補(bǔ)腎通絡(luò)方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎機(jī)制網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

宋玉成，歐國(guó)誼，楊永強(qiáng)，姚慶藍(lán)，區(qū) 澤，紀(jì)科偉

（廣東省人民醫(yī)院南海醫(yī)院，廣東 佛山 528200）

目前臨床對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的西醫(yī)治療手段包括手術(shù)、康復(fù)理療、口服非甾體抗炎藥、關(guān)節(jié)腔內(nèi)藥物注射、口服止痛藥等，但手術(shù)創(chuàng)傷較大，而長(zhǎng)期服藥易引發(fā)出血、潰瘍、消化道穿孔等不良反應(yīng)，進(jìn)而影響療效［1］。故可考慮中醫(yī)（中藥）治療。補(bǔ)腎通絡(luò)方由多種中藥組方，可較好地改善膝骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)功能受限、疼痛的情況。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可清晰顯示“藥物-靶點(diǎn)-疾病-基因”的內(nèi)在聯(lián)系，廣泛用于中藥復(fù)方配伍規(guī)律方面的研究。鑒于此，本研究中基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并結(jié)合中醫(yī)對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的認(rèn)識(shí)［2-3］，分析了補(bǔ)腎通絡(luò)方治療該病可能的作用機(jī)制［4-5］，以期為該病的治療進(jìn)一步提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 方劑組成與來源

補(bǔ)腎通絡(luò)方（組方：熟地、杜仲、當(dāng)歸各12 g，防風(fēng)10 g，山萸肉、懷牛膝、寄生、獨(dú)活、秦艽各9 g，地龍、甘草各6 g，細(xì)辛3 g）。所有組方中藥（飲片）及方劑均由我院中醫(yī)科提供。

1.2 補(bǔ)腎通絡(luò)方活性成分與潛在靶點(diǎn)篩選

檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bionet.ncpsb.org/ batman - tcm）；參數(shù)設(shè)置為P< 0.05，Score cutoff =20），分別以熟地、杜仲、當(dāng)歸、山萸肉、懷牛膝、寄生、獨(dú)活、秦艽、防風(fēng)、細(xì)辛、地龍、甘草為關(guān)鍵詞，并參照ADME原理，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，檢索并篩選該方的活性成分及潛在靶點(diǎn)，建立補(bǔ)腎通絡(luò)方活性成分-靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 補(bǔ)腎通絡(luò)方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ctdbase.org/）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：// www. genecards. org，Version 4.11.0）檢索膝骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因并匯總，去除重復(fù)基因，并通過CooLGeN 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：// ci. smu. edu. cn/ CooLGeN/Home.php）篩選。將補(bǔ)腎通絡(luò)方活性成分靶點(diǎn)與膝骨性關(guān)節(jié)炎基因靶點(diǎn)相互映射，獲得補(bǔ)腎通絡(luò)方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將補(bǔ)腎通絡(luò)方作用于膝骨性關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org，Version 11.0），限定物種為“Homo Sapiens”，獲取PPI關(guān)系并以.TSV 格式保存，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，利用其“Network analyzer”工具行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，篩選重要靶點(diǎn)蛋白。

1.5 富集分析

將補(bǔ)腎通絡(luò)方作用于膝骨性關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：// david. ncifcrf. gov/ home. jsp），限定物種為“Homo Sapiens”，P<0.05，所有靶基因名稱矯正為官方名稱，并利用Omicshare 云平臺(tái)（https：//omicshare. com/）進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集分析（包括生物過程、細(xì)胞組分、細(xì)胞功能3 個(gè)方面）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎通絡(luò)方活性成分篩選

初步檢索得補(bǔ)腎通絡(luò)方中活性成分738個(gè)，按要求進(jìn)一步篩選后得到80 個(gè)，其中熟地2 個(gè)、杜仲11 個(gè)、當(dāng)歸16 個(gè)、山萸肉2 個(gè)、懷牛膝3 個(gè)、寄生5 個(gè)、獨(dú)活9 個(gè)、秦艽3個(gè)、防風(fēng)4個(gè)、細(xì)辛6個(gè)、地龍3個(gè)、甘草16個(gè)，10個(gè)化學(xué)成分為多種中藥共有。

2.2 補(bǔ)腎通絡(luò)方作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

初步檢索共得到5 961 個(gè)膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)，刪除重復(fù)后得到5 524 個(gè)，與2.1 項(xiàng)下70 個(gè)靶點(diǎn)映射取交集，得共有靶點(diǎn)46個(gè)，即為補(bǔ)腎通絡(luò)方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)。維恩圖見圖1。補(bǔ)腎通絡(luò)方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎“藥物- 活性成分- 基因靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見圖2。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)維恩圖Fig.1 Venn diagram of drug - disease targets

圖2 藥物-活性成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network of drug - active ingredient - gene targets

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

所得PPI 網(wǎng)絡(luò)中共包括79 個(gè)節(jié)點(diǎn)、956 條邊，靶點(diǎn)蛋白平均節(jié)點(diǎn)度（degree）值為24.2（其中有24 個(gè)靶蛋白degree 值≥24），依據(jù)臨床重要性篩選出的10 個(gè)重要潛在靶點(diǎn)蛋白及其PPI網(wǎng)絡(luò)見圖3。

圖3 10個(gè)關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of 10 key protein targets

