miR-381在HCC患者腫瘤組織、外周血中表達及過表達對巨噬細胞極化模式調節(jié)作用

吳書志，王菁

1 山東省疾病預防控制中心，濟南 250013；2 山東第一醫(yī)科大學附屬中心醫(yī)院醫(yī)學實驗診斷中心

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌類型，是所有癌癥中第六大常見的癌癥類型和第二大死亡原因［1］。HCC 發(fā)生及發(fā)展的機制極其復雜，其中一個重要的因素是細胞免疫功能紊亂［2］。多項研究［3-4］表明，肝內(nèi)免疫抑制狀態(tài)微環(huán)境是HCC 患者的特征性表現(xiàn)。研究［5］顯示，腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞被稱為腫瘤相關巨噬細胞（tumour-associated macrophages，TAMs），與HCC 進展和預后有關。巨噬細胞具有很高的可塑性，不同的病原體或刺激因素時其表型發(fā)生不同的分化，以增強應對微環(huán)境變化的能力，這個過程即為巨噬細胞的極化。根據(jù)極化后巨噬細胞的表面標志物及其功能，將其分為M1 型（經(jīng)典活化，免疫活化）巨噬細胞和M2 型（替代激活，免疫抑制）巨噬細胞。TAMs是癌癥和免疫微環(huán)境之間相互作用的關鍵調控因子［6］。在大多數(shù)實體腫瘤中，TAMs 以M2 型巨噬細胞為主，M2 型巨噬細胞具有促進腫瘤的作用。TAMs 可以通過淋巴系統(tǒng)或通過腫瘤內(nèi)毛細血管屏障進入外周循環(huán)，成為循環(huán)單核細胞［7］。研究［7-9］表明，外周血中的M2 型單核細胞可能是實體腫瘤的潛在生物學標志物。然而，關于HCC 患者外周血單核細胞極化的研究較少。miRNA 是一組含有20 至22個核苷酸的非編碼RNA 分子，被發(fā)現(xiàn)參與多種生理和病理過程［10-11］，如細胞分化、侵襲和腫瘤發(fā)生［12-14］。。miR-381 在消化系統(tǒng)相關的多種癌癥中表達下調，包括口腔鱗狀細胞癌（OSCC）、胃癌和HCC［15-16］。雖然關于肝癌患者miR-381 與單核-巨噬細胞極化之間關系的研究較少，但已有報道稱miRNA 可以調節(jié)腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞參與腫瘤的發(fā)展，與惡性腫瘤中巨噬細胞的M2 極化有關［17-18］。現(xiàn)有的巨噬細胞極化檢測方法主要包括基于表型和基因表達的方法。M1 型巨噬細胞表面通常表達CD86 和CD16 等標記物，而M2 型巨噬細胞表面通常表達CD206 和CD163 等標記物?；诨虮磉_的方法則通過檢測巨噬細胞特定基因的表達水平來判斷巨噬細胞的極化狀態(tài)，例如M1 型巨噬細胞通常表達白介素-12（IL-12）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和一氧化氮合酶（iNOS）等炎癥相關基因，而M2 型巨噬細胞通常表達白介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）和精氨酸酶1（Arg-1）等抗炎相關基因。2022年3月—2023年3月，我們觀察了miR-381 在HCC 患者腫瘤組織、外周血和體外誘導分化巨噬細胞中的表達變化，并探討miR-381 過表達對巨噬細胞極化模式的調節(jié)作用，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取濟南市中心醫(yī)院2022年3月—2023年3月診治的HCC 患者40 例，男性28 例、女性12 例，年齡46.2（35～67）歲。納入標準：①術后經(jīng)病理學診斷為原發(fā)性HCC；②在手術切除以及抽血之前，患者未接受放療、化療、中藥、免疫或靶向治療；③未合并其他部位的惡性腫瘤、血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病。同期選取健康志愿者40 例，男性26 例、女性14例，年齡43.4（34～61）歲。患者及其家屬均同意并簽署知情同意書，所有涉及患者標本的實驗均經(jīng)我院倫理委員會批準（批準文號SZR2022-023-01）。

