青蒿素抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥通路的分子機(jī)制研究

張書滔　童宇　郭小嵐　陳俊?！≡S光亞　唐勇　鄭露露　時政

摘要：目的 分別以P2X7、外泌體以及瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）為作用靶點，研究青蒿素（ART）抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥通路的分子機(jī)制。方法 培養(yǎng)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，利用膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）免疫熒光鑒定原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度；MTT法檢測ART對細(xì)胞活性的影響；脂多糖（LPS）處理原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型；分為空白對照組，ART組，外泌體抑制劑組，P2X7受體抑制劑組，TRPV1受體抑制劑組，TRPV1受體激動劑組，通過ELISA法和吸光光度法檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子的含量（TNF-α、IL-1β、IL-6及NO）。結(jié)果 GFAP陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)95%表明成功分離培養(yǎng)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞；300 ng/mL的LPS處理12 h是刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建炎癥模型的最佳濃度和時間；10 μmol/mL的ART處理12 h 可以達(dá)到最佳的抗炎效果，并且當(dāng)濃度小于20 μmol/mL時，對細(xì)胞活性基本無影響；抑制P2X7受體的表達(dá)和外泌體的釋放均能降低細(xì)胞中炎癥因子TNF-α的含量，但不能與ART產(chǎn)生協(xié)同降低的效果；抑制TRPV1受體增加了細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO表達(dá)，激活TRPV1受體可降低TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO表達(dá)，并且ART與TRPV1受體激動劑合用時，能協(xié)同降低炎性因子表達(dá)。結(jié)論 青蒿素除了已知的通路發(fā)揮其抗炎作用之外，還有可能通過TRPV1通路發(fā)揮其抗炎作用。本研究為青蒿素發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制提供了新的方向。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)炎癥；青蒿素；星形膠質(zhì)細(xì)胞；P2X7；外泌體；TRPV1

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

The preliminary molecular mechanism study of artemisinin inhibit astrocytes inflammatory pathway

Zhang Shutao1， Tong Yu1， Guo Xiaolan1，Chen Junxi1， Xu Guangya2， Tang Yong3， Zheng Lulu4， and Shi Zheng1

（1 School of Clinical Medicine， Affiliated Hospital of Chengdu University， Chengdu 610106; 2 School of Basic Medicine of Chengdu University， Chengdu 610106; 3 School of Health and Rehabilitation of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075; 4 College of Food and Bioengineering of Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective To investigate the molecular mechanism of artemisinin （ART） inhibiting the inflammation pathway of astrocytes by targeting P2X7， exosomes and transient receptor potential vanilic acid subtype 1 （TRPV1）. Methods Mouse primary astrocytes were cultured， and the purity of primary astrocytes was determined by GFAP immunofluorescence. The effect of ART on cell activity was detected by MTT assay. Primary astrocytes were treated with lipopolysaccharide （LPS） to construct a cellular inflammation model. They were divided into blank control group， ART group， exosome inhibitor group， P2X7 receptor inhibitor group， TRPV1 receptor inhibitor group and TRPV1 receptor agonist group. The contents of inflammatory factors （TNF-α， IL-1β， IL-6 and NO） in cell supernatant were detected by ELISA and absorbance spectrophotometry， then determine the best anti-inflammatory effect of each group. Results The number of GFAP positive cells was 95%， indicating that the primary mouse astrocytes were successfully isolated and cultured 300 ng/mL LPS treatment for 12 h was the best concentration and time to stimulate astrocytes to construct the inflammatory model.10 μmol/mL ART for 12 h can achieve the best anti-inflammatory effect， and when the concentration is less than 20 μmol/mL， there is no effect on the cell activity. Inhibition of P2X7 receptor expression and release of exosomes can decrease the content of inflammatory cytokine TNF-α in cells， but cannot produce synergistic effect with ART. Inhibitor of TRPV1 receptor increased the expression of TNF-α， IL-1β， IL-6 and NO in cells， and activation of TRPV1 receptor could decrease the expression of TNF-α， IL-1β， IL-6 and NO. ART combined with TRPV1 receptor agonist could cooperatively reduce the expression of inflammatory factors. Conclusion Artemisinin may exert its anti-inflammatory effect through TRPV1 pathway besides known pathways. This study provides a new direction for the molecular mechanism of artemisinin's anti-inflammatory effect.

