紅豆杉內(nèi)生真菌Trichoderma sp.次生代謝產(chǎn)物及其抗菌活性研究

黃澤雕　王文靜　廖梁秀　鮮鵬杰　楊小龍

摘要：目的 從紅豆杉內(nèi)生木霉屬真菌MPT-009的次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的單體化合物。方法 采用硅膠、ODS、Sephadex-LH20柱層析和半制備高效液相等方法進行分離，利用高分辨率質(zhì)譜、NMR波譜數(shù)據(jù)和電子圓二色譜（ECD）計算等方法確定化合物結(jié)構(gòu)，通過二倍稀釋法評價化合物對8種臨床耐藥性細菌和7種植物病原真菌的抗菌活性。結(jié)果 從木霉屬真菌MPT-009大米發(fā)酵產(chǎn)物中共分離得到了一個新的聚酮化合物trichoketide F （1）和6個已知化合物10-deacetylkoningiopisin D （2）、koninginin A （3）、koninginin B （4）、koninginin D （5）、koninginin E （6）、isoharziandione （7）。化合物1對馬鈴薯黃萎病菌、水稻紋枯病菌、油菜菌核菌、棉花枯萎病菌、草莓黑斑病菌、玉米小斑病菌顯示一定的抑制活性，MIC值為12.5～50 μg/mL。結(jié)論 本文對紅豆杉內(nèi)生真菌Trichoderma sp.的次生代謝產(chǎn)物進行了深入研究，分離得到1個新化合物，豐富了木霉屬真菌代謝產(chǎn)物，且該化合物對油菜菌核病菌具有較好的抑制活性，MIC值為12.5 μg/mL。

關(guān)鍵詞：紅豆杉；木霉屬；聚酮；ECD計算；抗菌活性

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Secondary metabolites and their antimicrobial activities from endophytic fungus Trichoderma sp. isolated from Taxus wallichiana var. chinensis （Pilg.） Florin

Huang Zediao1， Wang Wenjing1， Liao Liangxiu1， Xian Pengjie2， and Yang Xiaolong1

（1 The Modernization Engineering Technology Research Center of Ethnic Minority Medicine of Hubei Province，

School of Pharmaceutical Sciences， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074;

2 School of Pharmaceutical Sciences， Chongqing University， Chongqing 401331）

Abstract Objective To find monomer compounds with antimicrobial activity from the secondary metabolites of the endophytic fungus Trichoderma sp. MPT-009 isolated from Taxus wallichiana var. Chinensis （Pilg.） Florin. Methods Separation is carried out by silica gel， ODS， Sephadex-LH20 column chromatography， and semi-preparative HPLC. The structures were determined by high-resolution mass spectrometry， NMR spectral data， and electron circular discography （ECD） calculation. The antimicrobial activities against eight clinically resistant bacteria and seven plant pathogenic fungi of isolated compounds were evaluated by the double dilution method. Results A new polyketone compound trichoketide F （1）， together with six known compounds， 10-deacetylkoningiopisin D （2）， koninginin A （3）， koninginin B （4）， koninginin D （5）， koninginin E （6） and isoharziandione （7） were isolated from the rice fermentation product of the endophytic fungus Trichoderma sp MPT-009. Compound 1 showed certain inhibitory activity against Verticillium dahliae Kleb， Rhizoctonia solani， Fusarium oxysporumf. sp. vasinfectum， Sclerotinia sclerotiorum， Alternaria fragriae， and Helminthosporium maydis with MIC values of 12.5～50 μg/mL.

Conclusion In this paper， we investigated the secondary metabolites and their antimicrobial activities from Trichoderma sp.， resulting in the isolation of a new polyketone that enriched the metabolites of Trichoderma sp. Furthermore， compound 1 exhibited moderate inhibitory activity against Sclerotinia sclerotiorum with a MIC value of 12.5 μg/mL.