1.2 HCC 患者腫瘤組織與癌旁組織中miR-381、巨噬細胞標記物iNOS 和Arg-1 表達觀察 40 例HCC患者均接受手術切除腫瘤治療，術中留取腫瘤組織與癌旁組織（距腫瘤組織邊緣≥2 cm）。

1.2.1 HCC 患者腫瘤組織與癌旁組織中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA 檢測 采用RT-PCR 法。TRIzol 法提取標本中的總RNA，取總RNA 1 μg 進行逆轉錄反應，模板cDNA 于-20℃冰箱保存。RT-PCR 擴增所需引物的序列如下：miR-381正向引物為5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，反向引物為5′-CACTTCCTCAGCACTTGTTGGTAT-3′；iNOS 正向引物為5′-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3′，反向引物為5′-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3′；Arg-1 正向引物為5′-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3′，反向引物為5′-AGGAGCTATCATTAGGGACATC-3′；GAPDH 正向引物為5′-ACCACAGTCCATGCCAC-3′，反向引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；U6 正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；qRT-PCR 反應條件為：25 μL體系，94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，71 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，71 ℃最后延伸2 min。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.2.2 HCC 患者腫瘤組織與癌旁組織中iNOS、Arg-1 蛋白檢測 采用Western Blotting 法。按照蛋白裂解液說明書對組織/細胞總蛋白進行提取，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品濃度后，加SDS-PAGE 上樣緩沖液煮沸5 min。取20 μg 蛋白質上樣，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，冰浴條件下100 V 恒壓轉膜2 h，將蛋白轉移到0.45 μm 聚偏二聚甲醛（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PVDF 膜與特異性一抗（iNOS、Arg-1）在4 ℃下孵育過夜。次日，將膜與二抗在室溫下孵育1 h。將膜置于ECL 發(fā)光液中反應，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光并采集圖像，采用Image lab 3.0 軟件分別獲取蛋白質信號條帶圖像進行信號分析，以蛋白條帶灰度值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 HCC 患者與健康志愿者外周血巨噬細胞中miR-381、巨噬細胞標記物CD86 和CD163 表達觀察 分別抽取患者手術前靜脈血20 mL 以及健康志愿者靜脈血20 mL，采用Ficoll 密度梯度分離法分離外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），采用流式細胞術檢測單核細胞純度＞95%即為合格。

1.3.1 HCC 患者與健康志愿者外周血巨噬細胞中miR-381 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 檢測 檢測方法參照“1.2.1”，其中CD86 正向引物為5′-CTGCTCATCTATACACGGTTACC-3′，反向引物為5′-GGAAACGTCGTACAGTTCTGTG-3′；CD163正向引物為5′-CGGTCTCTGTGATTTGTAACCAG-3′，反向引物為5′-TACTATGCTTTCCCCATCCATC-3′。

1.3.2 HCC 患者與健康志愿者外周血巨噬細胞中CD86、CD163 蛋白檢測 采用流式細胞法。細胞用熒光色素標記的單克隆抗體染色：FITC-anti-CD14檢驗單核細胞的純度，F(xiàn)ITC-anti-CD86 作為M1 型單核細胞的標記，APC-anti-CD163作為M2型單核細胞的標記。標記15 min 后，PBS 清洗細胞，并在PBS 中懸浮，使用FacsCantoII 流式細胞儀進行分析，記錄每個樣本至少5000個細胞，使用FacsDiva軟件分析數(shù)據(jù)，以CD86 + 、CD163 + 細胞所占的比例分別代表CD86、CD163蛋白的水平。。

