外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1 用于沙利度胺聯(lián)合達那唑治療骨髓增生異常綜合征療效評估價值分析

劉 焰，李國妍，陳 超

（山東省菏澤市中醫(yī)醫(yī)院藥學部，山東 菏澤 274000）

骨髓增生異常綜合征（MDS）是一種以髓系細胞發(fā)育異常為特點的異質(zhì)性髓系克隆性疾病，若未及時有效干預(yù)，可能會轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病，危及生命［1-3］。沙利度胺、達那唑是治療MDS 的常用藥物，前者具有抗細胞因子及免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制腫瘤壞死因子生成及T 淋巴細胞增殖，還可抑制新生血管生成；達那唑為睪酮衍生物，既可直接刺激造血干細胞，又可通過刺激腎臟產(chǎn)生紅細胞生成素促進造血，二者聯(lián)用可發(fā)揮協(xié)同增效作用。MDS 病因較復(fù)雜，相關(guān)研究顯示，造血干細胞基因突變、細胞免疫缺陷可能與其發(fā)病過程密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為免疫逃逸、造血干細胞惡性克隆等［4-5］。而T 淋巴細胞免疫球蛋白黏液素3（Tim3）可介導腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，參與多種腫瘤發(fā)生、浸潤與轉(zhuǎn)移［6］。有研究表明，程序性死亡因子-1/程序性死亡因子- 1 配體（PD - 1/ PD - L1）高表達所致腫瘤免疫逃逸機制是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因［7-8］。白細胞介素32（IL-32）可介導一系列免疫反應(yīng)［9］。目前，臨床針對MDS 主要采用免疫抑制劑聯(lián)合雄激素藥物治療，但既往研究多集中于探討二者聯(lián)合治療的效果，鮮有研究聯(lián)合用藥前后MDS患者外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD - L1 的表達水平。鑒于此，本研究中分析了上述外周血指標在沙利度胺聯(lián)合達那唑治療MDS 前后的表達變化趨勢，并結(jié)合血常規(guī)及骨髓細胞學檢查指標判斷評估療效的價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準：符合MDS 診斷標準［10］，并經(jīng)骨髓細胞學、免疫分型及病理活檢確診；初次發(fā)??；預(yù)計生存期> 6 個月。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準［批件號：（2017）倫審第（1753）號］，患者簽署知情同意書。

排除標準：合并肝腎等重要臟器器質(zhì)性病變；對本研究擬用藥物過敏；妊娠期、產(chǎn)褥期或哺乳期；存在自身免疫功能缺陷性疾病或全身感染性疾??；合并其他部位惡性腫瘤；接受細胞毒性藥物或接觸有血液毒性的化學制品或生物制劑等；重金屬中毒或過度飲酒；再生障礙性貧血、原發(fā)性骨髓纖維化、大顆粒淋巴細胞白血病或其他累及造血干細胞疾?。粐乐匾庾R障礙或精神行為異常。

病例選擇：選取醫(yī)院2018 年1 月至2020 年5 月收治的MDS 患者112 例，其中男70 例，女42 例；年齡32～58 歲，平均（46.89 ± 5.10）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）20～28 kg/m2，平均（24.09±1.83）kg/m2；病程1～15個月，平均（9.82±2.15）個月。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

參考相關(guān)文獻、咨詢專家意見、臨床實踐，自擬《MDS 患者一般資料調(diào)查問卷》，調(diào)查患者的年齡、性別、BMI、病程、世界衛(wèi)生組織（WHO）分型［11］、MDS的國際預(yù)后積分系統(tǒng)修訂版（IPSS-R）危險度分層［12］，其中WHO 分型包括難治性貧血伴原始細胞增多Ⅰ型（RAEB-Ⅰ）、RAEB-Ⅱ、難治性貧血伴環(huán)狀鐵粒幼細胞（RARS）、難治性血細胞減少伴多系發(fā)育異常（RCMD）；IPSS-R危險度分層，≥2.5分、1.5～2.0分、0.5～1.0分、0分分別為高危、中危Ⅱ、中危Ⅰ、低危。

