檸檬酸三甲酯堿降解途徑及其雜質結構初步解析*

耿 燕，李香荷，王月英，王永欣，張 冬△

（1. 河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，河北 石家莊 050200； 2. 河北省軍區(qū)石家莊第三離休干部休養(yǎng)所，河北 石家莊 050000）

檸檬酸三甲酯具有生物降解性好、無毒、揮發(fā)性小及抗細菌等優(yōu)點［1］，為環(huán)境友好型醫(yī)藥中間體，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化工等各領域。工業(yè)生產上通常以檸檬酸經酸催化進行酯化反應制得［2-4］，由于反應中需產生3 個酯鍵，收率較低（多在74%～78%之間）。黃飛等［5］通過改良催化合成條件，收率最高可達89.6%。且其在堿破壞條件下最不穩(wěn)定，所產生的雜質量最高［6］。常采用氣相色譜（GC）法或氣相色譜質譜聯(lián)用（GC -MS）法進行檢測［7-10］。目前產品中的雜質控制已成為影響質量及優(yōu)化生產工藝的重要環(huán)節(jié)，樣品純度也成為產品質量的重要指標之一。為此，本研究中采用液相色譜-離子阱-飛行時間質譜聯(lián)用（LC-IT-TOF/MS）法，直接分析堿破壞樣品中的降解產物，確立降解途徑，從而優(yōu)化合成工藝防止降解反應發(fā)生，繼而提高產品質量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外-可見分光光度儀，離子阱飛行時間質譜液質聯(lián)用儀（日本Shimadzu公司）。

1.2 試藥

檸檬酸三甲酯對照品（批號ZY160517，含量98%，上海譜振生物科技有限公司/上海科拉曼試劑有限公司）；檸檬酸三甲酯樣品（自制，批號為D0414）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Thermo Hypersil GOLD Dim 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-水（10∶90，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為214 nm；柱溫為35 ℃；進樣量為20μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；接口電壓為4.5 kV；掃描范圍，一級質譜m/z10～1 500，自動多級m/z50～1 000；霧化氣為氮氣，流速為1.5 L/ min，漂移管溫度200 ℃；干燥氣為氮氣，流速為10 L/ min；加熱模塊溫度為200 ℃；碰撞氣為氬氣；檢測器電壓為1.52 kV；校準方法，自動調諧優(yōu)化電壓，外標法校準質量數(shù)。

2.2 供試品溶液制備

取樣品2 份，各約50 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，均加入0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL 溶解，分別放置8，10 min，均加入0.1 mol/ L 鹽酸溶液中和，用流動相定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，分別作為供試品溶液Ⅰ和Ⅱ。

2.3 分析方法選擇

取2.2 項下2 種供試品溶液各適量，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，供試品溶液Ⅰ中雜質a的檢出量較小，檢出的雜質主要為雜質b，供試品溶液Ⅱ中雜質a顯著增加，雜質b降解（見圖1）。鑒于此，本研究中采用2 種降解模式富集雜質、采集數(shù)據(jù)，采用LC-IT-TOF/MS技術對2種雜質進行初步結構解析。

圖1 高效液相色譜圖1.Impurity a 2.Impurity b 3.Trimethyl citrateA.Test solution Ⅰ B.Test solution ⅡFig.1 HPLC chromatograms

2.4 質譜解析

2.4.1 檸檬酸三甲酯

檸檬酸三甲酯的相對分子質量為234，其正離子模式一級質譜圖見圖2。其中未直接顯示分子離子峰，但在m/z235，252，257 處顯示M++1 峰、M++H2O 峰及M++Na峰。且由于檸檬酸三甲酯呈蠟狀，分子較黏稠，因此在m/z491 處出現(xiàn)較大量的2M++ Na 峰，表明所測分子結構與檸檬酸三甲酯一致。

圖2 檸檬酸三甲酯正離子模式一級質譜Fig.2 Primary mass spectrometry of trimethyl citrate in positive ion mode

2.4.2 雜質b

正離子模式：一級質譜圖見圖3 A，其中未顯示分子離子峰，在約m/z243，265，507處分別顯示M++Na峰、M++ CO2峰，以及二者結合后失去H+的結合峰，且由于分子的黏稠特性，在m/z991，870，749，628處分別出現(xiàn)了雙分子甚至四分子的結合峰，與其蠟狀性質相一致。該M++CO2峰的二級質譜圖見圖3 B。其中清楚顯示出其失去甲基（M+-15）在m/z205處的離子峰及其進一步失去CO2Me后在m/z147處的離子峰。

圖3 雜質b正離子模式質譜A.Primarymassspectrometry B.SecondarymassspectrometryofM++CO2peakFig.3 Mass spectrometry of impurity b in positive ion mode