Key words Taxus wallichiana var. chinensis （Pilg.） Florin; Trichoderma sp.; Polyketone; ECD calculation; Antimicrobial activities

植物內(nèi)生真菌是指可以在健康植物組織中被檢測到的微生物[1]，由于整個生命周期都存在于寄主植物組織內(nèi)，它們能夠產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的次級代謝產(chǎn)物。在與宿主植物長期互利共存的過程中，內(nèi)生真菌甚至能產(chǎn)生與宿主結(jié)構(gòu)相同或類似的代謝產(chǎn)物，是微生物化學(xué)研究的熱點[2]。1993年，Stierle等[3]從短葉紅豆杉的樹皮中分離出1株內(nèi)生真菌Taxomyces andreana能夠產(chǎn)生與紫杉醇結(jié)構(gòu)相似的化合物；Li等[4]從雷公藤植物內(nèi)生真菌（Cryptosporiopsis cf. quercina）中分離得到的四胺酸隱球菌素，具有強大的抗真菌活性，對稻瘟菌的最低抑制濃度為0.39 ?g/mL；從澳大利亞植物黑刺蛇（Kennedia nigriscans）中分離得到的鏈霉菌（Streptomyces sp.）NRRL 30562可以產(chǎn)生多種munumbicin類廣譜抗生素，其中munumbicin D對惡性瘧原蟲有很強的抑制活性，IC50值為4.5 ng/mL[5]。以上研究實例說明植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物不僅是藥物先導(dǎo)化合物的重要源泉，在農(nóng)業(yè)方面也具有重要研究價值。

植物病原真菌是造成嚴重植物病害的罪魁禍首，嚴重影響著農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6-10]，木霉屬真菌作為一種著名的生物防治劑，被廣泛用于植物真菌病害的防治。國際上已有多種木霉生物防治劑產(chǎn)品注冊登記，并進行商業(yè)化生產(chǎn)。如利用哈茨木霉Trichoderma harzianum Rifai和綠木霉T. virens （J.H. Mill.， Giddens & A.A. Foster） Arx生產(chǎn)的商業(yè)制劑TRICHODEXXTM和Soil-GardTM具有廣譜的抗植物病源真菌活性，用于玉米、大豆、黃瓜等作物中絲核菌屬引起的植物病害的防治[11]。研究表明，木霉屬真菌的次級代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，包括聚酮、萜類、非核糖體肽、甾體等，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌的活性[12-14]。次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性是木霉屬真菌有效生物防治潛力的來源，因此從木霉菌中尋找具有抗植物病原真菌活性的化合物對農(nóng)業(yè)的發(fā)展有重要的意義[15-16]。本研究以1株分離自紅豆杉果實的木霉屬真菌MPT-009為研究對象，從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到7個化合物，包含1個新的聚酮化合物和6個已知化合物，通過高分辨率質(zhì)譜、核磁波譜數(shù)據(jù)和電子圓二色譜（ECD）計算等方法對化合物結(jié)構(gòu)進行鑒定，確定為：trichoketide F （1），10-deacetylkoningiopisin D （2），koninginin A （3），koninginin B （4），koninginin D （5），koninginin E （6）和isoharziandione （7）。并對單體化合物的抗植物病源真菌和臨床耐藥細菌活性進行了測試，其中化合物1對油菜菌核病具有良好的抑制活性，最小抑菌濃度為12.5 μg/mL。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

Autopol IV自動旋光儀（美國喬治亞州魯?shù)婪蚬荆籆hirascan Plus圓二色性分光計（英國薩里郡萊瑟黑德英國應(yīng)用光物理有限公司）；IRTracer-100紅外分光光度計（日本京都島津）；UH5300紫外分光光度計（日本東京日立有限公司）；Bruker Avance Ⅲ 600 MHz和DRX-500 MHz核磁共振儀，（德國卡爾斯魯厄布魯克）Bruker Solari X質(zhì)譜儀（德國卡爾斯魯厄Bruker）；安捷倫1260 Infinity II液相色譜儀（美國加利福尼亞州帕洛阿爾托安捷倫科技公司），Sephadex LH-20（瑞典烏普薩拉安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司），硅膠（200～300目；中國安徽良辰股份有限公司）。

1.1.2 菌株來源

菌株MPT-009于2016年7月從采自中國重慶的紅豆杉果實中分離出來，因其PDA固體培養(yǎng)物的甲醇提取物經(jīng)初步抗菌活性篩選顯示較強活性，通過內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer region， ITS）序列進行比對，初步鑒定為木霉屬真菌（Trichoderma sp.）。真菌標本（編號：MPT-009）保存于中南民族大學(xué)藥學(xué)院。臨床耐藥細菌為：耐碳青霉烯銅綠假單胞菌（carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa）、耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii）、耐碳青霉烯大腸埃希菌（carbapenem-resistant Escherichia coli）、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、多耐藥性表皮葡萄球菌（multi-drug resistant Staphylococcus epidermidis）、耐多藥糞腸球菌（multi-drug resistant Enterococcus faecalis）、多耐藥性屎腸球菌（multi-drug resistant Enterococcus faecium）。植物病源真菌：馬鈴薯黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、油菜菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）、草莓黑斑病菌（Alternaria fragriae）、玉米小斑?。℉elminthosporium maydis）、蘋果輪紋病菌（Botryospuaeria berengeriana）?；钚詼y試菌種由陸軍軍事醫(yī)科大學(xué)提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1） 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar， PDA）：新鮮去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15-20 g，去離子水1000 mL。

