β-谷甾醇對OVA 誘導(dǎo)的過敏性哮喘大鼠模型中Th17/Treg 免疫失衡的調(diào)節(jié)①

賈菊芳 曾夢楠③ 張貝貝 王 茹 劉 萌 郭彭莉 張欽欽 張風(fēng)宇 鄭曉珂③ 馮衛(wèi)生③

（河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046）

過敏性哮喘是一種慢性氣道炎癥反應(yīng)，涉及多種類型的細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子和轉(zhuǎn)錄因子，主要表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥細(xì)胞因子釋放、黏液高分泌、支氣管痙攣、氣道高反應(yīng)性（airway hyper reactivity，AHR）等［1-2］。目前全世界約有3 億人患有哮喘，且其發(fā)病率和病死率在過去的20年中持續(xù)上升［3］。然而，目前尚無治療哮喘的特效藥物，臨床上多用皮質(zhì)類固醇、抗組胺藥和白三烯受體拮抗劑作為哮喘的治療藥物，但長期使用效果不佳，且不良反應(yīng)明顯［4］。研究表明，植物甾醇因其天然來源和廣泛的藥理特性，已被用作治療多種過敏和慢性炎癥的常規(guī)藥物［5］。β-谷甾醇是最具代表性的一種植物甾醇，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等多種藥理活性［6］，但其對過敏性哮喘的作用及機(jī)制尚無明確報(bào)道。

目前關(guān)于哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，諸多研究證實(shí)免疫機(jī)制異常與哮喘發(fā)病密切相關(guān)，除經(jīng)典的Th1/Th2 免疫失衡模式外，近年來越來越多的研究表明Th17/Treg 免疫失衡在哮喘發(fā)病機(jī)制中也具有重要作用，成為哮喘治療和預(yù)防的重點(diǎn)［7-8］。故本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的卵白蛋白（ovalbumin，OVA）法建立過敏性哮喘大鼠模型，探討β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠的干預(yù)作用及其對Th17/Treg 免疫失衡的影響，為β-谷甾醇作為哮喘治療藥物的潛在應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級雄性SD 大鼠40 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（180±20） g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，許可證號：SYXK（豫）2020-0004。飼養(yǎng)于18～22 ℃清潔級動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，空氣流通，自由進(jìn)食飲水，晝夜各12 h。動物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照河南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，倫理號：DWLL2018080003。

1.1.2 藥物與試劑β-谷甾醇（批號：C12368373）、氯化乙酰膽堿（批號：C12410057）購自上海麥克林生化科技有限公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）（批號：H41021610）購自上海金不換蘭考制藥有限公司生產(chǎn)；Ⅱ級、Ⅴ級OVA（批號：A5253、A5503）購自美國Sigma 公司；氫氧化鋁佐劑（批號：77161）、CD4 抗 體（PE，2198944）、IL-17A 抗 體（APC，2142931）、CD4 抗 體（FITC，2282605）、CD25 抗 體（PE，2293919）、Foxp3 抗體（APC，2250398）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；磷酸組胺、酚紅（批號：H8530、P8460）購自北京Solarbio 公司；IL-4 試劑盒（批號：RK00040）購自武漢ABclonal 公司；IL-17A試劑盒（批號：ERC170）購自深圳NeoBioscience 公司；IL-6、TNF-α 試劑盒（批號：5TUM3CR2RV、ACMWF2PRGG）購自武漢Elabscience 公司；IL-35（批號：202109）購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.3 主要儀器 YLS-8A 型多功能誘咳引喘儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；BioTek 多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；402A1 型超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；流式細(xì)胞儀（BD FACS Aria Ⅲ，美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 過敏性哮喘大鼠模型的制備 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按照隨機(jī)分配原則分為正常組（CON）、模型組（M）、陽性藥地塞米松組（DEX，0.075 mg/kg）和β-谷甾醇組（Sit，50 mg/kg）。哮喘模型的建立分為致敏期和激發(fā)期，分別在第1 天和第8 天腹腔注射致敏液（Ⅴ級OVA 10 mg+氫氧化鋁10 mg）致敏（1 ml/200 g）；第15～21天，采用20 ml 2%Ⅱ級OVA連續(xù)霧化激發(fā)，每次30 min，霧化前30 min灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，給藥體積為1.0 ml/100 g。M 組給予等量蒸餾水，CON 組用生理鹽水替代致敏液腹腔注射及霧化吸入。造模給藥結(jié)束后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測和取材。