Key words Neuroinflammation; Artemisinin; Astrocytes; P2X7; Exosomes; TRPV1

神經(jīng)炎癥是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中的固有的免疫細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）激活的免疫應(yīng)答[1]。通常，在CNS損傷、感染、毒素的刺激下或在自身免疫的作用下會出現(xiàn)神經(jīng)炎癥。神經(jīng)炎癥與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，如：阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和多發(fā)性硬化等神經(jīng)退行性疾病[2]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動物大腦中含量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其除了傳統(tǒng)的對神經(jīng)元起支持作用和血腦屏障成分外，還參與調(diào)節(jié)局部血流量、腦代謝、離子穩(wěn)態(tài)和氧化應(yīng)激等過程[3]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在受到損傷后，形態(tài)與功能發(fā)生變化形成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，其不僅產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β和IFN-γ，同時增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)過程，導(dǎo)致神經(jīng)退化甚至凋亡壞死，從而啟動和促進(jìn)炎癥反應(yīng)[4]。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)免疫系統(tǒng)中重要的靶細(xì)胞。

青蒿素（ART）是從復(fù)合花序植物黃花蒿莖葉中提取的有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯的一種無色針狀晶體，經(jīng)化學(xué)改造后可生產(chǎn)多種不同的衍生物[5]，如雙氫青蒿素、青蒿琥酯、SM905和SM933等。青蒿素及其衍生物除了具有抗瘧作用外，還具有強(qiáng)效的抗炎、抗真菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理學(xué)活性[6]。值得注意的是， 越來越多的證據(jù)表明，ART可以作為治療炎癥藥物， 通過作用于炎癥過程治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病。研究表明ART可以在小膠質(zhì)細(xì)胞中通過減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，增加IκB-α的表達(dá)，從而阻斷NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核上，進(jìn)而抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[7]。雙氫青蒿素通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT的磷酸化和下調(diào)炎癥因子IL-1β和IL-6明顯減輕了LPS誘導(dǎo)的抑郁樣行為和認(rèn)知功能障礙[8]。

瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）作為配體門控的非選擇性陽離子通道，是瞬時受體點位（TRP）蛋白中最具特征的成員。越來越多的證據(jù)表明，TRPV1與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，被認(rèn)為是大多數(shù)癲癇發(fā)作和神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)炎癥中的分子開關(guān)[9]。其廣泛分布于哺乳動物的感覺神經(jīng)纖維中，在非神經(jīng)細(xì)胞如膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞中也存在[10]，與神經(jīng)源性疼痛和炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，可以被多種神經(jīng)炎癥介質(zhì)如緩激肽、前列腺素、ATP、神經(jīng)生長因子（NGF）等直接或間接激活，釋放P物質(zhì)、CGRP等多種神經(jīng)肽類物質(zhì)，參與TNF-α的致炎過程、誘導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥等病理過程[11]。P2X受體是一種非選擇性的ATP門控陽離子通道，其被激活后，使細(xì)胞膜對陽離子更加通透，引起質(zhì)膜去極化，從而導(dǎo)致了一系列的生理或病理變化。近年來，P2X7受體在神經(jīng)炎癥的形成與進(jìn)展調(diào)控作用備受關(guān)注。王玨等[12]通過小鼠實驗證明，在炎癥等病理情況下，局部細(xì)胞可釋放大量ATP和降解產(chǎn)物，這些物質(zhì)濃度的升高可達(dá)到激活小膠質(zhì)細(xì)胞的水平，其中BV-2（小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞）細(xì)胞的P2X7的表達(dá)升高最為強(qiáng)烈，小膠質(zhì)細(xì)胞再進(jìn)一步釋放促炎因子加重神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，通過基因?qū)用娼档蚉2X7的過表達(dá)可能有效抑制神經(jīng)性炎癥反應(yīng)。同時，TRPV1與P2X受體兩者之間存在一定的聯(lián)系，背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞中的P2X7受體參與了TRPV1介導(dǎo)的糖尿病神經(jīng)病理痛（DNP）的過程，并且涉及炎癥反應(yīng)，由p38和ERK信號通路介導(dǎo)[13]。外泌體（exosome）是細(xì)胞外囊泡的一個亞組，大小從30到100 nm不等，由不同的細(xì)胞類型釋放[14]。研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體可以將錯誤折疊的病原蛋白和/或異常表達(dá)的miRNA轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元中，然后作用引發(fā)或傳播神經(jīng)炎癥[15]，且星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體能夠干預(yù)JAK2/STAT3通路從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和凋亡途徑，來緩解癲癇大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的神經(jīng)炎性損傷及凋亡，發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用[16]。綜上所述，P2X7、TRPV1和外泌體均參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，但青蒿素是否通過這3個受體發(fā)揮抗中樞炎癥的機(jī)制尚不清楚。