2.4 富集分析

共富集到GO 條目133 個(gè)，其中生物過程96 個(gè)、細(xì)胞組分14 個(gè)、分子功能23 個(gè)。選取富集數(shù)目排前10 的功能進(jìn)行可視化（見圖4）。結(jié)果顯示，生物過程主要富集在凋亡過程、細(xì)胞增殖與代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、炎性反應(yīng)等方面，細(xì)胞組分主要富集在胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外泌體基因等方面，細(xì)胞功能主要富集在乙酰膽堿結(jié)合、氧化還原酶、過氧化物酶活性、細(xì)胞周期蛋白結(jié)合等方面。共富集到KEGG 信號(hào)通路76 條，主要涉及腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、低氧誘導(dǎo)因子- 1（HIF-1）信號(hào)通路等。選擇富集數(shù)目排名前10 的信號(hào)通路繪制氣泡圖進(jìn)行可視化（見圖5）。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 Results of GO functional enrichment analysis

圖5 KEGG信號(hào)通路富集分析Fig.5 Results of KEGG signaling pathway enrichment analysis

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎可造成關(guān)節(jié)腔積液、滑膜炎癥、骨贅形成、半月板損傷等一系列影響患者日常生活的情況［6-7］。老年人群隨著年齡的增加，肝腎衰氣血少，風(fēng)寒外邪更易侵襲機(jī)體，因此易發(fā)生該病。該病屬中醫(yī)“膝痹”“骨痹”“痹癥”等范疇，治療應(yīng)以活血化瘀、補(bǔ)腎益氣為主要原則［8］。

補(bǔ)腎通絡(luò)方組方中藥中，杜仲、懷牛膝可通利關(guān)節(jié)、破血逐淤、舒筋活絡(luò)，有效緩解關(guān)節(jié)疼痛、跌打損傷、活動(dòng)不便等病癥，熟地、當(dāng)歸、山萸肉、寄生、獨(dú)活、秦艽、防風(fēng)、細(xì)辛、地龍、甘草等中藥均具有補(bǔ)益肝腎、活血止痛、祛濕除風(fēng)、溫腎壯陽(yáng)、補(bǔ)肝補(bǔ)腎等作用，可有效改善患者風(fēng)濕痹痛、肝腎不足等癥狀，諸藥合用，共同發(fā)揮活血養(yǎng)血、強(qiáng)筋健骨、溫補(bǔ)肝腎、化瘀止痛的作用［9-10］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)腎通絡(luò)方中多種中藥均具有免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用，顯示出補(bǔ)腎通絡(luò)方在治療膝骨性關(guān)節(jié)中獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［11］。本研究中共篩選出活性（化合物）成分70 個(gè)，以及其治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)46個(gè)，表明補(bǔ)腎通絡(luò)方具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有24 個(gè)靶點(diǎn)蛋白，10 個(gè)關(guān)鍵蛋白中，TNF、IL-6 及IL-10 均為膝骨性關(guān)節(jié)發(fā)病過程中重要的炎性介質(zhì)，可參與炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)［12］；TLR4 對(duì)細(xì)胞因子分泌、核因子- κB 活化、炎性反應(yīng)具有介導(dǎo)作用［13］；PTGS2 可參與細(xì)胞表型改變、細(xì)胞黏附增加、腫瘤血管形成、抗凋亡等過程，且可分泌炎性前列腺素；CCL2 為與多種疾病發(fā)生存在密切聯(lián)系的分泌蛋白，可參與炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)［14］；INS為對(duì)脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝具有調(diào)節(jié)作用的肽激素；ALB 為激素、外源性藥物、代謝物、脂肪酸等內(nèi)源性分子的載體蛋白，對(duì)血漿膠體滲透壓具有調(diào)節(jié)作用；JUN 可調(diào)節(jié)基因表達(dá)，AKT1 可通過轉(zhuǎn)錄的方式抑制凋亡，且可參與神經(jīng)元成活?？梢姡a(bǔ)腎通絡(luò)方作用的靶點(diǎn)蛋白涉及免疫、炎癥、代謝、細(xì)胞成活等多種功能。

GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎通絡(luò)方可調(diào)控體內(nèi)多種信號(hào)通路，其生物過程均涉及凋亡過程、細(xì)胞增殖與代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、炎性反應(yīng)等。KEGC 信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，TNF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、HIF-1信號(hào)通路為補(bǔ)腎通絡(luò)方治療膝骨性關(guān)節(jié)的潛在作用靶點(diǎn)。其中TNF 信號(hào)通路可介導(dǎo)炎性反應(yīng)，加重膝骨性關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)［15］；MAPK 信號(hào)通路可促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟，且可抑制軟骨細(xì)胞的凋亡［16-17］；HIF- 1 信號(hào)通路可促進(jìn)軟骨細(xì)胞形成，且維持其生存能力，可使其適應(yīng)缺氧環(huán)境［18］。

綜上所述，本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了補(bǔ)腎通絡(luò)方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，從分子水平方面對(duì)補(bǔ)腎通絡(luò)方的多通路、多成分、多靶點(diǎn)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了闡述。補(bǔ)腎通絡(luò)方可能通過調(diào)控炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖凋亡發(fā)揮療效，這為該方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供了理論依據(jù)。但本研究也有一定的局限性，如數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)不全，忽略了藥物成分相互作用、中藥成分含量、體內(nèi)其他藥物代謝動(dòng)力學(xué)影響等，因此還需進(jìn)一步研究證實(shí)。