MCC950 的作用靶點及其在中樞神經系統(tǒng)疾病治療中作用機制研究進展

洪詠日，姚寶珍

武漢大學人民醫(yī)院兒科，武漢 430000

核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體是一種多蛋白復合物，是近幾年研究最為廣泛的炎癥小體，它能被多種病原體如細菌、病毒等，或多種致病事件如線粒體功能障礙、活性氧產生等激活。NLRP3 炎癥小體的激活可誘導促炎反應的發(fā)生，消除致病物質以維持機體的健康。然而，NLRP3 炎癥小體的過度激活可導致多種疾病，目前已經發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)生發(fā)展與NLRP3 激活以及下游炎癥因子的釋放有關，如動脈粥樣硬化、痛風和肥胖等［1-3］，同時NLRP3 炎癥小體介導的神經炎癥是中樞神經系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素［4］。隨著對疾病中NLRP3炎癥小體激活和調節(jié)機制的深入研究，靶向抑制NLRP3 炎癥小體是疾病治療的重要策略。MCC950 也稱為CP-456，773，是一種含二芳基磺酰脲的化合物。2001年，PERREGAUX 等［5］在脂多糖活化的單核細胞和巨噬細胞中添加一種二芳基磺酰脲化合物后發(fā)現(xiàn)IL-1β 含量下降，且IL-6 和腫瘤壞死因子-α 不受影響。因此，他首次將這種化合物命名為CRIDs，并定義為IL-1β的拮抗劑。COLL 等［6］進一步的研究才發(fā)現(xiàn)，CRID3通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活來減少IL-1β 的成熟和釋放，并將其重新命名為MCC950。MCC950 是一種特異性的小分子抑制劑，可以透過血腦屏障選擇性地阻斷NLRP3炎癥小體的激活，減少下游IL-1β的成熟和釋放。目前已有研究［7］表明，MCC950對中樞神經系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病以及代謝性疾病有治療作用，多項關于MCC950 的臨床研究也已經開展。近年來，對MCC950 的研究不斷擴大，其作用靶點逐漸被闡明，且在治療多種中樞神經系統(tǒng)疾病方面顯示出良好的療效，如帕金森?。≒arkinson's disease，PD）、阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease，AD）、創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）、癲癇等，MCC950 通過抑制NLRP3/IL-1β通路的激活來減輕炎癥反應從而治療疾病。我們綜述了MCC950 的作用靶點及其在中樞神經系統(tǒng)疾病治療中作用機制研究進展，以期為MCC950 的進一步研究和應用提供相關見解，為治療NLRP3 激活相關疾病提供新思路和治療靶點。

1 MCC950的作用靶點

NLRP3 炎癥小體由傳感器分子NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和效應器半胱天冬酶-1前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1，procaspase-1）組成。NLRP3 包含一個N 端吡啶結構域（pyrin domain，PYD）、一個核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding and oligomerization domain，NACHT）和一個C 末端富含亮氨酸的重復序列（leucine-rich repeat，LRR）。當NLRP3 激活后，其N 端PYD 識別并結合ASC 的PYD，募集ASC 和pro-Caspase-1，從而形成NLRP3 炎癥小體［8］。NLRP3 炎性小體的活化分兩步完成：啟動和激活兩個階段。啟動階段：當機體受到傷害時，在病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）等作用下，通過IL-1β 和腫瘤壞死因子-α 等細胞因子介導Toll 樣受體（Toll like receptors，TLR）或腫瘤壞死因子受體（Tumor necrosis factor receptor，TNFR）激活核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路，導致NLRP3 轉錄與表達升高［9］。激活階段：NLRP3和募集的ASC、pro-caspase-1組裝成穩(wěn)定的復合物，切割pro-caspase-1 成為具有活性的caspase-1，該分子繼而促進IL-1β 與IL-18 成熟和分泌，且使Gasdermin D 裂解成片段并穿透細胞引發(fā)細胞焦亡［10］。由于NLRP3 炎癥小體激活過程復雜，MCC950 抑制NLRP3 炎性小體激活的具體作用靶點尚不明確，但目前的普遍共識是MCC950 不作用于NLRP3 炎癥體激活的啟動階段，而是作用于NLRP3炎癥小體激活組裝階段［6］。