1.2.2 咳喘指標(biāo)檢測 造模給藥結(jié)束后，將大鼠置于多功能誘咳引喘儀的氣霧箱中，采用25%氨水噴霧誘咳15 s取出，以大鼠腹肌收縮，同時張嘴為標(biāo)準(zhǔn)，觀察大鼠從噴霧開始至第1次張口咳嗽的時間，即大鼠的咳嗽潛伏期，記錄大鼠的咳嗽潛伏期及2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

以0.1%磷酸組胺和2%氯化乙酰膽堿等量混合液噴霧致喘，觀察大鼠從噴霧開始到出現(xiàn)氣短喘促的時間，即大鼠的引喘潛伏期。記錄大鼠的引喘潛伏期及2 min內(nèi)喘息次數(shù)。

1.2.3 氣管排泌酚紅實(shí)驗(yàn) 造模給藥結(jié)束后，腹腔注射5%酚紅溶液（0.3 ml/100 g），0.5 h 后處死大鼠，分離并剪取相同位置和長度的氣管，放入含2 ml生理鹽水的離心管中靜置12 h，加入100 μl 1 mol/L NaOH 溶液，在波長546 nm 處檢測吸光度值。以酚紅含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算氣管酚紅排泌量。

1.2.4 肺組織病理學(xué)分析 迅速解剖大鼠，取肺組織，常規(guī)脫水、滲透、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE 染色，顯微鏡下對大鼠的病理結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.5 大鼠原代肺細(xì)胞凋亡水平檢測 迅速解剖大鼠取出肺臟，將肺臟上的血跡漂洗干凈并擦干，取適量肺組織于1.5 ml 離心管中剪碎，加入1 ml 胰酶消化20～30 min 至細(xì)胞呈黏液狀，加入血清終止消化。過濾，收集濾液，1 200 r/min 離心5 min。離心結(jié)束后，緩緩倒掉上清液，得到原代肺細(xì)胞。之后按照PE Annexin V/7-AAD 凋亡檢測試劑盒要求處理細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞檢測儀進(jìn)行檢測分析。

1.2.6 大鼠原代肺細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平檢測 以1.2.5 同樣的方法獲得大鼠原代肺細(xì)胞。然后按照ROS 檢測試劑盒要求處理細(xì)胞，并用流式細(xì)胞檢測儀進(jìn)行檢測分析。

1.2.7 大鼠外周血中Th17及Treg細(xì)胞水平檢測

大鼠麻醉后腹主動脈取血，分別取血漿各100 μl 于流式管中，標(biāo)記為Th17 和Treg。分別用PE-CD4、APC-IL-17A 抗 體 標(biāo) 記Th17 細(xì) 胞，F(xiàn)ITC-CD4、PECD25、APC-Foxp3 抗體標(biāo)記Treg 細(xì)胞。每管加入對應(yīng)外標(biāo)抗體避光孵育30 min，然后加入1×紅細(xì)胞裂解液，裂解約10 min 至液體澄清，300 g 離心5 min，棄上清，加入2 ml PBS重懸，重復(fù)2次。每管加入1 ml破膜固定工作液重懸細(xì)胞，室溫避光孵育45 min；每管加入2 ml 1×破膜緩沖液，500 g 離心5 min，棄上清；用100 μl 1×破膜緩沖液重懸細(xì)胞，加入對應(yīng)內(nèi)標(biāo)抗體避光孵育30 min，然后每管加入300 μl PBS重懸細(xì)胞并上機(jī)檢測。

1.2.8 生化指標(biāo)檢測 生化法檢測大鼠肺組織中MDA 含量及T-SOD、GSH-Px 活力，操作步驟按試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.2.9 Th17、Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平檢測 取出凍存的大鼠血清、肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）及肺組織，按試劑盒要求加入PBS緩沖液制備10%的肺組織勻漿，采用ELISA 法測定大鼠BALF 中IL-4、IL-17A 水平、血清中IL-35 水平，以及肺組織中IL-6、TNF-α、IL-35水平。