1.2.2 治療方法與分組

患者均接受營養(yǎng)支持、心理疏導等對癥治療，口服沙利度胺片（常州制藥廠有限公司，國藥準字H32026130，規(guī)格為每片50 mg），每次50 mg，每日1 次，持續(xù)1 周后，劑量增至每日100 mg，再持續(xù)1 周后，劑量增至每日200 mg，用藥第4 周根據(jù)患者病情在每日100～200 mg 范圍內(nèi)調(diào)整劑量。服用達那唑膠囊（江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H32022729，規(guī)格為每粒0.1 g），每日0.3 g，每日3 次，連續(xù)治療3 個月。按治療是否有效分為有效組和無效組。

1.3 觀察指標與療效判定標準

觀察指標：1）血常規(guī)。治療前后取患者空腹外周靜脈血3 mL，采用全自動血細胞分析儀檢測白細胞計數(shù)（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板計數(shù)（PLT）水平，嚴格按儀器說明書操作。2）骨髓原始細胞?；颊喵暮笊霞泄撬璐┐?，抽取骨髓液0.2 mL涂片，采用瑞氏-吉姆薩染色，計數(shù)200個有核細胞，計算骨髓原始細胞百分比。3）外周血Tim3，IL - 32，PD - 1/ PD - L1 水平。取患者外周血4 mL，分裝2管，以乙二胺四乙酸抗凝，每管均添加2 mL 紅細胞裂解液，避光反應(yīng)5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1 次，離心，棄上清液，PBS 重懸；取100μL，加入Tim3，PD-1，PD-L1抗體，室溫避光孵育15 min，PBS 洗滌1 次，離心，棄上清液；加入200 μL PBS 重懸，采用流式細胞儀測定Tim3，PD-1，PD-L1 表達水平；取患者空腹外周靜脈血3 mL，2 500 r/ min 離心8 min（離心半徑6 cm），分離，取血清，以酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測IL-32水平，嚴格按試劑盒說明書操作。

療效判定［13］：完全緩解，出血、貧血等癥狀消失，Hb ≥100 g/ L，WBC ≥4 × 109/ L，PLT 為（80～100）×109/L，分類未見幼稚細胞，且骨髓中原始粒細胞和早幼粒細胞之和占比< 5%，維持時間≥6 個月；部分緩解，上述癥狀部分消失，骨髓中原始粒細胞和早幼粒細胞之和占比較治療前下降50%，維持時間≥3 個月；進步，上述癥狀有所減輕，骨髓中原始粒細胞和早幼粒細胞之和占比下降30%；無效，未達上述標準。將完全緩解、部分緩解、進步納入有效組，無效納入無效組。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件分析。計量資料行Kolmogorov - Smirnov 檢驗與Bartlett 檢驗，均服從正態(tài)分布且方差齊性時以表示，行獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗。外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD - L1 間及其與血常規(guī)骨髓細胞學指標的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)系數(shù)模型分析，與療效間的相關(guān)性采用Logistic 多因素回歸分析；評估價值分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，獲取曲線下面積、95%置信區(qū)間（CI）、敏感度、特異度及cut - off 值，聯(lián)合評估實施Logistic 二元回歸擬合，返回預(yù)測概率logit（p），將其作為獨立檢驗變量。采用雙側(cè)檢驗，α=0.05，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 單因素比較

有效組患者91 例，無效組患者21 例。兩組患者基本資料見表1，血常規(guī)、骨髓細胞學及外周血指標比較見表2。

表2 兩組患者血常規(guī)、骨髓細胞學及外周血指標比較（）Tab.2 Comparison of blood routine，bone marrow cytology and peripheral blood indicators between the two groups（）

注：與本組治療前比較，aP < 0.05。Note：Compared with those before treatment，aP < 0.05.

