線(xiàn)粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白Drp1在小鼠腦出血后炎癥反應(yīng)中的作用①

簡(jiǎn) 丹 鄭淑月 翟 瑄 梁 平 （重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一個(gè)極具危害性的世界公共衛(wèi)生問(wèn)題，雖然其發(fā)病率在全球腦卒中不高（10%～15%），但其嚴(yán)重預(yù)后不良導(dǎo)致的高致殘率、病死率給人類(lèi)健康帶來(lái)了重大難題［1］。ICH 的病后生存率較低，五年生存率僅為29%［2］。幸存者將伴隨嚴(yán)重和長(zhǎng)期的神經(jīng)功能障礙。目前對(duì)其損傷機(jī)制和治療手段的研究仍有限。

線(xiàn)粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1（mitochondrial dynamicrelated protein 1，Drp1）是一種GTP 酶，參與線(xiàn)粒體分裂及線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，有研究表明Drp1通過(guò)介導(dǎo)受損傷線(xiàn)粒體的分裂參與了細(xì)胞的線(xiàn)粒體自噬過(guò)程［3-4］。線(xiàn)粒體自噬是一種特異性和選擇性的自噬方式［5］。當(dāng)細(xì)胞持續(xù)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，線(xiàn)粒體發(fā)生分裂，同時(shí)釋放大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，對(duì)細(xì)胞造成損害［6］。分裂后的線(xiàn)粒體碎片被線(xiàn)粒體自噬機(jī)制標(biāo)記和識(shí)別后分裂形成自噬小體，然后融合到溶酶體中降解，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為線(xiàn)粒體自噬［7］。線(xiàn)粒體自噬的阻滯會(huì)導(dǎo)致ROS 累積，從而激活炎癥復(fù)合體及其下游炎癥因子，表明線(xiàn)粒體自噬與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)［8］。研究表明，抑制Drp1 可以抑制線(xiàn)粒體分裂，從而減弱線(xiàn)粒體自噬，而線(xiàn)粒體自噬在腦缺血/再灌注損傷中起神經(jīng)保護(hù)作用［4，9］。然而，Drp1在ICH 中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

Mdivi-1 是一種Drp1 抑制劑，可以通過(guò)血腦屏障。Mdivi-1 通過(guò)抑制Drp1 磷酸化以及線(xiàn)粒體膜轉(zhuǎn)位從而抑制Drp1 與線(xiàn)粒體膜相互作用［10］。本研究采用自體血注射建立小鼠ICH 模型，通過(guò)腹腔注射Mdivi-1 抑制Drp1，探究Drp1 在ICH 后炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制是否與線(xiàn)粒體自噬相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年C57 雄性小鼠（SPF 級(jí)），體質(zhì)量為18～22 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本實(shí)驗(yàn)符合重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定（倫理審批號(hào)：2021295）。

1.1.2 試劑 Mdivi-1（HY-15886）購(gòu)自Medchemexpress；兔來(lái)源MPO 抗體（ab208670）購(gòu)自Abcam 公司；小鼠來(lái)源Drp1 抗體（6Z-82）購(gòu)自Santa 公司；磷酸化Drp1 抗體（3455S）購(gòu)自CST 公司；TOM20 抗體（11802-1-AP）購(gòu)自Proteintech 公司；COX4Ⅰ1 抗體（ARP42784_T100）購(gòu) 自Aviva 公 司；IL-6 抗 體（AP60675）購(gòu)自Abcepta 公司；TNF-α 抗體（A11534）及熒光二抗購(gòu)自ABclonal公司；鼠二抗、兔二抗購(gòu)自Abways 公司；二甲基亞砜（DMSO，D2650）；聚乙二醇300（PEG300，202371）購(gòu)自Sigma 公司；聚山梨酯-80（Tween-80，A600562）購(gòu) 自BBI 公 司；PVDF 膜（Millipore 公司）；BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒（Beyotime公司）；化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)試劑盒（NCM 公司）；牛血清蛋白封閉液（BSA，SW3015）購(gòu)自Solarbio。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及ICH 模型 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理見(jiàn)圖1。小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.7 ml/10 g）麻醉后，使用微量注射器采取小鼠尾靜脈血20 μl 備用，固定小鼠于腦立體定位儀，將20 μl自體血于10 min內(nèi)勻速（2 μl/min）注射入小鼠右基底節(jié)（前囟前0.2 mm，右1.0 mm，深3.0 mm），留針10 min 以防止血液反流，緩慢拔針，骨蠟封閉顱骨缺口后縫合頭皮。假手術(shù)組依照相同方法注射等量生理鹽水［11-12］。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理Fig.1 Grouping and operation of experimental animals