2 結(jié)果

2.1β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠咳喘指標(biāo)及氣管酚紅排泌量的影響 與CON 組相比，M 組大鼠咳嗽潛伏期、引喘潛伏期及氣管酚紅排泌量均顯著降低，2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)及喘息次數(shù)均顯著增加（P<0.01）；與M 組相比，DEX 顯著提高了過敏性哮喘大鼠的咳嗽潛伏期及引喘潛伏期，降低了大鼠2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)及喘息次數(shù)（P<0.01），對哮喘大鼠氣管酚紅排泌量的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Sit顯著延長了過敏性哮喘大鼠的咳嗽潛伏期（P<0.01）、引喘潛伏期（P<0.05）及氣管酚紅排泌量（P<0.05），降低了大鼠2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)（P<0.01）及喘息次數(shù)（P<0.05）。表明β-谷甾醇具有鎮(zhèn)咳平喘、祛痰的作用，見圖1。

圖1 β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠咳喘指標(biāo)及氣管酚紅排泌量的影響Fig.1 Effects of β-sitosterol on cough and asthma indexes and tracheal phenol red excretion in allergic asthmatic rats

2.2β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠肺組織病理改變的影響 與CON 組相比，M 組大鼠支氣管壁明顯增厚，管腔狹窄，支氣管和血管周圍出現(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤。與M 組相比，DEX 和β-谷甾醇可顯著減輕炎癥細(xì)胞浸潤，改善支氣管壁增厚和管腔狹窄情況。表明β-谷甾醇能夠減輕過敏性哮喘大鼠的肺部損傷，見圖2。

圖2 β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠肺組織病理改變的影響（×200）Fig.2 Effects of β-sitosterol on pathological changes of lung tissue in allergic asthmatic rats （×200）

2.3β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠原代肺細(xì)胞凋亡水平的影響 炎癥浸潤會引起肺組織細(xì)胞凋亡導(dǎo)致結(jié)構(gòu)及功能損傷，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠原代肺細(xì)胞凋亡水平的影響。結(jié)果顯示，與CON 組相比，M 組大鼠原代肺細(xì)胞凋亡水平明顯升高（P<0.01）；與M 組相比，DEX 和β-谷甾醇顯著降低了過敏性哮喘大鼠原代肺細(xì)胞凋亡水平（P<0.01）。表明β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠肺臟具有保護(hù)作用，見圖3。

圖3 β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠原代肺細(xì)胞凋亡水平的影響Fig.3 Effects of β-sitosterol on apoptosis of primary lung cells in allergic asthmatic rats

2.4β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的影響 氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)重要生物分子和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的多種細(xì)胞通路的基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，與CON 組相比，M 組大鼠原代肺細(xì)胞ROS水平明顯升高（P<0.01）；與M 組相比，DEX 和β-谷甾醇顯著降低了過敏性哮喘大鼠原代肺細(xì)胞ROS水平（P<0.01，圖4A）。檢測大鼠肺組織中MDA 含量及T-SOD、GSH-Px 活力，發(fā)現(xiàn)DEX 和β-谷甾醇可顯著降低過敏性哮喘大鼠肺組織中MDA水平，提高T-SOD 及GSH-Px 活力（P<0.01，圖4B～D）。提示β-谷甾醇能夠抑制過敏性哮喘大鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激損傷。

圖4 β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的影響Fig.4 Effects of β-sitosterol on oxidative stress levels in lung tissue of allergic asthmatic rats

2.5β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠外周血中Th17/Treg 失衡的影響 Th17/Treg 免疫失衡在哮喘發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測過敏性哮喘大鼠外周血中Th17 及Treg 細(xì)胞水平。結(jié)果如圖5 所示，與CON 組相比，M 組大鼠外周血中Th17細(xì)胞比例顯著升高，Treg 細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01）；與M 組相比，DEX 和β-谷甾醇可顯著降低Th17細(xì)胞比例，提高Treg細(xì)胞比例（P<0.01）。提示β-谷甾醇能夠改善過敏性哮喘大鼠體內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡的狀況。

圖5 β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠外周血中Th17/Treg 失衡的影響Fig.5 Effects of β-sitosterol on Th17/Treg imbalance in peripheral blood of allergic asthmatic rats

2.6β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠Th17、Treg 相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響 如圖6 所示，與CON 組相比，M 組大鼠BALF、血清及肺組織中IL-17A 水平均顯著升高（P<0.01）、IL-35 水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），BALF 中IL-4 水平及肺組織中IL-6、TNF-α 水平均顯著升高（P<0.01）；給藥DEX 和β-谷甾醇后與M 組相比，IL-17A、IL-4、IL-6、TNF-α 水平顯著降低，IL-35水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。提示β-谷甾醇可以調(diào)節(jié)過敏性哮喘大鼠Th17、Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平。

