大麻二酚灌胃對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化改善作用及其機(jī)制

張飛宇，孫夢(mèng)迪，楊慧聰，盧芳，于棟華，劉樹民

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，哈爾濱 150040；2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院

肺纖維化（pulmonary fibrosis， PF）是一種由反復(fù)炎癥反應(yīng)引起的以成纖維細(xì)胞增生、大量細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix， ECM）沉積、肺組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的間質(zhì)性肺疾?。?］，表現(xiàn)為肺順應(yīng)性下降、氣體交換障礙、呼吸困難、活動(dòng)耐量下降，嚴(yán)重時(shí)可引起呼吸衰竭甚至死亡。細(xì)胞焦亡又稱細(xì)胞炎性壞死，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。研究［2］顯示，細(xì)胞焦亡能誘發(fā)肺部炎癥反應(yīng)和肺纖維化的進(jìn)展。肺纖維化可發(fā)生于任何年齡段，多見于45～70 歲中老年人，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)［3］。近年來上市的吡非尼酮［4］和尼達(dá)尼布［5］，不良反應(yīng)較多［6］且價(jià)格昂貴，迫切需要尋找預(yù)防和治療肺纖維化的有效藥物。大麻二酚（Cannabidiol，CBD）是提取自植物漢麻葉和花的一種非精神活性成分［7］，分子式為C21H30O2，具有保護(hù)神經(jīng)［8］、抗焦慮［9］、抗炎［10］、抗氧化［11］、抗腫瘤［12］、改善失眠［13］、提高皮膚自我修復(fù)力［14］等多方面的作用。全球多個(gè)國家已經(jīng)把CBD 批準(zhǔn)為藥用或食品添加劑，我國云南、黑龍江已對(duì)漢麻的種植和銷售合法化［15］。2018年7月，美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)了第一種含有CBD 的處方藥Epidiolex，用于兒童難治性癲癇的治療［16］。近年來研究發(fā)現(xiàn)CBD 具有抗器官纖維化的作用，2022年3—7月，我們觀察了大麻二酚灌胃對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化改善作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 CBD、小鼠、試劑與儀器 CBD 購自西安綠如泉生物科技有限公司。SPF 級(jí)Balb/c 小鼠60 只，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，體質(zhì)量18～20 g，8 周齡，許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究院動(dòng)物室，自由進(jìn)食飲水，溫度22℃～26℃，相對(duì)濕度在55%～65%之間，晝夜循環(huán)，保持12 h光照。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)2022032901。博來霉素購自索萊寶生物科技有限公司，醋酸潑尼松片購自浙江仙琚制藥股份有限公司。羥脯氨酸（Hydroxyproline， HYP）試劑盒、涎液化糖鏈抗原-6（Krebs Von den Lungen-6， KL-6）試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶-7（Matrix metalloproteinase-7，MMP-7）試劑盒、IL-1β 試劑盒、IL-18 試劑盒均購自上海研抗生物科技有限公司。Tecan 酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan 公司；高速冷凍離心機(jī)購自安徽科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；Haier-80℃冰箱購自Haier 公司；Nikon Eclipse Ci-L 型正置白光拍照顯微購自日本Nikon 公司；超聲振蕩器購自昆山市超聲儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱購自杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；病理組織漂烘儀購自常州中威電子儀器廠；萊卡轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)購自德國萊卡公司；包埋機(jī)購自常州中威電子儀器廠；全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)購自常州中威電子儀器廠；Myi QTM Optics Module 單色Real-time PCR 檢測(cè)系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 肺纖維化小鼠模型制備、分組、CBD 給予方法 實(shí)驗(yàn)第1 天，60 只Balb/c 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天后，用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組，每組10 只。模型組、潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組小鼠腹腔注射博來霉素（2 mg/mL）35 mg/kg，每周2 次，連續(xù)4 周，制作肺纖維化小鼠模型；對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水，每周2次，連續(xù)4周。將醋酸潑尼松片用生理鹽水溶解成混懸液備用（1 mg/mL），CBD 用玉米油溶解備用（1 mg/mL、3 mg/mL、9 mg/mL）。實(shí)驗(yàn)第29天，潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組分別以潑尼松（12 mg/kg）、CBD（12 mg/kg、36 mg/kg、108 mg/kg）進(jìn)行灌胃，每天1 次，連續(xù)28天。模型組、對(duì)照組灌入同體積生理鹽水。

