GPNMB 通過(guò)PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化減輕缺血性腦卒中后神經(jīng)損傷的機(jī)制研究①

劉 夢(mèng) 朱洋洋 方敬獻(xiàn) （南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，南陽(yáng) 473010）

腦卒中是臨床常見(jiàn)的腦血管疾病，其中缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）占80%，具有高致殘率與致死率［1-2］。因此迫切需要能有效減輕卒中致殘的辦法。

小膠質(zhì)細(xì)胞是駐留在大腦中的免疫細(xì)胞，能分泌神經(jīng)元存活所需的生長(zhǎng)因子，并介導(dǎo)了CIS 后腦損傷或損傷修復(fù)。既往研究指出小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化具有神經(jīng)保護(hù)作用，因此將小膠質(zhì)細(xì)胞由親炎的M1表型轉(zhuǎn)換至抗炎的M2表型可能成為CIS有效的治療策略［3-6］。

糖蛋白非轉(zhuǎn)移性黑色素蛋白B（glycoprotein non-metastatic melanin B， GPNMB）是一種跨膜糖蛋白，通過(guò)識(shí)別細(xì)胞外信號(hào)可在一定程度上發(fā)揮免疫抑制作用，最近GPNMB 被報(bào)道在缺血性動(dòng)物模型中表達(dá)明顯增加，并表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用［7-9］。ONO等［10］研究指出GPNMB 可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。而WANG 等［11］研究中指出PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活具有誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M2 表型、減輕炎癥與保護(hù)神經(jīng)的作用。

本研究分別使用大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型與體外缺氧缺糖（oxygen and glucose deprivation，OGD）條件培養(yǎng)細(xì)胞作為CIS 體內(nèi)外模型，采用腺病毒相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）定點(diǎn)注射改變腦組織內(nèi)Gpnmb表達(dá)，并通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與PI3K 抑制劑LY294002 干預(yù)細(xì)胞，檢測(cè)GPNMB、PI3K/Akt 通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化與CIS 神經(jīng)損傷的影響及分子間的調(diào)控關(guān)系，旨在明確CIS 后腦損傷與修復(fù)的分子機(jī)制，為CIS患者治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 12 只SPF 級(jí)SD 大鼠（雄性，8 周齡，體質(zhì)量240～260 g）與3只新生SPF級(jí)SD大鼠（雄性，1 日齡，體質(zhì)量18～20 g），均由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2017-0001、SYXK（豫）2020-0004］。所有大鼠均可自由攝食飲水，并飼養(yǎng)在12 h/12 h 光/暗循環(huán)、溫度（22±3） ℃、濕度（60±5）%環(huán)境下。所有動(dòng)物操作均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理要求及3R 原則。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：20201202036）。

1.1.2 主要試劑與儀器 TTC 染色液（#G3005）購(gòu)自北京索萊寶公司；Hanks 溶液（#C0218）、RIPA 裂解液（#P0013B）、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（#P0018S）、LY294002（#S1737）均購(gòu)自上海碧云天生物公司；鼠抗GPNMB 抗體（#MA5-24014）、鼠抗GAPDH 抗體（#MA1-16757）、鼠抗PI3K 抗體（MA1-74183）、鼠抗p-Akt抗體（MA1-20325）、鼠抗Akt抗體（#AHO1112）、HRP 標(biāo)記羊抗鼠抗體（#G-21040）、鼠抗Iba1 抗體（#MA5-38265）、兔 抗CD16（#MA5-36143）、兔 抗CD206 抗體（#MA5-32498）、Alexa Fluor?488 標(biāo)記羊抗兔抗體（#A-11008）、Alexa Fluor?568 標(biāo)記羊抗鼠抗 體（#A-11004）、含B27 的 神 經(jīng) 元 培 養(yǎng) 基（#A3653401）、DMEM/F12 培 養(yǎng) 基（#11995040）、TRIzol 試 劑（#15596026）、pcDNA3.1（-）質(zhì) 粒（#V79520）、Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒（#11668030）均 購(gòu) 自 美 國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。表達(dá)Gpnmb與shRNA-Gpnmb的AAV 載體由上海吉滿生物合成。