1.1 NIMA 相關蛋白7（NIMA-related kinase 7，NEK7） NEK7 是一種有絲分裂所必需的中心體蛋白。有研究［11］表明，NEK7 是鉀外流的感受器，鉀外流導致NEK7 與NLRP3 結合，并募集凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing， ASC）以完成炎性體的組裝。因此，鉀外流、NEK7 和NLRP3 三者之間的相互作用最開始被認為是MCC950 的潛在靶點。后續(xù)COLL 等［6］發(fā)現(xiàn)，MCC950 抑制巨噬細胞中IL-1β 釋放卻不影響鉀離子流出，表明MCC950 并不影響鉀外流過程。XU等［12］通過對肺組織裂解物進行蛋白質免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，MCC950 抑制了NLRP3 和NEK7 之間的結合，提示NLRP3 和NEK7 相互作用為MCC950 的潛在作用靶點。NEK7 依賴活性氧的磷酸化，能增強NEK7 和NLRP3 之間的相互作用，從而促進NLRP3 炎癥體的激活［11］。使用活性氧的抑制劑N-乙酰半胱氨酸可阻斷NEK7 的磷酸化，從而阻礙NEK7 與NLRP3 的相互作用及下游IL-1β 的產生。然而，在PERERA等［13］研究中發(fā)現(xiàn)，MCC950 并不影響NEK7 的磷酸化。因此目前MCC950 影響NEK7 和NLRP3 之間相互作用的確切機制尚有待進一步研究。

1.2 ASC ASC 是NLRP3 炎癥小體的重要組成部分，位于炎癥小體的中心。它屬于二分蛋白質，包含一個N 末端的熱蛋白樣結構域（PYD）和C 末端的含胱天蛋白募集域（caspase activation and raise domain，CARD），PYD和CARD是同源的蛋白—蛋白相互作用結構域，兩者介導ASC 的寡聚并以此來放大炎癥信號［14］。此外，在NLRP3 炎癥小體的組裝過程中，ASC 通過PYD 與NLRP3 的PYD 相互作用，ASC的CARD 負責招募效應器pro-caspase-1 并與之結合［15］。一項研究［6］發(fā)現(xiàn)，MCC950抑制了尼日利亞菌誘導的ASC的寡聚，用50 μmol/L的MCC950處理經NLRP3 和ASC 轉染后的T 細胞，再將其進行免疫共沉淀，結果發(fā)現(xiàn)MCC950 并不影響NLRP3 與ASC 之間的相互作用，表明MCC950 抑制NLRP3 誘導的ASC 的寡聚，但不影響NLRP3 與ASC 之間的相互作用。值得注意的是，有研究［16］發(fā)現(xiàn)，MCC950 能夠阻斷骨髓細胞中NLRP3 炎癥小體通路。然而，人類外周血單核細胞中NLRP3 炎癥小體的形成并不依賴于ASC 的寡聚。因此，MCC950 的作用并不只局限于抑制ASC 的寡聚，后續(xù)還需要進一步的研究來確定MCC950作用于ASC的確切分子機制。

1.3 氯離子 VERHOEF 等［17］報道，細胞外氯離子濃度的改變會影響由ATP 刺激所引起的Caspase-1的激活和下游IL-1β 的產生。氯離子細胞內通道（chloride intracellular channels， CLICs）是炎癥反應過程中氯離子外流的關鍵陰離子通道。GREEN等［18］的研究表明，抑制CLICs 可阻斷ASC 寡聚和炎性小體組裝。TANG 等［19］發(fā)現(xiàn)，CLICs 的拮抗劑能夠阻礙NEK7-NLRP3-ASC 復合體的相互作用。以上均表明，通過CLICs 的氯離子外流在ASC 寡聚和炎性小體的組裝中起著重要的作用。研究［20］發(fā)現(xiàn)，MCC950 可以阻止ASC 的寡聚，但不能阻止鉀外流、腫瘤壞死因子-α 的分泌、AIM2 或NLRC4 的激活；與之相似地是，抑制氯離子外流影響ASC 的寡聚，但對鉀離子外流、腫瘤壞死因子-α 的分泌、NLRP3 和Caspase-1 mRNA 的表達沒有影響。因此，MCC950對ASC 寡聚的抑制作用可能與其抑制氯離子外流有關，CLICs 及其上游也可能是MCC950 的靶點，這種可能性及其機制需要進一步探索。