1.4 體外誘導分化的巨噬細胞中miR-381、iNOS、Arg-1、CD86、CD163表達觀察

1.4.1 巨噬細胞的體外誘導分化及分組 人高轉移性肝癌細胞系LM3和人髓系白血病單核細胞（human myeloid leukemia mononuclear cells，THP-1）購自中國科學院細胞資源中心，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用RPMI 1640 培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素進行培養(yǎng)。取1×106個THP-1 細胞在6孔板中培養(yǎng)，加入100 ng/mL的PMA孵育6 h誘導細胞分化，THP-1 細胞被誘導貼壁成為M0 型巨噬細胞，記為M0組。取M0型巨噬細胞，10 ng/mL的IL-4孵育48 h，誘導成為M2 型巨噬細胞，記為為M2 組。取1×106個LM3細胞在6孔板中培養(yǎng)過夜，次日將每孔的培養(yǎng)基改為無血清培養(yǎng)基，24 h 后收集條件培養(yǎng)基（Conditioned medium，CM），培養(yǎng)M0 型巨噬細胞，模擬TAMs，記為CM組。

1.4.2 各組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA檢測 檢測方法參照“1.2.1”。

1.4.3 各組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白檢測 檢測方法參照“1.2.2”、“1.3.2”。

1.5 過表達miR-381 對體外誘導分化巨噬細胞極化模式的調節(jié)作用觀察

1.5.1 巨噬細胞轉染及分組 將THP-1 細胞接種于6 孔板中，并誘導成為M0 型巨噬細胞，當達到80%融合時，分別用Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑將miR-381 模擬物（miR-381 mimic）、對照模擬物（mimic NC）轉入M0型巨噬細胞，記為miR-381 mimic組、mimic NC組。

1.5.2 兩組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA檢測 檢測方法參照“1.2.1”。

1.5.3 兩組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白檢測 檢測方法參照“1.2.2”、“1.3.2”。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用Graph Pad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCC患者腫瘤組織與癌旁組織中miR-381、iNOS、Arg-1表達比較

2.1.1 HCC 患者腫瘤組織與癌旁組織中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA 相對表達量比較 HCC 患者腫瘤組織中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA 相對表達量分別為0.453±0.071、0.514± 0.089、1.749± 0.121，HCC 患者癌旁組織中miR-381mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA相對表達量分別為1.063± 0.136、0.994± 0.099、1.041± 0.103，兩組相比，P均＜0.05。

2.1.2 HCC 患者腫瘤組織與癌旁組織中iNOS、Arg-1 蛋白相對表達量比較 HCC 患者腫瘤組織中iNOS、Arg-1 蛋白相對表達量分別為0.435± 0.053、1.581± 0.101，HCC 患者癌旁組織中iNOS、Arg-1 蛋白相對表達量分別為1.499± 0.119、0.547±0.046，兩組相比，P均＜0.05。以上結果說明，在HCC 患者腫瘤組織中miR-381 呈低表達，巨噬細胞以M2型極化為主。

2.2 HCC 患者與健康志愿者外周血巨噬細胞中miR-381、CD86、CD163表達比較

2.2.1 HCC 患者與健康志愿者外周血巨噬細胞中miR-381 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相對表達量比較 HCC 患者外周血巨噬細胞中miR-381 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相對表達量分別為0.692± 0.041、0.613± 0.068、1.612±0.109，健康志愿者外周血中巨噬細胞中miR-381 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相對表達量分別為1.453± 0.120、1.054± 0.119、0.996±0.095，兩組相比，P均＜0.05。

2.2.2 HCC 患者與健康志愿者外周血巨噬細胞中CD86、CD163 蛋白表達水平比較 HCC 患者外周血巨噬細胞中CD86、CD163 蛋白表達水平分別為28.14%± 3.32%、56.41%± 5.31%，健康志愿者外周血巨噬中細胞的CD86、CD163蛋白表達水平分別為44.13%± 4.34%、39.52%± 4.16%，兩組相比，P均＜0.05。以上結果提示，HCC患者外周血巨噬細胞中miR-381呈低表達，巨噬細胞以M2型極化為主。