1.3 各組小鼠肺組織病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)第56 天，麻醉處死小鼠后取肺組織，左肺組織用4%多聚甲醛浸泡24 h以上，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理后以石蠟包埋。將石蠟切片切成4 μm厚的切片，脫蠟后置于梯度乙醇中浸泡處理，用蘇木精伊紅（HE）試劑盒、馬松（Masson）試劑盒染色后，生理鹽水漂洗1次，再次經(jīng)脫水、透明后封片，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.4 各組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴(yán)重程度評(píng)分 ①根據(jù)SZAPIEL 等的方法對(duì)各組小鼠肺泡炎嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。0 分：無肺泡炎，肺組織正常；1 分：輕度肺泡炎，單核細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增厚，病變局限于胸膜下，病變范圍＜20%；2 分：中度肺泡炎，炎癥病變主要位于胸膜下，病變范圍為20%～50%；3 分：重度肺泡炎，炎癥病變彌漫，病變范圍＞50%。②根據(jù)HUBNER 等的方法對(duì)各組小鼠肺纖維化嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。0 分：肺泡結(jié)構(gòu)正常、無膠原沉積；1 分：散在少量膠原沉積灶，肺泡間隔厚度≤3 倍正常值，部分肺泡腔擴(kuò)大，肺泡壁變薄，但無成團(tuán)肺纖維化；2 分：肺泡間隔厚度＞3 倍正常值，明顯的膠原沉積，并伴有繩結(jié)樣改變，但病變未融合，部分肺泡腔擴(kuò)大，肺泡壁變薄，但無成團(tuán)肺纖維化；3 分：連續(xù)肺纖維化，肺泡間隔厚度＞3 倍正常值，部分肺泡腔擴(kuò)大，肺泡壁變?。? 分：?jiǎn)蝹€(gè)成團(tuán)膠原沉積灶，病灶范圍＜10%視野；5 分：融合成團(tuán)肺纖維化灶，病灶范圍10%～50%視野，肺形態(tài)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損但還能依稀可見；6 分：大片融合成團(tuán)肺纖維化灶，病灶范圍＞50%視野，大部分肺泡間隔消失，大部分肺結(jié)構(gòu)毀損；7 分：肺泡內(nèi)幾乎充滿成片的纖維組織，肺泡間隔消失，但仍可見至少5個(gè)氣泡樣改變；8 分：滿視野成團(tuán)的纖維組織。

1.5 各組小鼠肺組織HYP 及肺纖維化診斷生物標(biāo)志物檢測(cè) ①稱取200 mg 的Balb/c 小鼠肺組織，加入2 mL 的組織提取液，置于110 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱，水解6～12 h，用提取液定容至2 mL，4 ℃條件下12000 g 離心20 min，取上清，根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)HYP。②末次給藥后3 h，麻醉小鼠，經(jīng)腹部心臟采血，室溫下自然放置30 min 凝固，4 ℃條件下3000 r/min 離心20 min，仔細(xì)吸取上清，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書操作檢測(cè)肺纖維化診斷生物標(biāo)志物KL-6、MMP-7。

1.6 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 及血清IL-1β、IL-18檢測(cè) ①小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 檢測(cè)采用Real-time PCR 法。取肺組織，按照試劑盒說明書TRIzol 法提取總RNA 后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Real-time PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH 為內(nèi)參基因，每個(gè)目的基因的待測(cè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火31 s，40 個(gè)循環(huán)，95 ℃擴(kuò)增15 s。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。②小鼠血清IL-1β、IL-18 檢測(cè)采用ELISA 法，檢測(cè)步驟參照“1.5”。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)比較 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺組織及肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰，肺泡壁與肺泡間隔形態(tài)完整，無滲出物，未變厚，無炎性細(xì)胞浸潤和充血水腫；模型組小鼠肺組織病理變化主要為肺泡炎，肺泡壁和肺間質(zhì)大量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，嚴(yán)重的有膿腫灶出現(xiàn)，肺泡間隔變厚，血管炎病變和局灶肺水腫，少量肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞滲出等；潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，炎性細(xì)胞浸潤情況不同程度減輕。Masson 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁及血管壁膠原纖維排列規(guī)整；模型組肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺泡壁增厚，其中膠原纖維明顯增多，結(jié)構(gòu)排列紊亂，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，部分肺泡腔內(nèi)有滲出；潑尼松組、CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD高劑量組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，肺泡壁增厚、肺泡腔內(nèi)滲出、膠原纖維含量及排列情況呈不同程度減輕。