組別Tim3（%）治療前2.76±0.25 3.03±0.36 4.081<0.001 WBC（×109/L）治療前3.03±0.40 2.61±0.37 4.359<0.001治療后4.78±1.02a 2.70±0.81 8.721<0.001 Hb（g/L）治療前54.27±6.36 48.10±5.17 4.137<0.001治療后80.59±10.93a 50.73±8.72 11.677<0.001 PLT（×109/L）治療前57.12±6.04 51.93±5.05 3.651<0.001治療后68.53±11.24a 53.14±9.10 5.842<0.001骨髓原始細胞比例（%）治療前10.25±1.02 11.31±1.13 4.207<0.001治療后8.16±1.15a 10.94±1.86 8.779<0.001有效組（n=91）無效組（n=21）t值P值治療后2.02±0.21a 2.95±0.44 14.389<0.001 IL-32（ng/L）治療前72.18±8.03 80.24±9.11 4.042<0.001治療后53.67±7.64a 78.15±10.29 12.353<0.001 PD-1/PD-L1治療前1.79±0.24 2.21±0.36 6.525<0.001治療后1.65±0.13a 2.17±0.45 9.545<0.001

2.2 相關(guān)性分析及價值評估

治療前后，外周血Tim3 分別與治療前后IL - 32和PD - 1/ PD - L1（r= 0.662，0.404，0.675，0.666，P<0.05）呈正相關(guān)，IL-32 分別與治療前后的PD-1/PD - L1（r= 0.446，0.672，P< 0.05）呈顯著正相關(guān)。詳見圖1。治療前后外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1均與WBC，Hb，PLT 呈顯著負相關(guān)，與骨髓原始細胞比例呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。詳見表3。

圖1 治療前后外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1間的關(guān)聯(lián)性Fig.1 Correlation among peripheral blood Tim3，IL - 32 and PD - 1 / PD - L1 before and after treatment

表3 外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1與血常規(guī)及骨髓細胞學指標的相關(guān)性Tab.3 Correlation of peripheral blood Tim 3，IL - 32 and PD - 1 /PD - L1 with blood routine and bone marrow cytology indicators

以療效為因變量（有效= 0，無效= 1），以病程、WHO 分型、IPSS - R 危險度分層，治療前及治療后的WBC，Hb，PLT及骨髓原始細胞比例，外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1為自變量，進行Logistic多元回歸分析，結(jié)果顯示，治療前后外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1仍與療效顯著相關(guān)（P<0.05）。詳見表4。

表4 外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1與療效的相關(guān)性Tab.4 Correlation of peripheral blood Tim3，IL - 32 and PD - 1 / PD - L1 with the efficacy

ROC曲線顯示，外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1聯(lián)合評估沙利度胺聯(lián)合達那唑治療MDS 可能無效的AUC最大（0.885），敏感度、特異度分別為76.19%，92.31%。詳見表5、圖2。

圖2 外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1對療效的評估價值Fig.2 Evaluation value of peripheral blood Tim3，IL - 32 and PD - 1 / PD - L1 in the efficacy

表5 外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1對療效的評估價值Tab.5 Evaluation value of peripheral blood Tim3，IL - 32 and PD - 1 / PD - L1 in the efficacy

3 討論

近年來，沙利度胺聯(lián)合達那唑在臨床MDS 治療中受到廣泛重視，其中沙利度胺為常見免疫抑制劑，參與免疫調(diào)節(jié)、抑制細胞增殖、分化及形成造血因子等過程；達那唑是人工合成的甾體類雄激素，有助于抑制骨髓細胞凋亡，但二者聯(lián)用可能存在耐藥及復(fù)發(fā)現(xiàn)象［14-15］。因此，及時、準確地評價沙利度胺聯(lián)合達那唑的療效，有助于客觀判斷MDS患者的預(yù)后。