2.3 各組巨噬細胞中miR-381、iNOS、Arg-1、CD86、CD163表達比較

2.3.1 各組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相對表達量比較 各組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相對表達量比較見表1。由表1 可知，CM 組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相對表達量介于M0組、M2組之間（P均＜0.05）。

表1 各組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相對表達量比較（±s）

表1 各組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相對表達量比較（±s）

注：與M0組相比，*P＜0.05；與M2組相比，#P＜0.05。

組別M0組M2組CM組CD163 mRNA 1.138± 0.1232.271± 0.234*1.411± 0.131*#miR-381 mRNA 1.036± 0.0930.315± 0.039*0.632± 0.056*#iNOS mRNA 0.949± 0.1010.486± 0.049*0.761± 0.068*#Arg-1 mRNA 0.976± 0.0912.481± 0.242*1.586± 0.139*#CD86 mRNA 1.064± 0.1030.356± 0.032*0.684± 0.061*#

2.3.2 各組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表達水平比較 各組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163 蛋白表達水平比較見表2。由表2 可知，CM 組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163 蛋白表達水平介于M0 組、M2 組之間（P均＜0.05）。以上結果說明體外模擬的TAMs中miR-381呈低表達，其極化模式趨向于M2型巨噬細胞。

表2 各組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表達水平比較（±s）

注：與M0組相比，*P＜0.05；與M2組相比，#P＜0.05。

組別M0組M2組CM組CD163蛋白49.36%± 4.68%87.83%± 8.84%*65.62%± 6.47%*#iNOS蛋白1.316± 0.1130.528± 0.511*0.946± 0.107*#Arg-1蛋白0.752± 0.0691.985± 0.206*1.529± 0.148*#CD86蛋白56.23%± 5.32%19.83%± 2.02%*39.36%± 3.18%*#

2.4 過表達miR-381 對體外培養(yǎng)巨噬細胞極化模式的調節(jié)作用

2.4.1 兩組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相對表達量比較 兩組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA 相對表達量比較見表3。由表3 可知，miR-381 mimic 組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、CD86 mRNA 相對表達量均升高，而Arg-1 mRNA、CD163 mRNA 相對表達量均降低（P均＜0.05）。

表3 兩組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相對表達量比較（±s）

表3 兩組巨噬細胞中miR-381 mRNA、iNOS mRNA、Arg-1 mRNA、CD86 mRNA、CD163 mRNA相對表達量比較（±s）

注：與mimic NC組相比，*P＜0.05。

組別mimic NC組miR-381 mimic組CD163 mRNA 0.981± 0.0900.328± 0.028*miR-381mRNA 1.145± 0.09810.254± 1.095*iNOS mRNA 1.083± 0.0892.419± 0.216*Arg-1 mRNA 1.170± 0.1370.519± 0.047*CD86 mRNA 0.970± 0.0912.695± 0.231*

2.4.2 兩組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表達水平比較 兩組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163 蛋白表達水平比較見表4。由表4可知，miR-381 mimic 組巨噬細胞中iNOS、CD86 蛋白表達水平均升高，而Arg-1、CD163 蛋白表達水平均降低（P均＜0.05）。以上結果提示，過表達miR-381 后，M1 的指標CD86、iNOS 表達有所提高，M2 的指標CD163、Arg-1 表達有所下降，說明過表達miR-381 可以誘導巨噬細胞向M1 型極化轉變。

表4 兩組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表達水平比較（±s）

表4 兩組巨噬細胞中iNOS、Arg-1、CD86、CD163蛋白表達水平比較（±s）

注：與mimic NC組相比，*P＜0.05。

組別mimic NC組miR-381 mimic組CD163蛋白50.28%± 4.87%27.43%± 2.54%*iNOS蛋白0.962± 0.0881.852± 0.091*Arg-1蛋白1.130± 0.1480.627± 0.059*CD86蛋白51.38%± 5.07%74.18%± 7.26%