2.2 各組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴(yán)重程度評(píng)分比較 ①對(duì)照組鼠肺泡炎、肺纖維化嚴(yán)重程度評(píng)分為（0.73± 0.49）分、（0.94± 0.66）分，模型組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴(yán)重程度評(píng)分為（2.32± 0.58）分、（2.92± 1.02）分，兩組相比，P均＜0.05。②各組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴(yán)重程度評(píng)分見表1。由表1可知，與模型組相比，CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組、潑尼松組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴(yán)重程度評(píng)分均降低（P均＜0.05），且CBD各劑量組之間有劑量依賴性（P均＜0.05），CBD 高劑量組與潑尼松組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 各組小鼠肺泡炎、肺纖維化嚴(yán)重程度評(píng)分比較（分，-x± s）

2.3 各組小鼠肺組織HYP 及血清KL-6、MMP-7 水平比較 ①對(duì)照組小鼠肺組織HYP 及血清KL-6、MMP-7 水平分別為（11.82± 2.21）μg/mg、（287.19± 121.36）pg/mL、（19.21± 2.07）pg/mL，模型組小鼠肺組織HYP及血清KL-6、MMP-7水平分別為（27.17± 1.50）μg/mg、（354.43± 185.19）pg/mL、（38.84± 2.04）pg/mL，兩組相比，P均＜0.05。②各組小鼠肺組織HYP 及血清KL-6、MMP-7水平比較見表2。由表2 可知，與模型組相比，CBD低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組、潑尼松組小鼠肺組織HYP 及血清KL-6、MMP-7 水平均降低（P均＜0.05），且CBD 各劑量組之間有劑量依賴性（P均＜0.05），CBD 高劑量組與潑尼松組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表2 各組小鼠肺組織HYP、血清KL-6、MMP-7水平比較（±s）

表2 各組小鼠肺組織HYP、血清KL-6、MMP-7水平比較（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與CBD 低劑量組相比，#P＜0.05；與CBD中劑量組相比，△P＜0.05。

MMP-7（pg/mL）38.84± 2.0434.52± 2.69*31.48± 1.61*#26.97± 1.95*#△25.79± 1.71*#△組別模型組CBD低劑量組CBD中劑量組CBD高劑量組潑尼松組HYP（μg/mg）27.17± 1.5024.48± 1.95*22.46± 1.24*#20.73± 1.69*#△20.36± 2.35*#△KL-6（pg/mL）354.43± 185.19346.78± 179.82*313.29± 133.21*#294.24± 125.28*#△306.67± 149.83*#△

2.4 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對(duì)表達(dá)量及血清IL-1β、IL-18水平比較檢測(cè)

2.4.1 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 ①對(duì)照組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.83± 0.11、0.82± 0.11、0.88± 0.25、0.72±0.14、0.77± 0.13，模型組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為2.10± 0.11、2.16± 0.14、2.42±0.26、2.15± 0.15、2.20± 0.16，兩組相比，P均＜0.05。②各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見表3。由表3可知，與模型組相比，CBD 低劑量組、CBD中劑量組、CBD高劑量組、潑尼松組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對(duì)表達(dá)量均降低（P均＜0.05），且CBD 各劑量組之間有劑量依賴性（P均＜0.05），CBD 高劑量組與潑尼松組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表3 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與CBD低劑量組相比，#P＜0.05；與CBD中劑量組相比，△P＜0.05。