Tim3 通過結(jié)合其配體S 型凝集素半乳糖凝集素9，可產(chǎn)生免疫負調(diào)控作用，誘導Th1 細胞凋亡，抑制γ干擾素表達，導致骨髓來源的抑制性細胞異常增殖，從而產(chǎn)生免疫抑制［15-16］。PD-1/PD-L1 是一對負性免疫共刺激分子，其中PD-1主要在T淋巴細胞、胸腺細胞、B 淋巴細胞、自然殺傷（NK）細胞等細胞膜表面表達，PD - L1 是其介導的免疫抑制主要配體［17-18］。ZOU等［19］的研究表明，在腫瘤中，PD - 1 和PD - L1 相互作用能抑制腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞活化所致免疫抑制，減弱抗腫瘤效應(yīng)。IL-32 為細胞炎性因子，其表達在免疫組織中過度上調(diào)，楊穎瑩等［20］指出，其具有誘導機體免疫細胞凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示，治療有效的MDS 患者治療3 個月后外周血3 個指標明顯低于治療前，可能與聯(lián)合用藥糾正了異常免疫有關(guān)，推測該聯(lián)合用藥的主要療效可能與調(diào)節(jié)3 個指標水平表達存在關(guān)聯(lián)。治療前有效組與無效組患者外周血3個指標水平存在差異，可能與WHO 分型、IPSS - R 危險度分層等有關(guān)。進一步研究可知，治療前后有效組患者外周血3 個指標水平明顯低于無效組患者，結(jié)合文獻［21 - 23］研究結(jié)果，考慮機制可能在于3 個指標表達過度升高，可抑制細胞內(nèi)磷酸酶增殖，刺激T 細胞受體信號，激發(fā)效應(yīng)T 細胞功能活性，促進大量細胞因子分泌，強化裂解靶細胞效應(yīng)，降低免疫突觸穩(wěn)定性，從而加快MDS 病情進展，加重患者耐藥性，影響療效。

同時，汪德珍等［24］經(jīng)Cox 回歸分析顯示，WBC 和PLT 是地西他濱治療MDS 預(yù)后的獨立危險因素。曾俊權(quán)［25］指出，MDS患者骨髓中伴有不同程度血管新生，且骨髓原始細胞百分比與血管新生數(shù)量呈正相關(guān)，有助于指導臨床實施對癥治療。對比研究表明，有效組患者治療前WBC，Hb，PLT 水平在治療3 個月后有所提高，骨髓原始細胞比例有所下降，這可能歸因于聯(lián)合用藥能改善骨髓細胞凋亡程度，增強對髓細胞異常增殖的抑制效果，刺激機體產(chǎn)生正常造血功能，進而促進機體血象、骨髓象改善。Pearson 線性相關(guān)性分析結(jié)果提示，治療前、治療3 個月后外周血3 個指標與WBC，Hb，PLT及骨髓原始細胞比例均存在一定相關(guān)性，有望成為評估沙利度胺聯(lián)合達那唑治療MDS 效果的有效輔助觀察指標。

此外，本研究結(jié)果顯示，外周血Tim3 與IL - 32 和PD - 1/PD - L1 線性關(guān)系良好，表明三者可在MDS 患者機體免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同作用。為進一步明確3 個指標水平對沙利度胺聯(lián)合達那唑療效的評估價值，本研究中繪制了ROC 曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測3 個指標水平有助于指導臨床評估沙利度胺聯(lián)合達那唑療效，客觀評價MDS 患者預(yù)后。另外，在評估聯(lián)合治療效果的同時還應(yīng)將病程、WHO 分型、IPSS-R 危險度分層等因素納入考慮范圍內(nèi)，以獲取更可靠的研究結(jié)果。

綜上可知，沙利度胺聯(lián)合達那唑治療MDS，可有效下調(diào)外周血Tim3，IL - 32，PD - 1/ PD - L1 水平，明確上述外周血指標治療前后的變化情況，可為臨床評估MDS療效提供新思路。