喉癌治療后復(fù)發(fā)的影響因素分析及預(yù)測(cè)模型構(gòu)建

郭珊珊，楊文婧，許麗萍，陶倩，王歡，王書謙

滄州市人民醫(yī)院耳鼻喉科，河北 滄州 061000

喉癌（Laryngeal cancer， LC）屬于頭頸部腫瘤中相對(duì)常見的一類，雖然目前針對(duì)早期LC的手術(shù)及放化療方案對(duì)于延長(zhǎng)患者預(yù)后具有不錯(cuò)的臨床療效，但局部中晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移的LC患者治療及預(yù)后效果仍不理想［1-2］。近年來(lái)伴隨著靶向治療及精準(zhǔn)放療等治療方案的逐步完善，早期針對(duì)可能復(fù)發(fā)的LC患者開展上述治療能有效的延長(zhǎng)患者無(wú)病生存時(shí)間，降低疾病復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的可能性，故針對(duì)患者預(yù)后的研究一直以來(lái)是LC臨床研究的熱點(diǎn)話題［3］。既往的臨床研究［4］中，針對(duì)LC患者臨床資料、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查資料構(gòu)建的預(yù)后預(yù)測(cè)分析模型較多，但是由于各地環(huán)境、民族及生活習(xí)慣的影響，導(dǎo)致此類研究結(jié)果可重復(fù)性欠佳。近幾年由于宏基因組學(xué)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外開展的單個(gè)基因與LC患者預(yù)后的相關(guān)性分析較多，也充分揭示了人體特殊基因的激活以及表達(dá)水平與LC具有較高的相關(guān)性，且在同一人種中可重復(fù)性較好，這為構(gòu)建LC預(yù)后模型提供了較為準(zhǔn)確及便捷的途徑［5］。我們?cè)诩韧鵏C 宏基因組學(xué)研究［6］的基礎(chǔ)上，選取細(xì)胞骨架蛋白4（cytoskeletal protein 4，CKAP4）、N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2（polypeptide Nacetyl galactosamine transferase 2，pp-GalNAc-T2）、跨膜蛋白2（transmembrane protein2，TMEM2）等三個(gè)與LC預(yù)后相關(guān)度較高的基因，并結(jié)合患者的基本資料，分析LC 治療后復(fù)發(fā)的影響因素，并構(gòu)建LC治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)模型，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月—2017年12月期間于滄州市人民醫(yī)院確診的LC 患者80 例，年齡（63.74± 9.87）歲，男性69 例、女性11 例。所有患者根據(jù)文獻(xiàn)［7］當(dāng)中的推薦治療方案，按照患者腫瘤分期予以手術(shù)切除、放化療及靶向治療等方案進(jìn)行處理，并將治療方式納入臨床資料中在預(yù)后分析內(nèi)進(jìn)行對(duì)比?；颊咄瓿扇刊煶毯筮M(jìn)行隨訪，分別于治療后第1～2年內(nèi)每2～4 個(gè)月、治療后第3～5年內(nèi)每3～6 個(gè)月，治療后5年以上每12 個(gè)月到院復(fù)查。項(xiàng)目包括：①體格檢查；②病灶部位內(nèi)鏡檢查；③病灶部位影像學(xué)檢查；④放療患者甲狀腺功能檢查。隨訪截止日期為2022年6月31日。隨訪終點(diǎn)定義為復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)中華臨床腫瘤學(xué)會(huì)頒布的《頭頸部腫瘤診療指南2018》中相關(guān)推薦，由隨訪期間患者內(nèi)鏡及影像學(xué)檢查結(jié)果綜合評(píng)定，評(píng)定由3 名副主任以上職稱的醫(yī)師共同評(píng)定。統(tǒng)計(jì)到隨訪結(jié)束時(shí)所有患者LC 復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)等情況，并按照復(fù)發(fā)情況將所有患者分為復(fù)發(fā)組17 例、未復(fù)發(fā)組63 例［8］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NCCN 在2007 頒布的頭頸癌診療指南［7］；②年齡在18 周歲以上；③病史及隨訪資料完全；④患者或家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他惡性腫瘤疾??；②收集血液標(biāo)本前1月內(nèi)有嚴(yán)重感染、外傷及手術(shù)病史；③收集標(biāo)本前1年內(nèi)進(jìn)行過抗腫瘤、免疫抑制劑治療；④合并嚴(yán)重的肝腎功能障礙；⑤血液標(biāo)本保存過程不規(guī)范。