（2） 種子液培養(yǎng)基（高氏培養(yǎng)基）：玉米漿2 g，KNO3 0.1 g，NaCl 0.05 g，K2HPO4 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001g，去離子水1000 mL。

（3） 大米固體培養(yǎng)基：大米100 g，去離子水80 mL。

（4） LB培養(yǎng)基（細菌培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，去離子水1000 mL。

（5） PDB培養(yǎng)基（真菌培養(yǎng)基）：馬鈴薯浸粉 3 g，葡萄糖 20 g，去離子水 1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵

將菌株MPT-009在28 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)物切成小塊并轉(zhuǎn)移到含有300 mL高氏培養(yǎng)基的燒瓶（500 mL）中，

28 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)5 d獲得種子液，然后接種到無菌的大米固體培養(yǎng)基中（200×500 mL錐形瓶，每瓶包含100 g大米和80 mL蒸餾水），于28 ℃靜置培養(yǎng)40 d。

1.2.2 化合物分離純化

發(fā)酵完成后，用兩倍體積的甲醇提取發(fā)酵物，減壓濃縮，然后用乙酸乙酯萃取3次，得到100 g粗提取物。使用二氯甲烷/甲醇作為流動相，以100：1到0：1（V/V）的梯度對乙酸乙酯提取物進行硅膠柱色譜分離，得到五個餾分（Fr.A～Fr.E）。

用石油醚/乙酸乙酯（5：1至1：1，V/V）進行硅膠柱分離，將組分B（7.2 g）進一步分離為3個亞組分（Fr.B1～Fr.B3）。使用Sephadex LH-20柱（二氯甲烷/甲醇，1：1，V/V）進一步純化Fr.B2組分，然后通過半制備反相C18 HPLC（MeCN–H2O，55：45，V/V）純化得到化合物7（4 mg，tR=44 min）。使用Sephadex LH-20柱（二氯甲烷/甲醇，1：1，V/V）進一步純化Fr.B3，再通過半制備HPLC（MeOH–H2O，80：20，V/V）得到化合物4

（5 mg，tR=19 min）。C組分（20 g）通過硅膠柱進行分離，用二氯甲烷/甲醇（50：1至1：1，V/V）洗脫，獲得五個亞組分（Fr.C1～Fr.C5）。依次采用Sephadex LH-20柱（二氯甲烷/甲醇，1：1，V/V）和硅膠柱（石油醚/乙酸乙酯，10：1至1：1）進一步分離Fr.C2亞組分，然后通過半制備HPLC（MeCN-H2O，65：35，V/V）得到化合物5（5 mg，tR=18 min）和6（5 mg，tR=20 min）。依次采用Sephadex LH-20柱（二氯甲烷/甲醇，1：1，V/V）和硅膠柱（石油醚/乙酸乙酯，10：1至1：1，V/V）進一步分離Fr.C3亞組分，然后用半制備HPLC（正己烷-異丙醇，70：30，V/V）得到化合物1（5 mg，tR=20 min）和化合物2（10 mg，tR =23 min）。將部分D（15 g）進行硅膠柱分離（二氯甲烷/甲醇，10：1，V/V）得到3個亞組分（Fr.D1～Fr.D3）。Fr.D2組分通過Sephadex LH-20柱（二氯甲烷/甲醇，1：1，V/V）和硅膠柱（石油醚/乙酸乙酯，5：1至1：1，V/V）分離，再采用半制備HPLC（MeOH-H2O，55：45，V/V）得到化合物3（7 mg，tR=28 min）。