激光多普勒血流儀ALF2100（日本東京ADVANCE 公司）；轉(zhuǎn)棒疲勞儀Rotarod SA102（江蘇賽昂斯生物科技公司）；熒光顯微鏡DM4000 BLED（德國(guó)萊卡公司）；凝膠成像儀WD-9413B、蛋白電泳儀DYCZ-24DN（北京六一儀器廠）；細(xì)胞培養(yǎng)箱HGPN-270（山東歐萊博公司）；三氣培養(yǎng)箱SQ-80N（上海慕斯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；熒光定量PCR 儀Applied Biosystems 7500（美國(guó)ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 MCAO 構(gòu)建 采用MCAO 作為CIS 模型［12］，大鼠術(shù)前禁食10 h，靜脈注射30 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉，體溫維持在36.5～37.5 ℃。在大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)插入一條尼龍單絲縫合線，向前推進(jìn)到閉合中腦動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）起點(diǎn)，使用激光多普勒血流儀通過(guò)引導(dǎo)管插入左側(cè)大腦皮層監(jiān)測(cè)腦血流，當(dāng)腦血流量降低幅度在基線水平30%以上視作建模成功，4 h后通過(guò)取出縫合線恢復(fù)腦灌注。對(duì)照組大鼠進(jìn)行假手術(shù)，操作方式相同，但不使用縫合線對(duì)MCA進(jìn)行阻斷。

1.2.2 大鼠分組干預(yù) 將大鼠隨機(jī)分為4組，每組3 只：對(duì)照組、MCAO 組、KD-Gpnmb組與OV-Gpnmb組，對(duì)照組與MCAO 組注射AAV 空載體，KD-Gpnmb組、OV-Gpnmb組分別注射包裹shRNA-Gpnmb、Gpnmb的AAV 載體，具體方法為［13］：將大鼠麻醉后，鉆取直徑 為5 mm 的 骨 孔，使 用 微 型 泵 將2.5 μl（8.1×1012μg/ml）相應(yīng)載體定點(diǎn)緩慢注射至大鼠大腦皮層（相對(duì)Bregma：AP+0.02 mm，L-3.2 mm，V-1.5 mm），注射完后封閉骨孔，縫合傷口。MCAO 組、KDGpnmb組與OV-Gpnmb組均在注射1 周后構(gòu)建MCAO模型，對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)。

1.2.3 神經(jīng)功能測(cè)試 建模第3 天通過(guò)改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological deficit score，mNSS）對(duì)大鼠神經(jīng)缺損程度進(jìn)行評(píng)估［14］，評(píng)估內(nèi)容包括運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)、感覺(jué)試驗(yàn)、反射喪失與不正常運(yùn)動(dòng)等，評(píng)分范圍為0～18 分，分?jǐn)?shù)越高代表神經(jīng)系統(tǒng)功能損害越嚴(yán)重：0 分表示沒(méi)有明顯損傷，1～6 分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。采用轉(zhuǎn)棒疲勞測(cè)試評(píng)估大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。將大鼠置于加速旋轉(zhuǎn)桿上，在5 min 內(nèi)從4 r/min 增加到120 r/min，測(cè)試大鼠3 次，每次間歇5 min，記錄從旋轉(zhuǎn)桿上掉落延遲時(shí)間。采用膠帶去除試驗(yàn)評(píng)估感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能，將大鼠置于籠中1 min，并將50 mm2膠帶粘貼在右前肢遠(yuǎn)側(cè)橈骨區(qū)域，記錄接觸時(shí)間和去除膠帶時(shí)間。每只動(dòng)物試驗(yàn)3 次，每次實(shí)驗(yàn)截止時(shí)間為120 s。

1.2.4 TTC 染色 建模3 d 處死大鼠，迅速取下大腦置于冰上，將大腦組織行冠狀切片，厚度1 mm，采用2%TTC 染色，Image J 軟件計(jì)算梗死區(qū)域面積，每個(gè)大鼠選取3 片大腦冠狀切片作為重復(fù)，計(jì)算平均值。