1.2 兩組患者基本資料收集及血清CKAP4、pp-GalNAc-T2、TMEM2 mRNA 檢測(cè) ①收集患者的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、吸煙史、飲酒史、LC 家族史、基礎(chǔ)疾病、腫瘤分期、腫瘤位置、腫瘤病理分型、腫瘤直徑、腫瘤浸潤(rùn)深度、治療方案等基本資料。②采用qRT-PCR 法檢測(cè)血清CKAP4、pp-Gal-NAc-T2、TMEM2 mRNA。首次建檔時(shí)抽取患者空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血5 mL，在3000 r/min 下離心15 min 并收集上清液，采用TRIzol 法提取總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取cDNA 作為熒光定量模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、44 s，總共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，以GAPDH 為對(duì)照。引物序列如下：CKAP4 正向引物為5′-CAGCCGGATCAGCGAAGT-3′，反向引物為5′-TGTGAAGATGGCGATGTTGT-3′；pp-Gal-NAc-T2 正向引物為 5′-AAGGAGAAGTCGGTGAAGCA-3′，反向引物為5′-TTGAGCGTGAACTTCCACTG-3′；TMEM2 正向引物為5′-GGAGATATGCTCCGTCTGACC-3′，反向引物為5′-CATCTGACTTGCCATACAAGGT-3′；GAPDH 正向引物為5′-CTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向引物為5′-GAACGCTTCACGAATTTGC-3′。以2-ΔΔCt表示血清目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以±s表示，比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)量資料呈非正態(tài)分布時(shí)以中位數(shù)［M（P25，P75）］表示，比較用采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。采用COX 回歸分析法分析LC 患者治療后復(fù)發(fā)的影響因素，采用Logistic 回歸分析法構(gòu)建LC 治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)模型，采用受試者工作特征曲線（ROC）評(píng)估預(yù)測(cè)模型對(duì)LC 治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LC 治療后復(fù)發(fā)的影響因素 復(fù)發(fā)組年齡（64.83± 13.72）歲，男性14 例、女性3 例，高血壓6例，糖尿病3 例，吸煙史12 例，飲酒史3 例，LC 家族史3 例，治療方案中采用放療14 例、化療5 例，腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期6 例、Ⅲ～Ⅳ期11 例，病理分型鱗癌16 例、其他類型1 例，腫瘤位置聲門上8 例、聲門4例、聲門下5例，腫瘤分化程度低分化7例、中高分化10 例，血清CKAP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量6.74± 1.47，血清pp-GalNAc-T2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量13.24±3.12，血清TMEM2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量1.98± 0.47，腫瘤直徑（20.37± 9.12）mm，浸潤(rùn)深度（2.04±0.43）mm；未復(fù)發(fā)組年齡（63.01± 9.56）歲，男性55例、女性8 例，高血壓20 例，糖尿病12 例，吸煙史53例，飲酒史13 例，LC 家族史15 例，治療方案中采用放療58 例、化療21 例，腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期44 例、Ⅲ～Ⅳ期19例，病理分型鱗癌60例、其他類型3例，腫瘤位置聲門上27 例、聲門15 例、聲門下21 例，腫瘤分化程度低分化12 例、中高分化51 例，血清CKAP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量5.75± 1.09，血清pp-Gal-NAc-T2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量11.18± 2.67，血清TMEM2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量1.69± 0.35，腫瘤直徑（19.04± 8.59）mm，浸潤(rùn)深度（1.95± 0.32）mm；其中復(fù)發(fā)組患者腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期占比、血清CKAP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量、血清pp-GalNAc-T2 mRNA相對(duì)表達(dá)量、血清TMEM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于未復(fù)發(fā)組（P均＜0.05）。