組別模型組CBD低劑量組CBD中劑量組CBD高劑量組潑尼松組Gasdermin D mRNA 2.20± 0.161.92± 0.11*1.71± 0.14*#1.49± 0.16*#△1.56± 0.11*#△NF-κB p65 mRNA 2.10± 0.111.79± 0.13*1.63± 0.08*#1.50± 0.11*#△1.48± 0.12*#△NLRP3 mRNA 2.16± 0.141.98± 0.12*1.81± 0.10*#1.45± 0.19*#△1.62± 0.20*#△ASC mRNA 2.42± 0.262.03± 1.51*1.83± 0.09*#1.67± 0.12*#△1.58± 0.16*#△Caspase-1 mRNA 2.15± 0.151.94± 0.07*1.73± 0.17*#1.47± 0.22*#△1.66± 0.14*#△

2.4.2 各組小鼠血清IL-1β、IL-18 水平比較 ①對(duì)照組小鼠血清IL-1β、IL-18 水平分別為（11.13±1.79）pg/mL、（19.58± 1.44）pg/mL，模型組小鼠血清IL-1β、IL-18 水平分別為（24.49± 1.78）pg/mL、（28.31± 2.08）pg/mL，兩組相比，P均＜0.05。②各組小鼠血清IL-1β、IL-18 水平比較見表4。由表4 可知，與模型組相比， CBD 低劑量組、CBD 中劑量組、CBD 高劑量組、潑尼松組小鼠血清IL-1β、IL-18水平水平均降低（P均＜0.05），且CBD各劑量組之間有劑量依賴性（P均＜0.05），CBD 高劑量組與潑尼松組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表4 各組小鼠血清IL-1β、IL-18水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組小鼠血清IL-1β、IL-18水平比較（pg/mL，±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與CBD 低劑量組相比，#P＜0.05；與CBD中劑量組相比，△P＜0.05。

IL-1828.31± 2.0825.35± 0.88*23.49± 1.58*#20.97± 1.24*#△21.64± 1.35*#△組別模型組CBD低劑量組CBD中劑量組CBD高劑量組潑尼松組IL-1β 24.49± 1.7821.77± 1.56*19.87± 1.38*#15.48± 1.97*#△17.90± 1.87*#△

3 討論

博來霉素是一種化療藥物，因肺組織中酰胺酶活性低，博來霉素代謝較慢，具有明顯的肺毒性，其與鐵離子形成的復(fù)合物嵌入DNA 后引起DNA 鏈的斷裂［17］。因博來霉素引起的癥狀、肺功能變化和影像學(xué)改變與肺纖維化較為相似，是肺纖維化實(shí)驗(yàn)中最常用的造模藥物。本實(shí)驗(yàn)通過多次腹腔注射博來霉素發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織HE 染色、Masson 染色結(jié)果相對(duì)于對(duì)照組出現(xiàn)了明顯的肺泡炎和肺纖維化病變，表明多次腹腔注射博來霉素法可以制作小鼠肺纖維化模型，這與蘇敏紅等［18］研究結(jié)果一致。依據(jù)SZAPIEL肺泡炎評(píng)分法和HUBNER 肺纖維化評(píng)分法，評(píng)分結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于模型組，各給藥組肺泡炎程度如肺泡壁和肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、局灶肺水腫、肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞滲出等情況和肺纖維化程度如膠原纖維明顯增多、結(jié)構(gòu)排列紊亂、肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張等情況均不同程度緩解，且CBD 的緩解作用呈劑量依賴性。

肺纖維化是由多種致病因素引起的反復(fù)創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，造成肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖及大量ECM 異常增生，最終導(dǎo)致肺泡空間結(jié)構(gòu)破壞、肺血管重塑、肺硬度的增加［19］。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，在各種刺激因素作用下可通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化逐漸轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，大量分泌膠原蛋白，導(dǎo)致肺間質(zhì)膠原蛋白含量增多、肺組織收縮、變硬。膠原蛋白是ECM 的主要成分，膠原蛋白含量增加引起ECM 重構(gòu)是纖維化的最重要表現(xiàn)形式。HYP 是膠原蛋白中特有的一種亞氨基酸，來源固定的膠原蛋白其含量穩(wěn)定，是衡量膠原蛋白的標(biāo)尺，HYP 含量的變化可以間接反應(yīng)組織膠原蛋白的含量［20］，是衡量纖維化程度的重要指標(biāo)。我們研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺組織HYP 含量相對(duì)于對(duì)照組明顯升高，表明博來霉素引起了肺組織纖維蛋白含量增加，是肺纖維化發(fā)生的直接證據(jù)。各給藥組肺組織HYP含量均有所下降，且CBD 的緩解作用呈劑量依賴性，這與Masson染色結(jié)果相互印證。