1.2.3 抑菌活性測試

單體化合物抗真菌活性評價（表1）：采用二倍稀釋法評價單體化合物的抗植物病原真菌活性。具體步驟下：使用DMSO作為溶劑將酮康挫、待測單體化合物配置成濃度為10 μg/mL的樣品。將抗菌活性所需的PDB培養(yǎng)基100 mL，分裝至500mL錐形瓶中。高壓蒸汽滅菌后晾涼備用。選取實驗所需的7株植物病原真菌接種至PDB培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min振搖培養(yǎng)48 h。在超凈工作臺中取100 mL PDB培養(yǎng)基然后加入1 mL真菌液稀釋100倍。采用96孔板進行活性檢測，設(shè)置空白（DMSO）、陽性對照（酮康挫）、待測樣品、陰性對照（無菌水），每組平行設(shè)置3個重復(fù)。在96孔板的第一排加入198 μL稀釋后的菌液，第二至八排中加入100 μL稀釋后的菌液。第一排孔中分別加入DMSO、無菌水、樣品和酮康唑各2 μL，移液槍抽吸混合均勻（此時第一排孔的樣品與陽性對照的濃度均為100 μg/mL）后吸取100 μL液體加入到第二排，將其混合均勻后吸取100 μL液體加入到第三排，后面幾排操作相同，最后一排孔中吸出100 mL混合液打入廢液缸中，使每排樣品終濃度依次為100 、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56和0.78 μg/mL。將處理好的96孔板置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每隔

4 h觀察1次，待陰性對照組長滿真菌記錄活性結(jié)果，將最后一排澄清的孔所對應(yīng)的樣品濃度定為該化合物的最小抑菌濃度，同時記錄下陽性對照的最小抑菌濃度。將觀察完結(jié)果的96孔板及所用實驗器材進行滅菌后處理。

單體化合物抗細菌活性評價（表2）：采用二倍稀釋法評價單體化合物的抗臨床耐藥細菌活性。具體步驟如下：配制LB培養(yǎng)基將4 mL培養(yǎng)基分裝到7支

12 mL試管中，高壓蒸汽滅菌后晾涼備用。選取實驗所需的7株臨床耐藥細菌，分別接種至已滅菌處理的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min振搖過夜培養(yǎng)約12 h，

待培養(yǎng)液渾濁且不沉淀，培養(yǎng)完成。使用DMSO溶液將陽性對照（環(huán)丙沙星）和待測單體化合物分別配置成濃度為10 μg/mL的溶液。在超凈工作臺中取100 mL LB培養(yǎng)基，然后加入試管中培養(yǎng)好的細菌液體100 μL，將其稀釋1000倍。采用96孔板進行活性檢測，設(shè)置陽性對照組（環(huán)丙沙星），陰性對照（無菌水）、空白（DMSO）、待測樣品，每組設(shè)置3個平行。在96孔板的第一排加入198 μL稀釋后的菌液，第二至八排中分別加入100 μL稀釋后的菌液。第一排孔中分別加入DMSO、環(huán)丙沙星、待測樣品、無菌水各2 μL，稀釋操作同抗真菌活性實驗。將處理好的96孔板置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，每隔

2 h觀察1次，待陰性對照組長滿細菌，記錄活性結(jié)果。將最后一排澄清的孔所對應(yīng)的樣品濃度定為該化合物的最小抑菌濃度，同時記錄陽性對照的最小抑菌濃度。將觀察完結(jié)果的96孔板及所用實驗器材進行滅菌后處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀物，根據(jù)其HRESIMS數(shù)據(jù)（m/z 283.1903 [M+H]+；C16H25O4的計算值為283.1909），確定分子式為C16H24O4，具有5個不飽和度。紅外光譜中在3393 cm-1處有一個羥基的寬吸收峰，在1616 cm-1處有一個強吸收峰，提示結(jié)構(gòu)中存在α，β-不飽和羰基片段。1H和13C NMR并結(jié)合DEPT圖譜（表3）顯示：1個α，β-不飽和酮羰基碳（δC 194.7），2個sp2雜化碳（δC 176.3，110.6），3個氧化的sp3雜化亞甲基[δH 5.04 （1H，m），3.92（1H，m）和3.57（1H，m）；δC 83.7，70.7和66.3]，1個甲基[δH 0.85（3H，t，J=6.7 Hz）；δC 14.0]，以及九個sp3雜化的亞甲基信號。以上1D NMR數(shù)據(jù)與10-deacetylkoningiopisin D（2）高度相似。進一步分析化合物1的二維圖譜，發(fā)現(xiàn)1H-1H COSY譜中顯示兩個自旋耦合系統(tǒng)H-2–H-4和H-7–H-16。同時，HMBC譜中觀察到H-2與C-1、H-3與C-1/C-5、H-4與C-6、H-7與C-4/C-6以及H-8與C-5的相關(guān)信號（圖1），確定其平面結(jié)構(gòu)與2相同，如圖2所示。