1.4 NACHT中的Walker B 基序 NLRP3的中心結構域—NACHT 介導的自我寡聚在NLRP3 炎癥小體的組裝中發(fā)揮重要作用［8］。在一項光親和標記實驗［21］中發(fā)現(xiàn)，MCC950 競爭性地抑制探針與NLRP3的結合，提示MCC950與NLRP3的直接作用。COLL等［6］研究發(fā)現(xiàn)，無論NLRP3 處于何種激活狀態(tài)，MCC950 都會直接和NLRP3 特異性結合，并且這種高親和力、可逆的非共價相互作用發(fā)生在NLRP3 的NACHT中的Walker B位點處，NLRP3激活過程中結構會發(fā)生重排，產生更“開放”的構象。在TAPIAABELLáN 等［22］的研究中發(fā)現(xiàn)，MCC950 通過與Walker B 基序相互作用，來阻止ADP-ATP 交換，并將炎癥復合體鎖定為“封閉的”非活性構象，從而抑制下游炎癥體的組裝。綜上，NLRP3 中NACHT 結構域中的Walker B 基序是MCC950 的重要作用靶點之一。

2 MCC950 在中樞神經系統(tǒng)疾病治療中的作用機制

神經炎癥是中樞神經系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的重要組成部分，過度的神經炎癥會導致神經元死亡、加劇神經系統(tǒng)疾病的發(fā)展。NLRP3 炎癥小體介導的炎癥在神經損傷的病理過程中起著關鍵的作用，MCC950通過抑制不同通路中NLRP3的激活以阻斷神經炎癥的發(fā)生，從而成為治療疾病的新靶標，至今已在多種神經系統(tǒng)疾病模型中看到MCC950 的療效。

2.1 MCC950在PD治療中的作用機制 PD是一種神經退行性病變，以黑質中多巴胺能神經元的嚴重喪失為特征，且伴有慢性神經炎癥、線粒體功能障礙以及α-突觸核蛋白聚集體的病理性累積。研究［23］表明，α-突觸核蛋白聚集體介導NLRP3 炎癥小體的激活，導致慢性炎癥反應，最終驅動神經元變性、丟失。GORDON 等［24］發(fā)現(xiàn)，PD 患者腦黑質組織中NLRP3 炎癥小體組成部分NLRP3、ASC、Caspase-1 升高，并與反應性小膠質細胞共定位；隨后在PFF小鼠模型—一種模擬α-突觸核蛋白病理的動物模型中發(fā)現(xiàn)，在神經病理早期階段能檢測到NLRP3 炎癥小體，而動物口服MCC950 能減弱NLRP3 炎癥小體的激活以及Caspase-1、IL-1β 的活化，并減少PFF 小鼠黑質紋狀體中過度磷酸化的α-突觸核蛋白聚集體的量；與對照組相比，MCC950 處理的小鼠多巴胺代謝物DOPAC 的含量、陽性神經元數(shù)量更高，在平衡木、懸線等運動實驗中MCC950 組小鼠表現(xiàn)更好；這些結果表明，MCC950 通過抑制NLRP3/IL-1β 通路來減輕炎癥反應，從而保護多巴胺能神經元，改善PD。CHENG 等［25］建立Atg5 敲除小鼠模型以模擬與PD 相關的行為學和病理學改變，證實小膠質細胞自噬缺陷導致NLRP3 炎癥小體通過激活PDE10AcAMP 信號通路，上調下游IL-1β，導致巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的表達增加，進一步驅動炎癥反應；而小分子抑制劑MCC950 可顯著抑制NLRP3 炎癥小體的激活，減少了MIF的表達和神經炎癥水平，并緩解了小鼠腦黑質中TH 神經元的損傷。因此，MCC950 有望繼續(xù)成為一種新的治療手段來治療PD。