圖6 β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠Th17、Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響Fig.6 Effects of β-sitosterol on Th17 and Treg-related cytokine levels in allergic asthmatic rats

3 討論

哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞成分參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、胸悶、氣短等癥狀［9］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，哮喘的發(fā)病率和病死率逐年上升，且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于哮喘的治療缺乏特效藥，因此迫切需要開發(fā)出能夠有效控制或治療哮喘的替代藥物［2，10］。研究表明，植物甾醇在炎癥性疾病的治療中具有明顯藥理活性，被譽(yù)為“生命鑰匙”［5］。β-谷甾醇是其中含量最豐富的一類，在抗炎、抗氧化、降血脂及調(diào)節(jié)免疫等方面表現(xiàn)出良好的藥理活性，但其對過敏性哮喘的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道［6，11］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過OVA 誘導(dǎo)成功建立過敏性哮喘大鼠模型，以研究β-谷甾醇對過敏性哮喘的干預(yù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇能夠明顯延長過敏性哮喘大鼠的咳嗽及引喘潛伏期，減少咳嗽及喘息次數(shù)，促進(jìn)氣管酚紅排泌，減輕哮喘大鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，起到一定程度的肺保護(hù)作用。

Th17 和Treg 細(xì)胞在功能上相互拮抗，共同維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)［12-13］。IL-17A 是Th17 細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)因子，能夠通過促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞向炎癥區(qū)域募集并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如IL-4、IL-6、TNF-α等，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生［14-15］。IL-35 是近年發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)Treg 細(xì)胞免疫抑制功能的重要因子［16-18］。WHITEHEAD 等［19］研究表明，IL-35 可抑制IL-17 介導(dǎo)的小鼠氣道高反應(yīng)性。此外，IL-6 是Th17 細(xì)胞分化所必需的關(guān)鍵因子，其與TGF-β 相互作用，促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化，抑制Treg 細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致Th17/Treg失衡［20］。本實(shí)驗(yàn)通過檢測過敏性哮喘大鼠外周血中Th17和Treg細(xì)胞，以及肺組織、BALF及血清中以上相關(guān)細(xì)胞因子的水平，探究β-谷甾醇對過敏性哮喘大鼠Th17/Treg 免疫失衡的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠模型中Th17 細(xì)胞及促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-4、IL-6、IL-17A 水平較正常大鼠顯著升高，而Treg 細(xì)胞及抑炎細(xì)胞因子IL-35 水平顯著降低。β-谷甾醇干預(yù)后明顯改善了Th17/Treg 細(xì)胞的失衡以及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，提示β-谷甾醇對哮喘的干預(yù)作用可能與其調(diào)節(jié)哮喘大鼠Th17/Treg 細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。

氧化應(yīng)激在哮喘的發(fā)病中也有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激相關(guān)基因被敲除的小鼠中無法建立哮喘和氣道重塑模型［21］。當(dāng)氣道炎癥發(fā)生時，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞募集，從而引起氧化應(yīng)激及ROS 釋放，導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷或凋亡［22］。在本實(shí)驗(yàn)中，β-谷甾醇能夠抑制OVA 誘導(dǎo)的過敏性哮喘大鼠肺組織中ROS和MDA水平增高，并恢復(fù)抗氧化酶SOD和GSH-Px活力，抑制哮喘大鼠肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)；同時，β-谷甾醇也降低了過敏性哮喘大鼠原代肺細(xì)胞凋亡率，改善哮喘大鼠的肺損傷。這可能與β-谷甾醇的抗氧化活性有關(guān)，其具體抗氧化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可以改善過敏性哮喘大鼠的咳喘指標(biāo)、氣管酚紅排泌及肺組織病理學(xué)變化，減輕哮喘大鼠肺組織氧化損傷，調(diào)節(jié)哮喘大鼠機(jī)體Th17/Treg細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗過敏性哮喘作用。其作用機(jī)制可能與β-谷甾醇對Th17/Treg 免疫失衡及氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。本文為β-谷甾醇治療過敏性哮喘的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也進(jìn)一步證實(shí)了Th17/Treg免疫失衡在過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要作用。