負離子模式：一級質譜圖見圖4 A，在m/z219處清晰顯示了檸檬酸二甲酯的M-- 1 峰，與其含有羰基酸易失去質子形成負離子的結構一致。該峰的二級質譜圖見圖4 B。推測其最高峰（m/z143）為分子離子峰失去CO2Me 和水后的負離子峰。以上譜圖所示結構與檸檬酸二甲酯一致。

圖4 雜質b負離子模式質譜A.Primary mass spectrometry B.Secondary mass spectrometry of M - - 1 peakFig.4 Mass spectrometry of impurity b in negative ion mode

2.4.3 雜質a

正離子模式：一級質譜圖見圖5 A。其中未直接顯示分子離子峰，但在m/z251 和273 處分別顯示M++CO2+1峰和M++CO2+Na峰，這與檸檬酸單甲酯易失去CO2的性質一致。M++ CO2+ Na 峰的二級質譜圖見圖5 B。在m/z187處顯示分子離子失水再失去1個質子的離子峰，在m/z147處則顯示失去CO2Me后的離子峰。

圖5 雜質a正離子模式質譜A.Primary mass spectrometry B.Secondary mass spectrometry of M+ +CO2 + Na peakFig.5 Mass spectrometry of impurity a in positive ion mode

負離子模式：一級質譜圖見圖6 A，在m/z205處清晰顯示了M - - 1 的離子峰，與檸檬酸單甲酯含羧酸基團易失去質子形成負離子的性質一致。該峰二級質譜圖見圖6 B，在m/z173 處顯示其失去1 個分子甲醇后的離子峰，在m/z155 處則給出其進一步失水的離子峰。以上譜圖所示結構與檸檬酸單甲酯一致。

圖6 雜質a負離子模式質譜A.Primary mass spectrometry B.Secondary mass spectrometry of M - - 1 peakFig.6 Mass spectrometry of impurity a in negative ion mode

2.5 降解途徑

根據(jù)以上質譜解析結果，初步分析得檸檬酸三甲酯堿降解途徑及降解產物，詳見圖7。

圖7 檸檬酸三甲酯堿降解途徑Fig.7 Alkaline degradation pathway of trimethyl citrate

3 討論

3.1 供試品溶液選擇

本研究中所用樣品以新合成路線研制，故通過解析主成分的質譜以驗證分子結構。檸檬酸三甲酯為合成產品，雜質含量很少，無法達到質譜檢測所要求的檢出量，故在堿性條件下將酯水解成羧酸鈉鹽，結果堿降解8，10 min 時主要雜質分別為檸檬酸二甲酯的同分異構體及檸檬酸單甲酯的同分異構體，繼而可通過有針對性地富集雜質樣本，分階段對樣品進行分析，以獲得高質量質譜圖，降低譜圖分析難度。

3.2 儀器與流動相選擇

儀器中一旦存在不揮發(fā)鹽，便無法得到好的離子流，無論使用ESI還是大氣壓化學電離（APCI）均不能揮發(fā)，很可能堵住離子源后方的加熱毛細管，影響其他樣品分析。選擇液質聯(lián)用儀，因其接口可避免不揮發(fā)的緩沖鹽進入。儀器色譜條件中，常用的流動相為甲醇、乙腈、水及其不同比例的混合物，以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液［11］。鑒于供試品溶液的紫外檢測波長為214 nm，故流動相選用乙腈-水系統(tǒng)，響應值更高。

3.3 質量分析器選擇

液相色譜/質譜常用的質量分析器包括四極桿分析器、飛行時間分析器和離子阱飛行器。其中四極桿質譜儀是最常見的質譜儀器，定量能力突出，但無串極功能，定性能力不足；飛行時間質譜儀質量范圍寬，掃描速度快，但同樣無串極功能，限制了進一步的定性能力；離子阱質譜儀結構小巧，質量輕，靈敏度高，具有多級質譜功能，但定量能力不足，無法做母離子掃描和中性丟失，在篩選特征結構分子的時候能力不足。離子阱-飛行時間質譜儀實現(xiàn)了離子阱質譜和飛行時間質譜的優(yōu)勢互補，既可用于制作多級質譜，又能達到高質量精度，具有高分辨率、高靈敏度的特點，提高了定性和定量能力。故本研究中選擇離子阱-飛行時間質譜。

3.4 方法評價

聯(lián)用分析技術是分析化學發(fā)展的重要發(fā)展方向之一。液質聯(lián)用技術結合了色譜、質譜的優(yōu)點，近年來在生物醫(yī)學、藥學、環(huán)境檢測、毒物分析等領域發(fā)揮了巨大作用［12-14］。本研究中所建立的LC-IT-TOF 法可用于檸檬酸三甲酯堿降解產物及降解途徑研究，進而可為改進檸檬酸三甲酯合成工藝及提高產品質量提供參考。