建立COX 回歸分析模型，以是否復(fù)發(fā)作為因變量，將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量，以無(wú)病生存時(shí)間作為時(shí)間變量，結(jié)果顯示血清CKAP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量、血清pp-GalNAc-T2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量、血清TMEM2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量是LC 患者治療后復(fù)發(fā)的影響因素（P均＜0.05），見表1。

表1 LC患者治療后復(fù)發(fā)的影響因素COX回歸分析結(jié)果

2.2 LC 治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)模型構(gòu)建及評(píng)估結(jié)果采用Logistic 回歸分析法按照預(yù)測(cè)概率=常量 + 系數(shù)×指標(biāo)的方法，構(gòu)建了LC治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)模型，預(yù)測(cè)概率=-8.967 + 0.724×血清CKAP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量 + 0.081×血清pp-GalNAc-T2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 + 1.132×血清TMEM2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。預(yù)測(cè)模型的ROC 結(jié)果顯示，該模型對(duì)于LC 治療后復(fù)發(fā)具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值（AUC=0.872，95%CI=0.779～0.962，Cut off 值≥0.229，P＜0.001），該模型預(yù)測(cè)LC 治療后復(fù)發(fā)的靈敏度為88.23%、特異度為79.36%、陰性預(yù)測(cè)值為96.13%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為53.57%，見圖1。

圖1 LC治療后復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型的ROC

3 討論

大多數(shù)LC起源于喉部深處，在病灶未顯著增大且影響吞咽的情況下很少有患者會(huì)被提前發(fā)現(xiàn)。因此，大約50%的病例被診斷出患有晚期疾病并在5年內(nèi)死于疾?。?］。當(dāng)早期對(duì)患者進(jìn)行全面評(píng)估同時(shí)針對(duì)性予以治療方案后，患者5年生存率提高到80%。近年來(lái)，伴隨著人類基因研究的逐漸深入，采用基因模型對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)后預(yù)測(cè)的效能相較于傳統(tǒng)的模型效果較好，且實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性較好，故目前將之運(yùn)用于臨床研究具有一定的可行性［10］。

在本研究中，患者總復(fù)發(fā)率為21.25%，而根據(jù)既往國(guó)內(nèi)外研究調(diào)查結(jié)果，LC 復(fù)發(fā)率在16%～40%，本次研究結(jié)果與之一致［11］。需要特別指出的是當(dāng)前的研究中指出，靶向治療對(duì)于中、晚期LC 患者預(yù)后具有較好的作用，但本研究中靶向治療率僅為15.8%，相較于相關(guān)研究占比相對(duì)較低，主要是由于本研究納入患者時(shí)間跨度相對(duì)較長(zhǎng)，前期患者可能由于研究、藥品等限制，導(dǎo)致無(wú)法有效開展靶向治療［12-13］。在基本資料的比較結(jié)果中，兩組患者腫瘤分期存在顯著差異。腫瘤分期是患者腫瘤大小、病灶侵襲程度、轉(zhuǎn)移范圍等相關(guān)情況綜合分析后得到的綜合情況，在所有腫瘤疾病中，腫瘤分期較晚患者相較于早期患者預(yù)后較差是必然，這一結(jié)果在多個(gè)研究中均得到了證實(shí)［14-15］。