化合物1的立體結(jié)構(gòu)通過耦合常數(shù)、NOESY相關(guān)信號和ECD計算確定。H-2（δH 3.92）與H-4a（δH 2.51）之間存在NOESY相關(guān)信號，且H-2與H-3a（δH 1.76）之間的耦合常數(shù)為11.0 Hz，說明H-2位于直立鍵上。H-8和H-10之間的NOESY相關(guān)信號表明這兩個質(zhì)子位于同側(cè)。化合物1與2具有相同的平面結(jié)構(gòu)，但在相同的溶劑中兩者C-8，9，11的NMR數(shù)據(jù)存在明顯差異（1：83.7，44.1，37.8；2：84.4，43.2，37.3），推測化合物1中C-8和C-10的立體構(gòu)型與2不同。由此，化合物1的立體構(gòu)型有4種可能的情況（1a-2R，8S，10S；1b-2R，8R，10R；1c-2S，8R，10R和1d-2S，8S，10S）。采用TDDFT理論在B3LYP/6-311++G（d，p）//B3LYP/6-31+G（d）水平對這4種不同構(gòu)型在MeOH溶劑中的理論ECD圖譜進行計算，如圖3所示，1a構(gòu)型的計算ECD曲線與實驗數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物1的絕對構(gòu)型為2R，8S，10S。

化合物2：白色固體；ESI-MS m/z：283.2 [M+H]+;1H NMR （500 MHz， DMSO-d6 ） δH： 3.93 （1H， dd， J=11.1， 4.7 Hz， H-2）， 1.76 （1H， dd， J=12.4， 5.3 Hz， H-3a）， 2.10 （1H， m， H-3b）， 2.51 （1H， m， H-4a）， 2.39 （1H， m， H-4b）， 2.78 （1H， m， H-7a）， 2.39 （1H， m， H-7b）， 4.93 （1H， d， J=2.0 Hz， H-8）， 1.82 （1H， ddd， J=11.6， 9.7， 4.7 Hz， H-9a）， 1.63 （1H， m， H-9b）， 3.50 （1H， m， H-10）， 1.36 （1H， m， H-11a）， 1.23 （1H， m， H-11b）， 1.23 （1H， m H-12）， 1.23 （1H， m， H-13）， 1.23 （1H， m， H-14）， 1.23 （1H， m， H-15）， 0.84 （3H， d， J=6.7 Hz， H-16）， 13C NMR （125 MHz DMSO-d6） δC： 194.6 （ C-1）， 70.6 （C-2）， 31.3 （C-3）， 22.0 （C-4）， 176.4 （C-5）， 110.5 （C-6）， 37.2 （C-7）， 84.4 （C-8）， 43.2， （C-9）， 66.4 （C-10）， 30.1 （C-11）， 25.0 （C-12）， 28.8 （C-13）， 31.3 （C-14）， 21.9 （C-15）， 13.9 （C-16）。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]對照基本一致，因此鑒定化合物2為10-deacetylkoningiopisin D。

化合物3：白色固體；ESI-MS m/z：285.2 [M+H]+; 1H NMR （500 MHz， CDCl3 ） δH：3.89 （1H， d， J=2.5 Hz， H-1）， 1.57 （1H， m， H-2a）， 1.85 （1H， m， H-2b）， 1.85 （1H， m， H-3a）， 1.96 （1H， m， H-3b）， 3.61 （1H， dd， J=5.4， 11.6 Hz， H-4）， 1.57 （1H， m， H-6）， 1.72 （1H， m， H-8a）， 2.11 （1H， m， H-8b）， 1.55 （1H， m， H-8a）， 2.25 （1H， ddd， J=13.0， 13.0， 3.5 Hz， H-8b）， 4.32 （1H， d， J=2.1 Hz， H-9）， 4.03 （1H， dt， J=7.0， 2.1， Hz， H-10）， 1.50 （1H， m， H-11a）， 1.60 （1H， m， H-11b）， 1.30 （1H， m， H-12）， 1.30 （1H， m， H-13）， 1.30 （1H， m， H-14）， 1.30 （1H， m， H-15）， 0.90 （3H， d， J=9.0 Hz， H-16）， 13C NMR （125 MHz CDCl3） δC： 72.8 （C-1）， 30.7 （C-2）， 25.2 （C-3）， 69.9 （C-4）， 109.2 （C-5）， 41.3 （C-6）， 20.5 （C-7）， 27.2 （C-8）， 79.1， （C-9）， 79.5 （C-10）， 35.2 （C-11）， 25.6 （C-12）， 29.1 （C-13）， 31.7 （C-14）， 22.6 （C-15）， 14.1 （C-16）。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]對照基本一致，因此鑒定化合物3為koninginin A。