2.2 MCC950 在AD 治療中的作用機制 AD 是一種最常見的神經退行性疾病，患者會發(fā)生記憶喪失和認知功能衰退。目前已知的AD 的病理生理學特征包括細胞外淀粉樣蛋白-β（amyloid-β，Aβ）的積累、細胞內高磷酸化tau 蛋白的過度表達、神經纖維纏結和和慢性神經炎癥［26］。近年來，越來越多證據(jù)表明NLRP3炎癥小體在AD 的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。研究［27］發(fā)現(xiàn)，Aβ 可以激活小膠質細胞、星形膠質細胞中的NLRP3 炎癥小體，導致下游促炎因子IL-1β 和IL-18 釋放，并在疾病發(fā)生發(fā)展過程中持續(xù)激活，最終導致神經功能障礙。FEKETE 等［28］通過給大鼠腦室輸注Aβ 寡聚體建立AD 模型，在Aβ寡聚體輸注4 周后可觸發(fā)小膠質細胞激活，并檢測到NF-κB/NLRP3 通路的活化。此外，Aβ 誘導后下調Esr1、Scn1a 基因會干擾抑制性中間神經元的功能，導致神經功能障礙。隨后研究者給予大鼠長達四周的MCC950 治療，治療后大鼠體內IL-1α、TNF-α、IL-10 和IFN-γ 水平下降。Cd86 的轉錄是小膠質細胞表型調節(jié)的關鍵參與者，在MCC950 治療后小膠質細胞上此受體的表達減少，并逆轉了Esr1和Scn1a 基因的下調。在空間記憶的行為學實驗中，MCC950 組相比于對照組表現(xiàn)更好。以上結果提示，MCC950 通過阻斷NLRP3 炎癥小體激活逆轉Aβ誘導的體內炎癥反應的發(fā)生來改善AD。有研究表明，NLRP3 炎癥小體的激活是連接免疫功能、炎癥和新陳代謝的關鍵點。在FINUCANE 等［29］建立的AD 體外模型中，用LPS 和Aβ 刺激巨噬細胞可促進磷酸果糖-2 激酶/果糖-2，6-雙磷酸酶3（PFKFB3）的表達增加，并促進相關代謝重編程，轉向促進糖酵解的表型，此轉變有助于炎癥小體的活化；加入MCC950 后減少了巨噬細胞中PFKFB3 的表達、IL-1β 的活化，逆轉其向糖酵解的代謝轉變；表明MCC950 通過抑制NLRP3 炎癥小體介導的IL-1β-PFKFB3 軸，從而對糖酵解產生影響。綜上，MCC950 可以在不同情況下抑制NLRP3炎癥小體的激活來阻斷AD 相關病理變化，在AD 的治療中具有潛在的應用前景。