在SHINNO 等［16-17］研究中指出，CKAP4 過表達(dá)與食管癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌等多種癌癥的復(fù)發(fā)相關(guān)，其中CKAP4 可以通過KK1/DKK3-CKAP4 信號(hào)軸影響PI3K/AKT 通路激活，促進(jìn)食管鱗狀癌細(xì)胞的增殖，而PI3K/AKT 通路對(duì)于LC 的分化增殖也具有關(guān)鍵性作用，故有研究提出抗CKAP4 抗體可能是一種新的腫瘤靶向治療藥物［18］。由以上敘述不難看出，罹患有LC 患者如果合并有CKAP4 高表達(dá)，必然會(huì)造成PI3K/AKT 通路過度激活，從而導(dǎo)致患者腫瘤復(fù)發(fā)，甚至發(fā)生其他腫瘤疾病，故CKAP4 與LC 直接存在有顯著的相關(guān)性。FERNANDES 等［19］的研究中指出，Ras-Raf-MEK-ERK 通路可以通過激活下游標(biāo)志物EGFR，從而成為頭頸部鱗癌發(fā)生的重要途徑，而高表達(dá)的pp-GalNAc-T2 進(jìn)一步增強(qiáng)Ras-Raf-MEK-ERK 的通路，從而導(dǎo)致EGFR 大量釋放入靶細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致LC 細(xì)胞侵襲擴(kuò)散。同時(shí)，還有研究指出，pp-GalNAc-T2 可通過調(diào)控作用來(lái)增強(qiáng)EGFR糖基化和活性，從而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的遷移和侵襲，故pp-GalNAc-T2 高表達(dá)會(huì)誘發(fā)LC 患者病灶復(fù)發(fā)、擴(kuò)散等，導(dǎo)致預(yù)后變差。而本研究中復(fù)發(fā)患者pp-GalNAc-T2 相對(duì)表達(dá)量高于未復(fù)發(fā)患者，與之前所述的研究結(jié)果類似［20］。TMEM2 的高表達(dá)狀態(tài)下可以通過促使JAK-2/STAT-3 通路的激活來(lái)促使乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)散，而與之相似的是JAK-2/STAT-3通路中的下游產(chǎn)物STAT-3 的表達(dá)和磷酸化是LC 細(xì)胞血管生成擬態(tài)的重要介質(zhì)［21］。在ZHANG 等［22］的研究中指出，抑制JAK-2/STAT-3 信號(hào)通路可顯著抑制LC 細(xì)胞體外侵襲和血管生成擬態(tài)，從而達(dá)到抑制LC 細(xì)胞生成及侵犯周圍組織的作用。從以上敘述中我們不難看出，TMEM2 的高表達(dá)狀態(tài)會(huì)促使LC 細(xì)胞進(jìn)一步分化并侵犯周圍組織，是導(dǎo)致LC復(fù)發(fā)的重要影響因素。而在本研究中，復(fù)發(fā)組患者TMEM2相對(duì)表達(dá)量顯著高于未復(fù)發(fā)組，這一結(jié)果與之前所述的研究類似。而后通過多因素分析結(jié)果也提示，上述3 個(gè)基因是LC 治療后復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素，也充分證實(shí)了通過多基因mRNA 建立預(yù)測(cè)模型的可行性，其相關(guān)度相較于腫瘤分期等指標(biāo)更具有說(shuō)服力。

本研究建立的預(yù)測(cè)模型針對(duì)LC 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)ROC結(jié)果相對(duì)理想，AUC接近0.9，說(shuō)明該模型用于預(yù)測(cè)LC 治療后復(fù)發(fā)具有較好的可行性。但是該模型的靈敏度及特異度均未超過90%，也說(shuō)明此模型尚具有一定的提升空間。既往研究［23］中指出，LC與患者吸煙及飲酒具有較高的相關(guān)性，但本研究中上述兩個(gè)問題并未被列為影響LC 的獨(dú)立因素。通過與該研究比較發(fā)現(xiàn)，由于本研究納入患者時(shí)間跨度較長(zhǎng)，同時(shí)患者例數(shù)相對(duì)較少，而上述兩個(gè)占比極易受到樣本量的影響導(dǎo)致差異。其次，本研究是單中心研究，地域及生活習(xí)慣等因素的影響并未納入考慮范疇，而進(jìn)食辛辣刺激及腌漬食物對(duì)于LC腫瘤的影響不容忽視。

綜上，血清CKAP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量、血清pp-GalNAc-T2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量、血清TMEM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量是LC患者治療后復(fù)發(fā)的影響因素，基于上述影響因素構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型對(duì)LC 治療后復(fù)發(fā)具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，但該模型仍需進(jìn)一步完善并進(jìn)行大規(guī)模驗(yàn)證后方可用于臨床。