1.2.2 抑制劑給藥 Mdivi-1 依次溶于DMSO、生理鹽水、PEG300 以及Tween-80，終濃度為3 mg/ml。腹腔注射（25 mg/kg， 50 mg/kg， 75 mg/kg） 60 min 后建立ICH 模型［13］。Mdivi-1 溶劑對(duì)照組給予相同劑量DMSO+生理鹽水+PEG300+Tween-80。

1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）在ICH術(shù)后12 h 評(píng)估各組小鼠神經(jīng)功能，mNSS 評(píng)分主要包括4項(xiàng)：運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、感官實(shí)驗(yàn)、平衡木實(shí)驗(yàn)、反射表現(xiàn)和不正常運(yùn)動(dòng)?？偡譃?8 分，分?jǐn)?shù)越高，小鼠神經(jīng)損傷越重［12，14］。

1.2.4 腦含水量測(cè)定 ICH 術(shù)后12 h 麻醉各組小鼠并迅速斷頭取腦，隨即稱(chēng)取患側(cè)半球腦組織質(zhì)量獲得濕重。將取出的腦組織在100 ℃烤箱中烘烤24～48 h，直至最后2 次稱(chēng)量腦組織質(zhì)量相差不超過(guò)0.000 3 g，再次稱(chēng)取患側(cè)半球腦組織質(zhì)量獲得干重。由以下公式計(jì)算腦含水量：腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%［15-16］。

1.2.5 HE 和Nissl 染色 各組小鼠麻醉心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，將腦組織于4%多聚甲醛中固定48 h，然后脫水、浸蠟、包埋、切片并進(jìn)行染色。將HE、Nissl 切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察以評(píng)估形態(tài)學(xué)變化并采集圖像。

1.2.6 免疫熒光 各組小鼠麻醉后，用生理鹽水、4%多聚甲醛灌注后取出腦組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，之后使用蔗糖溶液梯度脫水直至腦組織在30%蔗糖溶液中沉底，并使用低溫恒溫切片機(jī)切片（8 μm）。取切片置于室溫復(fù)溫，滴5%BSA（0.5 g BSA+0.1 ml TriotonX-100+9.9 ml PBS）于37 ℃水浴箱中封閉1 h，孵育一抗MPO（1∶100） 4℃過(guò)夜。取切片復(fù)溫，37 ℃水浴箱孵熒光二抗（1∶100） 2 h，避光滴加封片劑（含DAPI）后封片。暗室熒光顯微鏡觀察［12］。

1.2.7 Western blot 檢測(cè) 麻醉各組小鼠，生理鹽水灌注后快速取腦組織，取血腫周?chē)X組織研磨勻漿，高速離心機(jī)離心后提取組織上清液，用BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品（50 μg/泳道）加樣于SDS 聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。將PVDF 膜轉(zhuǎn)入一抗稀釋液中，4 ℃孵育過(guò)夜，然后使用相應(yīng)的二抗稀釋液室溫孵育2 h，隨后用化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)試劑盒在Bio-Rad Gel Doc Imager上顯影。使用Image Lab分析蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 Drp1 在ICH 后的表達(dá)時(shí)間窗 通過(guò)Western blot檢測(cè)小鼠ICH后血腫周?chē)鶧rp1以及p-Drp1在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量，相比較于sham 組，Drp1 的總蛋白表達(dá)水平在ICH 后各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化，在ICH 后6 h p-Drp1 表達(dá)開(kāi)始升高，12 h 升至最高（P<0.01，圖2）。因此，為了取得最佳的觀察效果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇ICH后12 h小鼠腦組織標(biāo)本。

2.2 Mdivi-1 濃度對(duì)Drp1 的抑制效果 腹腔注射低（25 mg/kg），中（50 mg/kg），高濃度（75 mg/kg）Mdivi-1 60 min 后建立ICH模型，Western blot檢測(cè)血腫周?chē)鷓-Drp1以及Drp1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相較于ICH+Vehicle 組，ICH+Mdivi-1 低濃度組p-Drp1表達(dá)有所降低（P<0.05），而ICH+Mdivi-1 中濃度組和ICH+Mdivi-1 高濃度組p-Drp1 表達(dá)顯著降低（P<0.001，圖3）。而ICH+Mdivi-1中濃度組與ICH+Mdivi-1 高濃度組蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇Mdivi-1中濃度（50 mg/kg）。