3 討論

HCC 是一種在世界范圍內(nèi)發(fā)病率高的惡性腫瘤，病程短，早期臨床癥狀不典型，死亡率高［19］。腫瘤的發(fā)生過程中會出現(xiàn)免疫系統(tǒng)的功能異常。細胞免疫功能的降低可導致免疫細胞對肝癌細胞的識別及吞噬能力降低，使腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視及攻擊，從而肝癌細胞能夠生長繁殖。因此，通過調節(jié)肝癌患者的細胞免疫水平治療肝癌是一種新的途徑［20］。

TAMs 在包括HCC 在內(nèi)的炎癥相關癌癥的進展中發(fā)揮著關鍵作用。TAMs 中，巨噬細胞占較大比例。M1型巨噬細胞具有較強吞噬、促炎及抗腫瘤活性，M2 型巨噬細胞有抑制炎癥、促腫瘤的活性。近年來，意識到TAMs 在肝癌的進程中起著推波助瀾的作用，所以開展了很多關于促進M2 型巨噬細胞向M1 型復極化的相關研究。MAO 等［21］研究顯示，甘草酸可以上調CCR7表達，促進TNF-ɑ、IL-12、IL-6的產(chǎn)生（M1 型巨噬細胞標志物），并且下調MR、Ym1、Arg-1 表達（M2 型巨噬細胞標志物），該效應主要依賴于JNK 和NF-κB 通路的激活。同時，WU等［22］研究證明，2-脫氧葡萄糖聯(lián)合放療可以促進體內(nèi)巨噬細胞向M1 型極化，阻止向M2 型極化，從而防止肝硬化的進程。復極化的TAMs 可以抑制腫瘤生長，M2型巨噬細胞向M1型轉化后有抗腫瘤效應。M1和M2型巨噬細胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，促進M2 型巨噬細胞向M1 型復極化為肝癌的治療提供了新的思路。

miR-381 是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫相關miRNA［23］，已成為癌癥相關miRNA 的研究熱點。最近有研究［24］表明，miR-381 在肝癌組織中低表達，可抑制細胞增殖和侵襲。然而，關于miR-381 與HCC 患者腫瘤組織巨噬細胞和外周血巨噬細胞細胞極化之間的關系的研究較少。本研究表明，miR-381 在HCC 患者腫瘤組織、外周血巨噬細胞和模擬TAMs 中表達均較低；HCC 患者腫瘤組織中TAMs 主要以M2 巨噬細胞為主；外周血中M2 型巨噬細胞的比例增加；在體外，模擬TAMs 仍表現(xiàn)出M2 極化的特征。因此，我們推測，miR-381 與巨噬細胞的極化有一定的關系。HCC 患者外周血中M2 型巨噬細胞的比例可能作為一種新的生物標志物。因此，有必要對其臨床資料進行進一步的研究。在本研究中，通過構建過表達miR-381的細胞模型，我們分析了miR-381與巨噬細胞極化之間的關系。結果表明，過表達miR-381 可誘導M1 極化、抑制M2 巨噬細胞標志物的表達。

綜上所述，我們的研究結果揭示了巨噬細胞極化的潛在機制，HCC 患者腫瘤組織、外周血巨噬細胞、體外模擬TAMs 都傾向于M2 極化，miR-381 低表達；過表達miR-381 可以使巨噬細胞更傾向于M1 極化。我們推測miR-381 與HCC 患者體內(nèi)的巨噬細胞的極化有一定的關系，可誘導其向M1 型極化，有腫瘤抑制作用。巨噬細胞極化的調控非常復雜，涉及到多個誘導因子和信號通路。國內(nèi)外的報道中，miRNA 可以通過靶向基因和信號通路來調節(jié)巨噬細胞的極化。因此，在未來的研究中，我們將進一步探索miR-381 調控巨噬細胞極化的靶基因和通路，尋找促進M2 向M1 極化的新靶點和思路。