因此，本文擬通過原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定、炎癥模型的建立、青蒿素抗炎作用濃度時間的考察以及P2X7、外泌體和TRPV1對青蒿素抗炎作用的影響，從而研究P2X7、TRPV1和外泌體在青蒿素抑制LPS刺激原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥方面的作用，為青蒿素的在抗炎作用的分子機(jī)制提供更多實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用出生24～48 h的昆明新生小鼠，母體生殖期間均自由進(jìn)食飲水，環(huán)境溫度和濕度分別維持在25 ℃和60%左右，自然節(jié)律光照。本實驗規(guī)程及方案符合成都大學(xué)動物倫理審查標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑和耗材

基礎(chǔ)高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗青霉素-鏈霉素（美國Hyclone公司）；牛血清白蛋白、Triton X-100、A438079（P2X7受體拮抗劑）、GW4869（外泌體抑制劑）（美國Sigma-Aldrich公司）；Capsaicin（辣椒素，TRPV1受體激動劑）、Capsazepine（辣椒平，競爭性TRPV1受體拮抗劑）（英國Tocris Bioscience公司）；Mouse TNF-α ELISA Kit、Mouse IL-6 ELISA（北京四正柏生物科技有限公司）、Mouse IL-1β ELISA Kit（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）、一氧化氮（NO）測定試劑盒（酶法）（南京建成生物工程研究所）；青蒿素（批號：A0114，成都曼思特生物科技有限公司）。

1.3 小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

取出生24～48 h的新生乳鼠的全腦，剝離整個腦組織，將腦組織完整取出于解剖顯微鏡下小心剝離腦膜和血管，并使用4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗后將組織剪碎成糜狀的組織塊，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化30 min后，取等量含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。離心（15 min， 1000 r/min， 4 ℃），棄上清液，加入適量10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基輕柔緩慢吹打細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)第2天放置于恒溫?fù)u床中200 r/min震搖2 h。

1.4 鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，取出爬片，先加入磷酸緩沖液清洗3次，每次5 min，隨后加入4%的多聚甲醛固定液，固定15 min。固定結(jié)束后，用磷酸緩沖液清洗3次，清洗時間依次為10、5和5 min。用5% BSA+ 0.3% Triton X-100于37 ℃孵箱中孵育1 h。吸走封閉液，加入一抗，4 ℃過夜結(jié)束后，在避光環(huán)境中，用磷酸緩沖液清洗3次，每次10 min，清洗好后，加入二抗，37 ℃孵箱孵育1 h。磷酸緩沖液清洗3次，每次10 min，加入15 μL的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI），室溫避光靜置5 min，磷酸緩沖液漂洗5 min，吸干液體，再加入10 μL防淬滅劑，防止熒光劑的淬滅，置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 LPS炎癥細(xì)胞模型的建立

將對數(shù)生長期的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×105個的密度接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁形態(tài)正常后，分為對照組、LPS不同濃度組（100、200、300、600和1000 ng/mL的LPS處理12 h）、LPS時間干預(yù)組（300 ng/mL的LPS處理0、3、6、12和24 h）。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α水平。