化合物4：白色固體；ESI-MS m/z：283.2 [M+Na]+; 1H NMR （500 MHz， CDCl3） δH：2.50 （1H， d， J=17.0 Hz， H-2a）， 2.60 （1H， dd， J=12.5， 5.0 Hz， H-2b）， 1.80 （1H， dd， J=5.5， 2.2 Hz， H-3a）， 2.40 （1H， d， J=13.5 Hz， H-3b），? 4.10 （1H， d， J=12.5 Hz， H-4）， 2.00 （1H， m， H-7a）， 2.10 （1H， m， H-7b）， 1.70 （1H， dd， J=13.5， 10.5 Hz， H-8a）， 2.00 （1H， d， J =2.0 Hz， H-8b）， 3.80 （1H， d， J=5.5 Hz， H-9）， 3.70 （1H， d， J=6.5 Hz， H-10）， 1.60 （1H， m， H-11a）， 1.70 （1H， m， H-11b）， 1.30 （1H， m， H-12）， 1.30 （1H， m， H-13）， 1.30 （1H， m， H-14）， 1.30 （1H， m， H-15）， 0.90 （3H， d， J=6.5Hz， H-16）， 13C NMR （125 MHz CDCl3） δC： 198.1 （ C-1）， 27.1 （C-2）， 29.0 （C-3）， 71.0 （C-4）， 171.3 （C-5）， 109.1 （C-6）， 17.6 （C-7）， 22.7 （C-8）， 80.8， （C-9）， 73.2 （C-10）， 32.8 （C-11）， 25.4 （C-12）， 29.2 （C-13）， 31.7 （C-14）， 22.6 （C-15）， 14.0 （C-16）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]對照基本一致，因此鑒定化合物4為koninginin B。

化合物5：白色固體；ESI-MS m/z：299.2 [M+ H]+; 1H NMR （500 MHz， CDCl3） δH：2.60 （1H， ddd， J=17.0， 5.6， 4.7 Hz， H-2）， 2.30 （1H， m， H-2）， 2.20 （1H， m， H-3）， 4.49 （1H， q， J=4.8 Hz， H-4）， 4.68 （1H， dd， J=1.0， 2.0 Hz， H-7）， 1.60 （3H， m， H-8a）， 2.00 （2H， m， H-8b）， 4.11 （1H， ddd， 1H， J=12.1， 4.6， 2.2 Hz， H-9）， 3.72 （1H， q， J=6.4 Hz， H-10）， 1.60 （3H， m， H-11）， 1.60 （3H， m， H-12），1.30 （1H， m， H-12）， 1.30 （1H， m， H-13）， 1.30 （1H， m， H-14）， 1.30 （1H， m， H-15）， 0.88 （t， 3H， J=6.8 Hz， H-16） 13C NMR （125 MHz CDCl3） δC： 195.8 （ C-1）， 33.3 （C-2）， 28.8 （C-3）， 65.7 （C-4）， 171.5 （C-5）， 111.9 （C-6）， 57.1 （C-7）， 31.7 （C-8）， 77.7， （C-9）， 73.2 （C-10）， 32.4 （C-11）， 25.1 （C-12）， 29.1 （C-13）， 32.2 （C-14）， 22.6 （C-15）， 14.0 （C-16）. 以上數(shù)據(jù)與文獻[19]對照基本一致，因此鑒定化合物5為koninginin D。