KL-6 在退變的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，是判斷Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞功能的特異性指標(biāo)。KL-6在肺部基底膜受損，血管通透性增加時(shí)可導(dǎo)致KL-6入血，血清中KL-6能敏感地反應(yīng)肺泡上皮和間質(zhì)的損傷程度，其含量與損傷程度正相關(guān)，已被多國確定為肺纖維化診斷與判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物［21］。MMP-7在肺組織損傷階段，可降解基底膜和ECM 成分；在修復(fù)階段，引起異常的組織重構(gòu)，從而引起肺泡結(jié)構(gòu)的重建形成肺纖維化，血清中MMP-7 水平升高與肺纖維化程度正相關(guān)。KL-6 和MMP-7 是肺纖維化的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，二者同時(shí)升高，可提高肺纖維化診斷的特異性。模型組小鼠血清KL-6 和MMP-7含量對(duì)于對(duì)照組明顯增加，符合魯未等［22］確診肺纖維化的標(biāo)準(zhǔn)。CBD 低、中、高給藥組血清KL-6 和MMP-7 含量相對(duì)于模型組均明顯下降且成劑量依賴性，多角度證明了CBD對(duì)肺纖維化的緩解作用。

肺纖維化的發(fā)生與炎癥關(guān)系密切，炎癥損傷后發(fā)生的異常修復(fù)最終導(dǎo)致形成局部瘢痕性變化，影響肺換氣功能。因此，抑制炎癥反應(yīng)是緩解肺纖維化發(fā)生的重要途徑。細(xì)胞焦亡是機(jī)體一種重要的天然免疫反應(yīng)，在感染性疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑也稱為依賴Caspase-1 的細(xì)胞焦亡途徑，在刺激因素的作用下NLRP3 蛋白、ASC 蛋白、半胱天冬酶-1 前體（Pro-Caspase-1）蛋白表達(dá)量增加，三者組裝成NLRP3 焦亡小體，進(jìn)一步產(chǎn)生成熟的Caspase-1，Caspase-1 切割Gasdermin D蛋白，生成Gasdermin D 氮端游離的活性域多肽（GSDMD-N）在細(xì)胞膜上形成眾多的小孔，使細(xì)胞膜完整性受損，導(dǎo)致細(xì)胞失去調(diào)控物質(zhì)進(jìn)出的能力，最終膨脹破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物；同時(shí)促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β 前體（pro-IL-1β）和白細(xì)胞介素-18 前體（pro-IL-18）成熟，生成大量IL-1β 和IL-18，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。我們通過Real-time PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D mRNA 相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組均顯著升高，ELISA 檢測(cè)模型組小鼠血清中IL-1β、IL-18 含量相對(duì)于對(duì)照組均顯著升高，提示博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型發(fā)生了經(jīng)典細(xì)胞焦亡。NF-κB p65 蛋白是NF-κB 信號(hào)通路中的重要產(chǎn)物，做為轉(zhuǎn)錄因子與DNA 相應(yīng)序列結(jié)合后，可上調(diào)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各給藥組肺組織NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA 相對(duì)表達(dá)量和血清中IL-1β、IL-18含量均不同程度降低，CBD 高劑量組的降低作用較低劑量更明顯，呈劑量依賴性，其原因可能是通過NF-κB信號(hào)通路抑制了細(xì)胞焦亡發(fā)生的強(qiáng)度，但具體是通過NF-κB信號(hào)通路的哪個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，CBD 對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型的改善作用呈劑量依賴性，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB 信號(hào)通路，減少NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞焦亡發(fā)生的程度，從而減輕了肺纖維化。