1.2.5 細(xì)胞分離培養(yǎng) 從新生大鼠腦組織中分離培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元。先取下頭部，打開(kāi)顱骨后收集腦組織，切除腦干與小腦，并去除蛛網(wǎng)膜組織和表面血管，將腦組織置于無(wú)血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，加入0.125%胰蛋白酶于37 ℃消化5 min，500 g 低速離心5 min，以新鮮的DMEM/F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、50 U/ml 青霉素、50 mg/ml 鏈霉素、1 mmol/L 丙酮酸鈉、2 mmol/L L-谷氨酰胺與100 mmol/L非必需氨基酸）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于含新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每2 d 更換1次培養(yǎng)基。采用差速貼壁法純化培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，采用添加B27 的神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元。細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37 ℃，并向培養(yǎng)箱中持續(xù)通入含有5%CO2的潮濕空氣。采用流式細(xì)胞儀分析3種細(xì)胞純度，即小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元分別測(cè)定CD11b、GFAP 與Hb9 抗體標(biāo)記，純 度 測(cè) 得 分 別 為（99.0±0.5）%、（97.7±0.8）%與（96.6±1.0）%，符合要求。

1.2.6 OGD 干預(yù) 模擬體外缺血條件培養(yǎng)細(xì)胞，采用缺血培養(yǎng)基（Hanks 溶液中添加140 mmol/L NaCl、3.5 mmol/L KCl、0.43 mmol/L KH2PO4、1.25 mmol/L MgSO4、1.7 mmol/L CaCl2、5 mmol/L NaHCO3、20 mmol/L HEPES，pH調(diào)整至7.2～7.4），將其置于缺氧培養(yǎng)箱（95%N2、5%CO2）中培養(yǎng)。

1.2.7 細(xì)胞分組干預(yù) 將小膠質(zhì)細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、OGD 組、pcDNA-Gpnmb組和pcDNA-Gpnmb+LY294002 組，將pcDNA-Gpnmb重組質(zhì)粒通過(guò)Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染至pcDNA-Gpnmb組和pcDNA-Gpnmb+LY294002 組細(xì)胞中，對(duì)照組與OGD組細(xì)胞均需轉(zhuǎn)染pcDNA空質(zhì)粒載體。轉(zhuǎn)染48 h篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，pcDNA-Gpnmb+LY294002 組培養(yǎng)基中添加1.5 μmol/L PI3K 抑制劑LY294002，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，對(duì)照組正常培養(yǎng)24 h，其余3 組進(jìn)行OGD干預(yù)24 h。

1.2.8 Western blot 測(cè)定蛋白含量 采用RIPA 裂解液從大鼠的缺血半暗帶大腦皮質(zhì)組織和細(xì)胞中提取總蛋白，經(jīng)過(guò)硫酸-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至聚乙烯二氟化物膜，使用5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)抗體，將膜在4 ℃孵育過(guò)夜，取出磷酸緩沖液中浸泡，0.1%Tween 20 浸泡5 min，加入二抗后于室溫下孵育1 h，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)部參數(shù)。

1.2.9 免疫熒光測(cè)定組織/細(xì)胞極化標(biāo)志物 將切除的大腦組織制成20 μm冠狀切片，細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定于玻片，使用10%正常血清阻斷，分別添加一抗（CD16 抗體、CD206 抗體和組織需用的Iba-1 抗體，1∶100 稀釋）在4 ℃下孵育過(guò)夜，室溫下用熒光標(biāo)記二抗孵育2 h，細(xì)胞需進(jìn)行DAPI 復(fù)染3 min，采用熒光顯微鏡拍照，并用Image J軟件分析計(jì)算染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)大腦分析3個(gè)連續(xù)切片。