化合物6：白色固體；ESI-MS m/z：283.2 [M+H]+; 1H NMR （500 MHz， CDCl3 ） δH：2.61 （1H， d， J=17.0 Hz， H-2）， 2.45 （1H， m， H-3）， 4.40 （1H， d， J=5.3 Hz， H-4）， 2.00 （1H， m， ， H-7）， 2.10 （1H， m， H-7b）， 1.70 （1H， dd， J=13.5， 10.5 Hz， H-8）， 3.90 （1H， ddd， J=12.9， 5.1， 2.4 Hz， H-9）， 3.65 （1H， d， J=2.9， 7.2 Hz， H-10）， 1.65 （1H， m， H-11）， 1.30 （1H， m， H-12）， 1.30 （1H， m， H-13）， 1.30 （1H， m， H-14）， 1.30 （1H， m， H-15）， 0.89 （3H， d， J=6.8 Hz， H-16）， 13C NMR （125 MHz CDCl3） δc： 197.6 （ C-1）， 33.3 （C-2）， 29.0 （C-3）， 65.9 （C-4）， 169.3 （C-5）， 111.4 （C-6）， 17.6 （C-7）， 22.8 （C-8）， 81.3 （C-9）， 73.4 （C-10）， 32.7 （C-11）， 25.1 （C-12）， 29.3 （C-13）， 31.8 （C-14）， 22.6 （C-15）， 14.1 （C-16）. 以上數(shù)據(jù)與文獻[19]對照基本一致，因此鑒定化合物6為koninginin E。

化合物7：白色固體；ESI-MS m/z：301.2 [M+H]+; 1H NMR （500 MHz， CDCl3 ） δH： 2.28 （1H， d， J=8.0 Hz， H-1）， 2.90， （1H， m， H-4a），2.05， （1H， m， H-4b）， 2.94 （1H， m， H-5）， 1.90 （1H， dd， J=13.0， 6.5 Hz， H-7a）， 1.30 （1H， dd， J=14.0， 6.5 Hz， H-7b）， 1.40 （1H， t， J=13.6 Hz， H-8a）， 2.45 （1H， m， H-8b）， 2.57 （1H， d， J=16.0 Hz， H-12a）， 2.45 （1H， m， H-12b）， 2.49 （1H， m， H-14）， 2.03 （1H， m， H-15a）， 1.55 （1H， d， J=10.5 Hz， H-15b）， 1.00 （3H， s， H-16）， 0.99 （3H， s， H-17）， 1.12 （3H， d， J=7.2 Hz， H-18）， 1.52 （3H， s， H-19）， 2.12 （3H， s， H-20）， 13C NMR （125 MHz， CDCl3） δc： 40.1 （ C-1）， 59.4 （C-2）， 214.6 （C-3）， 42.7 （C-4）， 29.9 （C-5）， 51.7 （C-6）， 29.9， （C-7）， 29.6 （C-8）， 149.5 （C-9）， 146.6 （C-10）， 198.0 （C-11）， 60.1 （C-12）， 49.7 （C-13）， 53.1 （C-14）， 26.8 （C-15）， 25.2 （C-16）， 23.2 （C-17）， 21.1 （C-18）， 20.8 （C-19）， 22.7 （C-20）. 以上數(shù)據(jù)與文獻[20]對照基本一致，因此鑒定化合物7為isoharziandione。

2.2 體外抗菌活性

對化合物進行抗臨床耐藥細菌活性測試，抗植物病原真菌活性結(jié)果（表1）顯示1對油菜菌核菌具有較強的抑制作用，MIC值為12.5 μg/mL；對棉花枯萎病菌、草莓黑斑病菌、玉米小斑病菌顯示中等強度的抑制活性，MIC值為25 μg/mL；對水稻紋枯病菌、馬鈴薯黃萎病菌、病菌顯示較弱的抑制活性，MIC值為50 μg/mL。抗臨床耐藥性細菌活性結(jié)果顯示化合物1～7對7種臨床耐藥性細菌均無明顯活性（MIC>

100 μg/mL）（表2）。

3 結(jié)論與討論

本研究從紅豆杉來源木霉屬真菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到1個新化合物和6個已知化合物，包括聚酮和萜，豐富了木霉屬真菌的次生代謝產(chǎn)物，說明植物內(nèi)生真菌是新穎天然產(chǎn)物的重要資源庫。化合物1對馬鈴薯黃萎病菌、水稻紋枯病菌、油菜菌核菌、棉花枯萎病菌、草莓黑斑病菌、玉米小斑病菌具有一定的抑菌活性，MIC值為12.5～50 μg/mL，進一步證實了木霉屬真菌的代謝產(chǎn)物具有較好的抗植物病原真菌活性，是生物防治的潛力菌種?；衔?對油菜菌核菌的抑制作用較強（MIC值12.5 μg/mL），可在此基礎(chǔ)上對該菌株進一步挖掘，通過優(yōu)化發(fā)酵條件等對其次級代謝產(chǎn)物進行深入研究，以期獲得更多天然抗菌活性化合物，為新型農(nóng)藥的研發(fā)提供基礎(chǔ)。化合物1和2為差向異構(gòu)體，C-10的立體構(gòu)型不同，但是化合物1對多株植物病原真菌表現(xiàn)出抗菌活性，而化合物2對測試菌株均無活性，說明C-10為該類化合物抗菌活性的關(guān)鍵位點，為后續(xù)該類化合物的結(jié)構(gòu)修飾提供指導(dǎo)。

參 考 文 獻

Yang X L， Zhang J Z， Luo D Q. The taxonomy， biology and chemistry of the fungal Pestalotiopsis genus[J]. Nat Prod Rep， 2012， 29（6）： 622-641.