1.6 青蒿素對LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞活性的影響

將對數(shù)生長期的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×105個的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁形態(tài)正常后，分為調(diào)零組（無細(xì)胞，僅加培養(yǎng)基）、空白對照組（有細(xì)胞，有培養(yǎng)基，不加藥）、生理狀態(tài)ART組（ART濃度分別為5、10、20、40、80 μmol/mL）、病理狀態(tài)ART組，邊緣孔以磷酸緩沖液填充，作用12 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔。12 h后，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 5 ng/mL的MTT，放置培養(yǎng)箱孵育2 h后，吸出MTT 溶液，每孔加入100 μL DMSO，然后使用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處吸光度值。細(xì)胞存活率（%）=（A實驗組－

A調(diào)零組）/ （A對照組－A調(diào)零組）×100%。

1.7 青蒿素抗炎作用濃度和時間的考察

實驗分為空白對照組、DMSO組、模型組（300 ng/mL的LPS）、ART不同濃度組（5、7、9、10、20、40和80 μmol/mL的ART處理12 h）、ART不同時間組（10 μmol/mL的ART分別處理0、3、6、12和24 h），每組設(shè)置6個復(fù)孔。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α水平，考察ART最佳的抗炎作用濃度和時間。

1.8 青蒿素對外泌體、P2X7以及TRPV1受體的影響

實驗分為空白對照組、DMSO組、模型組

（300 ng/mL的LPS）、治療組（LPS+DMSO；LPS+

10 μmol/mL ART；LPS+10 μmol/mL GW4869（外泌體抑制劑）；LPS+10 μmol/mL ART+10 μmol/mL GW4869；LPS+10 μmol/mL A438079（P2X7抑制劑）；LPS+10 μmol/mL ART+10 μmol/mL A438079；LPS+10 μmol/mL Capsazepine（辣椒平，競爭性TRPV1拮抗劑）；LPS+10 μmol/mL ART+10 μmol/mL

Capsazepine）。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α水平，考察ART對外泌體、P2X7以及TRPV1受體的作用。

1.9 青蒿素對TRPV1受體的影響

將對數(shù)生長期的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁形態(tài)正常后，分為空白對照組、DMSO組、模型組（300 ng/mL的LPS）、空白藥物組（10 μmol/mL的capsaicin（辣椒素，TRPV1受體激動劑）；10 μmol/mL （capsazepine）、治療組（LPS+DMSO；LPS+10 μmol/mL ART；

LPS+10 μmol/mL capsazepine；LPS+10 μmol/mL

ART+10 μmol/mL capsazepine；LPS+10 μmol/mL

capsaicin；LPS+10 μmol/mL ART+10 μmol/mL capsaicin）。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。由于NO的化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)?shù)幕顫?，它在體內(nèi)代謝會轉(zhuǎn)化成為亞硝酸鹽（NO2﹣）和硝酸鹽（NO3﹣），而亞硝酸鹽又會進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化成為硝酸鹽，因此，本實驗是利用硝酸還原酶將硝酸鹽特異性地還原成為亞硝酸鹽，然后再通過顯色深淺從而測定細(xì)胞上清液中濃度的高低：NO含量=（測定A值－空白A值）/（標(biāo)準(zhǔn)A值－空白A值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（100 μmol/mL）。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)意義。在多組組間的比較采用的是單因素方差分析（one-way Anova）；在組內(nèi)兩兩比較采用的是配對檢驗，整個數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism7作圖統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定結(jié)果

采用GFAP免疫熒光對原代培養(yǎng)的小鼠細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果如圖1，培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿和突起被染成紅色，隨機(jī)選擇5個位置計數(shù)，計算GFAP染色和DAPI染色的比例的平均值，計算出GFAP陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)95%，可用于后續(xù)實驗。

2.2 LPS炎癥細(xì)胞模型的建立

通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α的水平探討LPS炎癥細(xì)胞模型的最佳構(gòu)建條件。結(jié)果如圖2，300 ng/mL的LPS處理12 h時，TNF-α濃度最高，繼續(xù)增加LPS濃度和作用時間，TNF-α的濃度不能顯著升高。故用300 ng/mL的LPS處理12 h是刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建炎癥模型的最佳濃度和時間。

