclin A 結(jié)合并激活復(fù)合物，維持G1后期pRb 的磷酸化，保證細(xì)胞順利通過G1進(jìn)入S期［32］。

SMAD 蛋白是指參與TGF-β 細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的信號蛋白，它是TGF-β 受體作用的直接底物，是將配體與受體作用的信號由胞漿傳導(dǎo)至細(xì)胞核的中介分子。SMAD2 蛋白是受體調(diào)節(jié)型的SMAD 蛋白，是TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的蛋白，TGF-β 誘導(dǎo)SMAD2 的核轉(zhuǎn)位，與相應(yīng)的靶基因相結(jié)合，其反過來調(diào)節(jié)TGF-β 應(yīng)答基因表達(dá)［33］。而SMAD4 是共同調(diào)節(jié)型SMAD 蛋白，具有穩(wěn)定SMAD 低聚體的結(jié)構(gòu)，使SMAD 復(fù)合物保持有效的轉(zhuǎn)錄活性。SMAD4 是TGF-β 信號通路的核心轉(zhuǎn)導(dǎo)，只有在SMAD4 存在的情況下，TGF-β 信號才能轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中調(diào)控轉(zhuǎn)錄［34］。在 本 研 究 中，hsa-miR-1228-3p 和hsa-miR-106b-5p 表達(dá)下調(diào)，對應(yīng)的SMAD2 和SMAD4 下調(diào)，推測ITP 患者中存在代償效應(yīng)，通過降低SMAD2 和SMAD4 表達(dá)，影響TGF-β 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到延緩ITP進(jìn)程的作用［35］。

基于關(guān)鍵基因預(yù)測得到的中藥可能具有防治ITP 的潛在功效。結(jié)合頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，基于功能分類的靶點(diǎn)-中藥網(wǎng)絡(luò)關(guān)系、藥物歸經(jīng)及臨床應(yīng)用的實(shí)際情況，首先對結(jié)果中的148 頻次共計(jì)12 味中藥進(jìn)行分類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所預(yù)測中藥主要分為以下3類：①用于瘀血內(nèi)阻，久病不愈，皮膚青紫斑點(diǎn)，胸悶脅痛。治療以理氣活血、化瘀止血通絡(luò)為主，對應(yīng)的中藥有當(dāng)歸、赤芍、五靈脂、蜂毒和眼鏡蛇；②用于血熱妄行，紫癜色鮮紅而密集的，治療以涼血化斑為主，對應(yīng)的中藥有生地黃、水牛角和金雞納皮；③用于氣不攝血，紫癜色淡紅而稀疏，時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，伴有體倦乏力、神疲懶言等，治療以補(bǔ)脾益肺、溫腎助陽為主，對應(yīng)中藥有人參、補(bǔ)骨脂、菟絲子和火麻仁。

中醫(yī)認(rèn)為ITP 的內(nèi)因是由于疲勞過度、情志不暢、飲食不節(jié)制等損傷心、肝、脾和腎，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)或耗氣傷陰而出血；外內(nèi)是由于各種因素?fù)p傷脈絡(luò)而導(dǎo)致出血。主要的病理因素包括火、虛和瘀3 種，臨床上主要分為熱盛破血證、氣不攝血證、陰虛火旺證、瘀血內(nèi)阻證4 個證型［36］。上述預(yù)測的中藥正好對應(yīng)其中3 個證型，表明預(yù)測的結(jié)果較為準(zhǔn)確。上述中藥大部分也經(jīng)常用于臨床治療ITP，且效果顯著。如疏風(fēng)涼血補(bǔ)腎方其中包括生地黃、水牛角、赤芍、補(bǔ)骨脂4 味中藥［37］；益氣養(yǎng)血方包括生地黃、當(dāng)歸、菟絲子3味中藥用來治療難治性免疫血小板減少癥［38］；益氣攝血方包括人參和當(dāng)歸2 味藥，在臨床上主要用于治療氣不攝血型ITP，療效確切［39］。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，本研究結(jié)果中的人參、赤芍、當(dāng)歸、生地黃等均通過多靶點(diǎn)發(fā)揮治療ITP 的作用。如人參通過調(diào)節(jié)CREB1、MAPK1、PIK3R1、GRB2、CD44、MAPK8、TLR4、CDK2、CDKN1A、VEGFA、SMAD4、FGF2、IGF1 CAV1、SMAD2、BCL2L1、CCND1等17 個靶點(diǎn)發(fā)揮防治ITP 的作用。具體哪些成分作用于上述靶點(diǎn)是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

本文的前期研究“糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7的炎癥免疫和細(xì)胞活性試驗(yàn)”表明，治療ITP 的潛在中藥地黃的有效成分之一桃葉珊瑚苷協(xié)同水飛薊賓對MIF基因的高表達(dá)和巨噬細(xì)胞有激活活性作用。從而激活巨噬細(xì)胞對引發(fā)ITP 抗原的吞噬，達(dá)到治療的作用。綜上所述，本研究通過生信分析初步預(yù)測ITP 致病的關(guān)鍵基因，篩選了具有防治作用的中藥，并揭示作用的潛在靶點(diǎn)及BP，相關(guān)結(jié)果有待后續(xù)通過實(shí)驗(yàn)及臨床研究加以驗(yàn)證，以期為相關(guān)中藥新藥開發(fā)提供依據(jù)。