1.2.10 RT-PCR 檢測(cè)組織/細(xì)胞極化標(biāo)志物 采用TRIzol 試劑提取總RNA，將1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后以cDNA 作為模板進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，以GAPDH 作為內(nèi)部參數(shù)，各引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphad PRISM8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析與圖形繪制，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩組間比較采用方差齊性F檢驗(yàn)，符合方差齊性與正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合方差齊性與正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPNMB 在MCAO 大 鼠 腦 組 織 與OGD 培 養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)情況 采用Western blot 檢測(cè)GPNMB在MCAO 大鼠腦組織與OGD 培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：與正常大鼠腦組織相比，GPNMB在MCAO 建模3 d 的大鼠腦組織中表達(dá)量升高（P<0.05，圖1A）；與正常培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，OGD培養(yǎng)24 h 的小膠質(zhì)細(xì)胞GPNMB 表達(dá)量升高（P<0.05，圖1B），但神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞中GPNMB表達(dá)水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1B），且小膠質(zhì)細(xì)胞中GPNMB 表達(dá)量隨著OGD 培養(yǎng)時(shí)間推移而升高，在恢復(fù)正常氧培養(yǎng)24 h 后，GPNMB 表達(dá)量又下降至正常水平（P>0.05，圖1C）。提示GPNMB 在CIS 模型中表達(dá)上調(diào)，且主要來(lái)源于小膠質(zhì)細(xì)胞。

圖1 GPNMB 在MCAO 大鼠腦組織與OGD 培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of GPNMB in MCAO rat brain tissue and OGD cultured cells

2.2 GPNMB 對(duì)大鼠腦卒中后神經(jīng)功能與腦梗死程度的影響 為探究GPNMB 在大鼠CIS 中的作用，采用AAV 載體注射的辦法分別將大鼠腦組織內(nèi)的Gpnmb抑制或過(guò)表達(dá)（圖2A），比較大鼠腦卒中后神經(jīng)功能與大腦組織梗死程度。結(jié)果顯示，抑制Gpnmb后 構(gòu) 建MCAO，大 鼠mNSS 評(píng) 分 升 高（P<0.05，圖2B），Rotarod 測(cè)試中延遲掉落的時(shí)間縮短（P<0.05，圖2C），膠帶去除試驗(yàn)中接觸時(shí)間與去除時(shí)間均延長(zhǎng)（P<0.05，圖2D），TTC 染色觀察到腦梗死區(qū)域增大（P<0.05，圖2E），而過(guò)表達(dá)Gpnmb則得到相反的結(jié)果（P<0.05）。以上結(jié)果表明GPNMB 可以減輕CIS梗死程度與神經(jīng)功能損傷程度。

圖2 GPNMB對(duì)大鼠腦卒中后神經(jīng)功能與腦梗死程度的影響Fig.2 Effect of GPNMB on neurological function and degree of cerebral infarction after stroke in rats

2.3 GPNMB對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響 同時(shí)采用免疫熒光染色與RT-PCR 檢測(cè)大鼠腦組織內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞極化標(biāo)志物，結(jié)果顯示：抑制GPNMB 會(huì)增加CD16/Iba1雙陽(yáng)性細(xì)胞比例（P<0.05，圖3A）與M1極化因子iNOS、TNF-α mRNA 表達(dá)量（P<0.05，圖3C），同時(shí)降低CD206/Iba1 雙陽(yáng)性細(xì)胞比例（P<0.05，圖3B）與M2 極化因子Arginase1、IL-10 mRNA 表達(dá)（P<0.05，圖3C），而過(guò)表達(dá)GPNMB則出現(xiàn)相反的結(jié)果（P<0.05，圖3）。提示GPNMB 可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化。

圖3 GPNMB表達(dá)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響Fig.3 Effect of GPNMB expression on polarization of microglia

2.4 GPNMB 對(duì)PI3K/Akt 通路的影響 探討了GPNMB對(duì)PI3K/Akt通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制Gpnmb能降低大鼠腦組織PI3K 表達(dá)量與p-Akt/Akt比值（即Akt 磷酸化水平）（P<0.05），而過(guò)表達(dá)Gpnmb則能激活大鼠腦組織PI3K/Akt 通路表達(dá)（P<0.05，圖4）。

圖4 GPNMB對(duì)PI3K/Akt通路的影響Fig.4 Influence of GPNMB on PI3K/Akt pathway

2.5 抑制PI3K/Akt 通路對(duì)GPNMB 促M(fèi)2 極化效應(yīng)的影響 為驗(yàn)證GPNMB 是否通過(guò)PI3K/Akt 通路發(fā)揮促小膠質(zhì)細(xì)胞M2 極化效應(yīng)，體外OGD 培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，采用質(zhì)粒過(guò)表達(dá)Gpnmb、同時(shí)使用LY294002抑制PI3K/Akt通路表達(dá)，測(cè)定細(xì)胞極化標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt 通路表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)Gpnmb促進(jìn)M2 極化的效應(yīng)（P<0.05，圖5）。由此可見(jiàn)GPNMB 是通過(guò)激活PI3K/Akt 通路促進(jìn)體外OGD培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化。