2.3 青蒿素對細(xì)胞活性的影響

MTT實驗的結(jié)果如圖3，當(dāng)ART濃度為5 μmol/mL和10 μmol/mL時，對生理狀態(tài)和病理狀態(tài)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性并無顯著影響，但當(dāng)繼續(xù)增加ART濃度時20 μmol/mL時，開始抑制原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。

2.4 青蒿素抗炎的最佳濃度和時間

ART濃度為7 μmol/mL時表現(xiàn)出抗炎活性，在濃度為10 μmol/mL處理12 h時發(fā)揮出最好抗炎效應(yīng)，然而繼續(xù)增加ART的濃度和作用時間，抗炎效應(yīng)不能持續(xù)增長。因此，10 μmol/mL ART干預(yù)12 h為抑制LPS刺激的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α濃度的最佳濃度和時間（圖4）。

2.5 青蒿素對外泌體、P2X7以及TRPV1受體的影響結(jié)果

分別用ART、A438079（P2X7抑制劑）和GW4869（外泌體抑制劑）均能降低細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度，但是ART分別與A438079和GW4869合用時并未協(xié)同降低TNF-α的濃度（圖5A、B）。由此推測出ART的抗炎作用靶點不是P2X7受體和外泌體。單獨使用ART時，可以降低TNF-α的濃度，而單獨使用capsazepine會升高細(xì)胞上清中TNF-α的濃度，合并使用ART和capsazepine時，青蒿素并未發(fā)揮出抑制TNF-α濃度的能力，推測ART發(fā)揮抑制TNF-α濃度的作用可能是通過TRPV1受體，因TRPV1受體被抑制，從而不能發(fā)揮出ART對TNF-α的抑制作用（圖5）。

2.6 青蒿素對TRPV1受體的影響結(jié)果

在LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型中，單獨使用ART和capsaicin均能降低細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO的濃度，而capsazepine卻升高了星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO的濃度。以上研究表明，ART與capsaicin都能抑制LPS致炎的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥，而capsazepine不能抑制，當(dāng)ART和capsaicin以及capsazepine聯(lián)合使用去干預(yù)LPS致炎的星形膠質(zhì)細(xì)胞時。有趣的是，ART無法降低capsazepine組的炎癥因子。結(jié)果說明：ART可能通過激活TRPV1受體，引起細(xì)胞釋放多種神經(jīng)肽，從而發(fā)揮抗炎作用（圖6）。

3 討論

神經(jīng)炎癥是各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病（包括神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷）的關(guān)鍵因素[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)ART的確具有良好的抗炎活性，并且通過激動TRPV1受體，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子：TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO的釋放，從而發(fā)揮其抗炎作用，本研究為青蒿素發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制提供了新的方向。

盡管ART在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不同的作用[18-19]，但迄今為止，這些途徑中的分子機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。Kim等[20]通過體外實驗中發(fā)現(xiàn)，盡管ART干預(yù)對淀粉樣β（Aβ）纖維的形成沒有影響，但ART確實可以減輕APPSWE/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)炎癥負(fù)擔(dān)[21]。另外，ART可以通過抑制NF-κB核易位和細(xì)胞溶質(zhì)固有免疫信號受體NOD-和LRR-結(jié)構(gòu)域從而抑制β-分泌酶切割淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）和炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療阿爾茲海默癥的作用[22]。

ART及其衍生物除了減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)外，還可有效治療全身炎癥病[23-24]。因此，ART可以是開發(fā)阿爾茲海默和其他神經(jīng)退行性疾病治療或預(yù)防策略的潛在候選藥物。