圖3 Mdivi-1藥物濃度篩選Fig.3 Screening of Mdivi-1 drug concentration

2.3 抑制Drp1 可加重小鼠神經(jīng)功能缺損及腦水腫 相較于Sham 組，ICH 組mNSS 評(píng)分及腦含水量顯著升高（P<0.05，圖4），提示ICH 引起小鼠的神經(jīng)功能缺損及腦水腫，而ICH 組與ICH+Vehicle 組相比，mNSS 評(píng)分及腦含水量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示溶劑對(duì)照不影響藥物處理結(jié)果。與ICH+Vehicle 組 相 比，ICH+Mdivi-1 組mNSS 評(píng) 分 及腦含水量增加（P<0.05，圖4）。結(jié)果表明抑制Drp1可以加重小鼠ICH 后神經(jīng)功能缺損以及腦組織水腫。

圖4 各組小鼠ICH后神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量Fig.4 ICH neural function score and brain water content of mice in each group

2.4 抑制Drp1 增加了小鼠ICH 后神經(jīng)元變性死亡 HE 染色結(jié)果可見(jiàn)，與Sham 組相比，ICH 組染色較淺，小鼠腦組織間質(zhì)稀疏水腫和彌漫性空泡化，大量核固縮、溶解，神經(jīng)元變性死亡明顯增多。ICH組與ICH+Vehicle 組相比無(wú)明顯差異，提示溶劑對(duì)照不影響藥物處理結(jié)果。與ICH+Vehicle 組相比，ICH+Mdivi-1 組間質(zhì)水腫、空泡化明顯加重，腦組織損傷程度加重。Nissl 染色可見(jiàn)Sham 組尼氏小體完整，核呈深藍(lán)色，ICH 組和ICH+Vehicle 組腦組織尼氏體減少、解體甚至消失，而ICH+Mdivi-1 組尼氏體數(shù)量更少，與ICH+Vehicle 組相比腦組織損傷程度明顯加重（圖5）。結(jié)果表明抑制Drp1 增加小鼠ICH后神經(jīng)元變性死亡。

圖5 HE和Nissl染色結(jié)果（×400）Fig.5 HE and Nissl staining results （×400）

2.5 抑制Drp1 增加小鼠ICH 后血腫周?chē)行粤＜?xì)胞浸潤(rùn) 與Sham 組相比，ICH 組血腫周?chē)梢?jiàn)大量MPO 陽(yáng)性細(xì)胞。ICH 組與ICH+Vehicle 組無(wú)明顯差異，提示溶劑對(duì)照不影響藥物處理結(jié)果。ICH+Mdivi-1 組MPO 陽(yáng)性細(xì)胞與ICH+Vehicle 組相比明顯增多（圖6）。表明抑制Drp1增加小鼠ICH 后血腫周?chē)行粤＜?xì)胞浸潤(rùn)。

圖6 各組小鼠腦出血后血腫周?chē)X組織MPO的表達(dá)情況Fig.6 MPO expression in peripheral brain tissue of mice after intracerebral hemorrhage

2.6 抑制Drp1抑制腦組織中線(xiàn)粒體分裂的發(fā)生ICH 12 h 后，Western blot 檢測(cè)小鼠血腫周?chē)X組織中線(xiàn)粒體外膜標(biāo)志蛋白TOM20、線(xiàn)粒體內(nèi)膜標(biāo)志蛋白COX4Ⅰ1 表達(dá)。與Sham 組相比，ICH 組TOM20、COX4Ⅰ1 表達(dá)顯著降低（P<0.05）；ICH 組與ICH+Vehicle 組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示溶劑對(duì)照不影響藥物處理結(jié)果；與ICH+Vehicle 組相比，ICH+Mdivi-1 組TOM20、COX4Ⅰ1 表達(dá)升高（P<0.01，圖7A～D）。結(jié)果表明抑制Drp1 可能抑制小鼠ICH后神經(jīng)細(xì)胞受損線(xiàn)粒體分裂發(fā)生。

圖7 各組小鼠ICH 后血腫周?chē)鶷OM20、COX4Ⅰ1、IL-6和TNF-α表達(dá)Fig.7 Expression of TOM20，COX4Ⅰ1，IL-6 and TNF-α around hematoma after ICH of rats in each group