Tan R X， Zou W X. Endophytes： A rich source of functional metabolites[J]. Nat Prod Rep， 2001， 18（4）： 448-459.

劉媛媛， 閆芳， 張雪， 等. 莢果蕨植物內(nèi)生真菌Penicillium sp. SYP-F-7610的抑菌活性次級代謝產(chǎn)物研究[J]. 中國抗生素雜志， 2022， 47（5）： 501-506.

Li J Y， Strobel G A， Lobkovsky E， et al. Cryptocin， a potent tetramic acid antimycotic from the endophytic fungus Cryptosporiopsis cf. quercina[J]. J Org Lett， 2000， 2（6）： 767-770.

Strobel G， Daisy B， Castillo U， et al. Natural products from endophytic microorganisms[J]. J Nat Prod， 2004， 67（2）： 257-268.

Brotman Y， Kapuganti J G and Viterbo A. Trichoderma[J]. Current Biology， 2010， 20（9）： 390-391.

Salvatore M M and Andolf A， Phytopathogenic fungi and toxici[J]. Toxins， 2021， 13（10）： 689-672.

Doehlemann G， ?kmen B， Zhu W J， et al. Plant pathogenic fungi[J]. Microbiol Spectr， 2017， 5（1）： FUNK-0023-2016.

Li L， Zhu X M， Lin F C， et al. Research on the molecular interaction mechanism between plants and pathogenic fungi[J]. Int J Mol Sci， 2020， 23（9）： 4658-4673.

Knogge W. Fungal pathogenicity[J]. Curr Opin Plant Biol， 2021， 1（4）： 324-328.

朱兆香， 莊文穎. 木霉屬研究概況[J]. 菌物學(xué)報， 2014， 33（6）： 1136-1153.

Vicente I， Baroncelli R， Hermosa R， et al. Role and genetic basis of specialised secondary metabolites in Trichoderma ecophysiology[J]. Fungal Biol Rev， 2021， 39： 83-99.

Zhang J L， Tang W L， Zhang X X，et al. Trichoderma： A treasure house of structurally diverse secondary metabolites with medicinal importance[J]. Front Microbiol， 2021，12： 723828-723849.

Khan R A A， Najeeb S， Hussain S， et al. Bioactive secondary metabolites from Trichoderma sp. against phytopathogenic fungi[J]. Microorganisms， 2020， 8（6）： 817-839.

陳長錕， 吳婷， 何若男， 等. 海洋木霉屬真菌次生代謝產(chǎn)物活性研究進展[J]. 海峽藥學(xué)， 2020， 32（9）：1-5.

韓長志. 植物病原拮抗菌木霉屬真菌的研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2016， 32（4）： 946-952.

Shi X S， Wang D J， Li X M， et al. Antimicrobial polyketides from Trichoderma koningiopsis QA-3， an endophytic fungus obtained from the medicinal plant Artemisia argyi[J]. RSC Adv， 2017， 7（81）： 51335-51342.

Almassi F， Ghisalberti E L， Narbey M J， et al. New antibiotics from strains of Trichoderma harzianum[J]. J Nat Prod， 1991， 54（2）： 396-402.

Parker S R， Cutler H G， Peter P R. Koninginin E： isolation of a biologically active natural product from Trichoderma koningii[J]. Biosci Biotech Biochem， 1995， 59（9）： 1747-1749.

Hisalbe M L， Catherine R， White A H， et al. Harziandione， a new class of diterpene from Trichoderma harzianum[J]. J Nat Prod， 1992， 54（11）： 1690-1694.

收稿日期：2022-11-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金（No. 81872755）；中南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（No. CZQ22010）

作者簡介：黃澤雕，男，生于1995年，在讀碩士研究生，研究方向為真菌次級代謝產(chǎn)物分離，E-mail： 18872783771@163.com

*通信作者，E-mail： yxl19830915@163.com