2.3 MCC950 在TBI 治療中的作用機制 TBI 是全球人口死亡和殘疾的最常見原因之一。TBI 可導致應激障礙、慢性神經炎癥和慢性創(chuàng)傷性腦病，其中炎癥反應是TBI 后繼發(fā)性腦損傷的重要病理機制之一。研究［30］報道，在損傷腦組織的神經元神經膠質細胞中檢測到NLRP3 炎癥小體，其可誘導神經炎癥反應和神經元死亡，加重腦神經組織的損傷，在TBI的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。在ISMAEL 等［31］構建的TBI 小鼠模型中，經MCC950 處理后可改善小鼠TBI 后72 h 神經嚴重程度的評分，減少Caspase-1、IL-1β 的產生，同時腦組織中凋亡相關蛋白PARP 和Caspase-3 活化顯著降低，提示MCC950 阻斷TBI 病灶處的神經凋亡來產生神經保護作用。XU 等研究［32］發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體在腦外傷后表達增加，并主要分布于小膠質細胞中；經MCC950 處理后小膠質細胞中NLRP3 的免疫熒光染色顯著降低；此外，MCC950 的應用具有神經保護作用，具體表現(xiàn)為腦水腫和病灶面積減少，運動和認知功能得到顯著改善，并證明MCC950 的神經保護作用機制與白細胞募集受阻、小膠質細胞活化水平降低及相關的致炎細胞因子產生減少有關；在研究中，MCC950 還可逆轉由腦外傷所致緊密連接claudin-1、ZO-3、TJ 的下降，提示MCC950 有助于維護血腦屏障的完整性。在CHEN 等［33］構建的機械創(chuàng)傷模型中，損傷發(fā)生3 h后檢測到NLRP3 炎癥小體mRNA 和蛋白表達升高，將MCC950 與雷帕霉素聯(lián)合應用后NSS 評分、TUNEL 染色陽性面積均下降50%以上，TBI 后腦含水量從81.97%降至75.00%，提示MCC950 具有神經保護作用。此外，研究者采用體外OGD/R 模型（葡氧剝奪模型）模擬TBI后的缺氧環(huán)境，暴露于OGD后神經元中NLRP3、IL-1β mRNA 表達水平上升，LDH釋放和ROS 含量升高，并呈現(xiàn)時間依賴性，提示炎癥發(fā)生與線粒體損傷；MCC950 與雷帕霉素聯(lián)合應用后經CoIP 檢測發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體組成部分及炎癥介質表達減少，LDH 和ROS 含量降低，表明MCC950與雷帕霉素的協(xié)同作用有利于OGD 模型中神經元的線粒體功能恢復。

2.4 MCC950 在癲癇治療中的作用機制 癲癇是一種由腦部神經元異常放電所致的臨床綜合征，是最常見的嚴重慢性腦部疾病之一，影響全球超過7000 萬人，目前原因尚未完全明確。近年來，越來越多的證據(jù)［34］表明神經炎癥可增強神經元興奮性，促進癲癇發(fā)作。有文獻［35］報道，難治性顳葉癲癇患者外周血IL-1β、腦皮質NLRP3 的表達水平高于對照組。另外，近期一項研究［36］表明，NLRP3 炎癥小體通過調節(jié)環(huán)磷酸腺苷效應元件結合蛋白/SP1 轉錄因子通路來增強腺苷激酶（ADK）的表達，從而加速小鼠癲癇的發(fā)生發(fā)展，表明NLRP3 與癲癇發(fā)病機制關系極為密切。SHEN 等［35］將人神經母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞暴露于游離Mg2+溶液以模擬癲癇細胞模型，發(fā)現(xiàn)模型建立后NLRP3 炎癥小體的表達會增加，用MCC950 處理后NLRP3 炎癥小體表達降低，神經元丟失被顯著抑制，神經元凋亡減輕。在YUE 等［37］收集的人類顳葉皮層組織的灰質神經元內中通過免疫組化檢測到NLRP3、ASC 和Caspase-1的產生，并與GRP2、PERK、p-PERK、eIF4α、peIF2α、ATF2 和CHOP 等內質網應激標志物共定位，在給小鼠注射毛果蕓香堿前用50 mg/kg 劑量的MCC950 進行預處理，模型建立后進行免疫熒光和蛋白質印記分析，結果發(fā)現(xiàn)MCC950 逆轉炎癥因子和內質網應激標志物的產生。內質網應激被認為是細胞凋亡的主要觸發(fā)因素，神經元凋亡和丟失可能以導致癲癇的發(fā)生和發(fā)展。而MCC950 治療可以削弱內質網應激，從而對癲癇產生治療作用。

綜上所述，NLRP3 炎癥小體是目前研究最為深入的炎癥小體，參與多種中樞神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，NLRP3 炎癥小體激活后經過一系列的級聯(lián)反應，釋放大量的炎癥介質，促進疾病進展。因此，在未來的研究中，MCC950 治療疾病的作用機制及臨床作用需要繼續(xù)探索。