P2X7受體與其余嘌呤信號受體P2X受體具有不同的藥理學(xué)特性[25]。P2X7受體在組織損傷、感染或在腫瘤微環(huán)境等伴隨炎癥的條件下可被激活，實際上，P2X7受體長期激活后，可形成允許分子量大于900 Da的親水性物質(zhì)通過的孔道，這種孔道的形成可導(dǎo)致炎性小體的激活[26]。炎性小體主要是通過裂解方式使蛋白酶，caspase-1，前體白細(xì)胞介素分子形成IL-1β和IL-18，隨后釋放到胞外產(chǎn)生炎癥[27]。研究表明，P2X7受體在多種炎性病理狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)，并可影響炎性介質(zhì)的表達(dá)和釋放，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷甚至凋亡等過程。本課題證實了P2X7抑制劑確實可以通過抑制P2X7受體，從而降低LPS致炎的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度，能夠在一定程度上減輕炎癥反應(yīng)，但是，P2X7受體抑制劑并不能和ART一起協(xié)同作用降低原代星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中TNF-α的水平。

外泌體和炎癥之間也有緊密的聯(lián)系，不同類型的免疫細(xì)胞在識別外來刺激后，會分泌出發(fā)生改變的外泌體[28]。當(dāng)受到LPS刺激時，巨噬細(xì)胞分泌的外泌體水平增加，蛋白質(zhì)含量增加，并可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-6的產(chǎn)生[29]。另一方面，免疫細(xì)胞也可以作外泌體的受體細(xì)胞，觸發(fā)炎癥反應(yīng)。有研究證明急性結(jié)腸炎小鼠的血清中的外泌體，可以上調(diào)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和釋放TNF-α[30]，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。因此，可以得出結(jié)論，免疫細(xì)胞主動分泌的外泌體也在炎癥過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本實驗也證實了可以通過抑制外泌體的釋放從降低了而LPS致炎的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中TNF-α的水平，但是在外泌體抑制劑和ART共同作用的分組中，并沒有體現(xiàn)出協(xié)同作用。從本實驗中發(fā)現(xiàn)ART并沒有通過抑制外泌體的釋放從而發(fā)揮抗炎作用。

TRPV1可能通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞的活性來調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥。在碘乙酸鈉誘導(dǎo)的炎性痛大鼠模型中，TRPV1拮抗劑可有效抑制誘發(fā)痛及自發(fā)痛，且TRPV1抑制劑可降低腦組織等部位中SP、CGRP等神經(jīng)肽的表達(dá)，從而減輕神經(jīng)源性炎癥程度[31]。但是，其對星形膠質(zhì)細(xì)胞中的影響的研究還較少。在經(jīng)過前期對外泌體、P2X7受體的研究后，進(jìn)行了TRPV1受體在ART抑制LPS介導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥中的作用，然而體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞得到的卻是不一樣的結(jié)果：TRPV1抑制劑capsazepine不能夠降低體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中的TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的水平，且capsazepine和LPS升高的炎性因子水平無法被ART所降低，而TRPV1激動劑Capsaicin反而能夠和ART一起協(xié)同降低LPS致炎的體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中的炎性因子水平。這表明，capsaicin、capsazepine和ART與TRPV1受體之間的關(guān)系并不那么簡單，三者之間相互作用關(guān)系還值得更深入的研究。免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)之間的相互作用與小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)，這些細(xì)胞因子構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥介質(zhì)的主要來源[32]。由此可見，ART除了已知的通過NF-κB發(fā)揮其抗炎作用之外，可能激動TRPV1受體發(fā)揮抗炎作用。本研究為ART發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制提供了新的方向。

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收稿日期：2022-12-28

基金項目：成都大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)新團(tuán)隊項目（No. CDFYCX202208）；四川省科技廳農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（No. 2022NZZJ0015）；四川省2021—2023年高等教育人才培養(yǎng)質(zhì)量和教學(xué)改革項目（No. JG2021-1103）；龍泉驛英才計劃C類創(chuàng)新人才計劃 （No. 90）；成都大學(xué)附屬醫(yī)院院級課題（No. Y202232和No. Y202234）

作者簡介：張書滔，男，生于2000年，主要研究方向為神經(jīng)疾病的中西醫(yī)康復(fù)治療，E-mail： Shutao0731@163.com

*通信作者，E-mail： drshiz1002@hotmail.com