2.7 抑制Drp1 增加腦組織中炎癥因子表達(dá) ICH 12 h后，Western blot檢測(cè)小鼠血腫周?chē)X組織IL-6、TNF-α表達(dá)。與Sham組相比，ICH組炎癥因子IL-6、TNF-α 表 達(dá) 顯 著 增 加（P<0.05）；ICH 組 與ICH+Vehicle 組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示溶劑對(duì)照不影響藥物處理結(jié)果；與ICH+Vehicle 組相 比，ICH+Mdivi-1 組IL-6、TNF-α 表 達(dá) 增 加（P<0.05，圖7E、F）。結(jié)果表明抑制Drp1 可以增加小鼠ICH后腦組織炎癥因子表達(dá)。

3 討論

ICH 是一種預(yù)后不良的腦血管疾病，ICH 后腦損傷是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素也是臨床治療ICH的重點(diǎn)，當(dāng)前研究普遍認(rèn)為，ICH 后腦損傷包括血腫占位壓迫導(dǎo)致的原發(fā)性腦損傷以及血腫成分毒性刺激引發(fā)的繼發(fā)性腦損傷（secondary brain injury，SBI）［17］。SBI 的機(jī)制十分復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腦組織水腫、線(xiàn)粒體功能障礙、自噬等，這些機(jī)制互相交聯(lián)，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷［18］。因此，深入研究ICH 后SBI 機(jī)制對(duì)探討該疾病的發(fā)生、發(fā)展以及探索新型的ICH治療方案至關(guān)重要。

線(xiàn)粒體自噬是機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)受損傷或功能不完整的線(xiàn)粒體并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種重要機(jī)制［5］。當(dāng)細(xì)胞處于病理狀態(tài)時(shí)，線(xiàn)粒體受損并產(chǎn)生過(guò)量的ROS、鈣離子等毒性物質(zhì)，這些過(guò)量的ROS可以激活炎癥小體，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。適當(dāng)?shù)木€(xiàn)粒體自噬可以溶解損傷的線(xiàn)粒體碎片，從而減輕損傷線(xiàn)粒體對(duì)細(xì)胞的過(guò)度損傷［19］。目前研究表明，線(xiàn)粒體自噬在腦缺血/再灌注損傷中有神經(jīng)保護(hù)作用，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體自噬能夠減輕缺血/再灌注損傷［9，20］。線(xiàn)粒體分裂狀態(tài)是線(xiàn)粒體自噬所必需的，它使得損傷的線(xiàn)粒體更易形成自噬小體，Drp1 是一種線(xiàn)粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白，是誘導(dǎo)線(xiàn)粒體分裂的關(guān)鍵蛋白，抑制Drp1可以減弱線(xiàn)粒體自噬［21］。

本實(shí)驗(yàn)中，使用Drp1 抑制劑Mdivi-1 抑制Drp1的磷酸化，影響Drp1 與線(xiàn)粒體膜相互作用，探究Drp1 在線(xiàn)粒體自噬以及ICH 后炎癥反應(yīng)中的作用。首先使用神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量檢測(cè)、HE 以及Nissl染色判斷Mdivi-1對(duì)小鼠ICH后腦損傷的影響，發(fā)現(xiàn)Drp1 抑制劑Mdivi-1，有效抑制了Drp1 磷酸化并加重了ICH 后神經(jīng)功能以及腦組織損傷，Drp1 可能在ICH后腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。接下來(lái)進(jìn)一步探討了Drp1 影響ICH 后腦損傷的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)使用Drp1 抑制劑Mdivi-1 可以抑制ICH 后腦組織中線(xiàn)粒體分裂并增加了腦組織中炎癥因子表達(dá)?；谏鲜鼍€(xiàn)粒體自噬負(fù)調(diào)控炎癥反應(yīng)的研究基礎(chǔ)，推測(cè)Drp1 可能是通過(guò)調(diào)控線(xiàn)粒體分裂影響自噬小體的形成，從而影響ICH 后炎癥反應(yīng)。Drp1 與線(xiàn)粒體自噬及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

總之，本研究揭示了抑制Drp1可以抑制線(xiàn)粒體分裂，加重小鼠ICH 后急性炎癥反應(yīng)，并增加小鼠ICH 后腦水腫含量，加重腦組織損傷，加重神經(jīng)功能缺損。