圖5 抑制PI3K/Akt通路對(duì)GPNMB促M(fèi)2極化效應(yīng)的影響Fig.5 Influence of inhibiting PI3K/Akt pathway on GPNMB promoting M2 polarization

3 討論

小膠質(zhì)是一種具有免疫功能的重要細(xì)胞類型，在CIS 期間能對(duì)大腦生理環(huán)境變化做出反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2 表型并存且相互對(duì)抗，在CIS 后的神經(jīng)損傷與修復(fù)中發(fā)揮著重要作用［15-16］。了解小膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的分子機(jī)制，尋找細(xì)胞極化方向的驅(qū)動(dòng)分子，可以通過(guò)定向控制小膠質(zhì)細(xì)胞極化方向改善CIS結(jié)果。

本研究首先檢測(cè)到大鼠MCAO 模型腦皮質(zhì)組織與OGD 干預(yù)的小膠質(zhì)細(xì)胞中GPNMB 表達(dá)增加，表明缺血缺氧的微環(huán)境誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞GPNMB表達(dá)上調(diào)。MCAO 模型后3 d，神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試顯示大鼠神經(jīng)功能顯著下降，腦梗死明顯，且伴隨著M1和M2 表型分子的強(qiáng)烈表達(dá)，表明MCAO 大鼠體內(nèi)同時(shí)存在較高的炎癥水平與抗炎反應(yīng)。當(dāng)過(guò)表達(dá)大鼠腦組織內(nèi)Gpnmb后，相較MCAO組，神經(jīng)功能有所恢復(fù)，腦梗死程度減輕，且小膠質(zhì)細(xì)胞傾向于M2極化，而抑制Gpnmb只能起到相反的效果。腦缺血是誘發(fā)親炎與抗炎反應(yīng)的強(qiáng)刺激，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞傾向M1 極化時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)促炎因子iNOS 與TNF-α 等表達(dá)，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)與神經(jīng)細(xì)胞損傷，而當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞傾向M2 極化時(shí)，則能誘導(dǎo)抗炎因子Arginase1 與IL-10 等表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)免受炎癥損傷［17-19］。NEAL 等［20］研究發(fā)現(xiàn)糖蛋白GPNMB 可通過(guò)CD44受體緩解星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，雖然與本研究所探討的下游機(jī)制不同，但說(shuō)明了GPNMB 具有神經(jīng)保護(hù)的效果。

PI3K/Akt通路對(duì)于缺血環(huán)境的細(xì)胞存活具有重要意義［21］。本研究發(fā)現(xiàn)GPNMB 對(duì)PI3K/Akt 具有激活的作用，而在體外OGD 培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中抑制PI3K 表達(dá)抵消了Gpnmb過(guò)表達(dá)促細(xì)胞M2 極化的作用，說(shuō)明GPNMB 通過(guò)激活PI3K/Akt 通路促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2 極化。NAKANO 等［22］研究發(fā)現(xiàn)GPNMB在缺血/再灌注損傷小鼠模型中表達(dá)上調(diào)，而過(guò)表達(dá)GPNMB顯著改善了小鼠腦梗死體積，并指出可能是通過(guò)ERK1/2 和Akt 的磷酸化實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用，但該研究并未將GPNMB 與小膠質(zhì)細(xì)胞極化聯(lián)系起來(lái)，而本研究從小膠質(zhì)細(xì)胞極化的角度進(jìn)一步豐富了GPNMB神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。

綜上，體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表明小膠質(zhì)M1與M2極化趨勢(shì)具有可塑性，Gpnmb高表達(dá)能夠激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)缺血刺激下的小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化，減輕CIS 神經(jīng)炎癥損傷。未來(lái)或可通過(guò)定向改變這些分子表達(dá)來(lái)改善CIS患者預(yù)后。