應(yīng)用TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)快速檢測(cè)青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫耶爾森菌耐鏈霉素基因

張琪　李勝　靳娟　何建　楊曉艷　辛有全　柏吉祥　周奎章　張曉璐　蔣可　代瑞霞

摘要：目的? ?應(yīng)用TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)快速檢測(cè)青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐鏈霉素基因，為今后該地區(qū)突發(fā)人間鼠疫的精準(zhǔn)臨床用藥提供理論依據(jù)。方法 分離培養(yǎng)海西地區(qū)1957—2009年間取自鼠疫患者、媒介昆蟲(chóng)及中間宿主的代表性鼠疫菌110株，提取其DNA，針對(duì)我國(guó)鏈霉素耐藥基因rpsl基因設(shè)計(jì)引物P-F和P-R和TaqMan-MGB探針Probe1 [FAM]和Probe2[VIC]，利用熒光定量PCR技術(shù)，進(jìn)行耐藥rpsl基因篩查。結(jié)果 110株被試菌株中FAM檢測(cè)均為陽(yáng)性（RFU峰值>2000）；VIC陽(yáng)性的為0株（RFU峰值<200）。陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照成立。結(jié)論 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，該地區(qū)未檢測(cè)出耐鏈霉素菌株。

關(guān)鍵詞：鼠疫菌；TaqMan-MGB探針；熒光定量PCR技術(shù)；耐鏈霉素；青海省海西州

中圖分類(lèi)號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

The TaqMan-MGB probe was used in the quantitative real-time PCR technique for rapid detection streptomycin resistance gene of Yersinia pestis，

the natural source of plague in Haixi

Zhang Qi1， Li Sheng1， Jin Juan1， He Jian1， Yang Xiao-yan1， Xin You-quan1， Bai Ji-xiang1， Zhou Kui-zhang2，

Zhang Xiao-lu1， Jiang Ke3， and Dai Rui-xia1

（1 Specialized Laboratory of Yersinia pestis，Qinghai Institute for Endemic Disease Prevention and Control， Xi'ning 810021;

2 Department of Plague， Qinghai Institute for Endemic Disease Prevention and Control， Xi'ning 810021;

3 Department of Public Health， Medical School， Qinghai University， Xi'ning 810001）

Abstract Objective To rapidly detect streptomycin resistance genes of Yersinia pestis in the Natural Focus of Plague of Haixi prefecture in Qinghai province by TaqMan MGB probe fluorescence real-time quantitative PCR， and to provide the theoretical basis for precise clinical drug use of plague emergencies in this area. Methods? ? 110 representative strains of Yersinia pestis collected from 1957 to 2009 from plague patients， vector insects and intermediate hosts were isolated and cultured， with their DNA being extracted. Probe1[FAM] and Probe2[VIC]， which were probes of Primers P-F and P-R and TaqMan-MGB， were designed for the rpsl gene， which was a streptomycin resistance gene often found in China， and fluorescence quantitative PCR was utilized to screen the rpsl gene of plague resistance genes. Results? ? In FAM detection， all 110 strains had positive value （RFU peak> 2000）. No strains were positive in VIC detection （RFU peak<200）. The positive control and the blank control proved to be effective. Conclusion? ? Results of real-time quantitative PCR demonstrated that streptomycin resistant strains were not detected in the tested strains in this area.

Key words Yersinia pestis; TaqMan-MGB probe; Fluorescence quantitative PCR technology; Streptomycin resistance; Haixi， Qinghai Province

鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“鼠疫菌”），屬假結(jié)核腸桿菌屬，兼性厭氧革蘭陰性桿菌，是鼠疫病原體和潛在的致命性生物武器，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康[1-3]。1928年，Alexander Fleming偶然間發(fā)現(xiàn)了青霉素，至此人類(lèi)開(kāi)啟了醫(yī)學(xué)新時(shí)代，抗生素是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的主要支柱，被稱(chēng)為是20世紀(jì)的最偉大成就[4-5]。鏈霉素作為治療鼠疫的首選藥物，顯著提高了鼠疫患者的治愈率，死亡率也由之前的50%～90%降低到5%以下[6-7]。但是耐藥株的出現(xiàn)給臨床治療帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)[8-9]。

海西州地處青海省西部，疫源面積大，宿主多樣。1956年判定為喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地[10]，該地區(qū)分離鼠疫菌毒力強(qiáng)，近年來(lái)海西州喜馬拉雅旱獺疫源地動(dòng)物疫情異?；钴S，是青海省鼠疫較為活躍和危害嚴(yán)重的地區(qū)之一[11-12]。因此對(duì)該地區(qū)分離鼠疫菌的耐鏈霉素基因篩查很有意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株

從分離1957—2009年青海省海西州自然疫源地內(nèi)的鼠疫菌株，選擇不同地點(diǎn)、不同時(shí)間、不同宿主及媒介的代表性鼠疫菌株共110株作為實(shí)驗(yàn)菌株，以上菌株由青海省地方病預(yù)防控制所保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)及DNA提取

將被受試菌株接種于赫氏瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，同時(shí)做鼠疫菌特異性噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)果為純鼠疫菌時(shí)，采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿混合抽提法提取菌株DNA[13]，以保證DNA的純度。

1.1.3 主要試劑及儀器

TransStart Probe qPCR SuperMix 購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司。Real-time Thermal Cycler購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司（型號(hào)：5100）。MGB熒光探針及引物由上海輝睿生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 TaqMan-MGB熒光探針?lè)?/p>

PCR 體系含DNA（濃度2 ng/μL）模板1 μL， TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL、上游引物和下游引物各1 μL，濃度均為0.1 μmol/L ，0.1 μmol/L rpsL Probe1 [FAM]和Probe2 [VIC]探針各1 μL，去離子水5 μL，每個(gè)反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃ 延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。陽(yáng)性對(duì)照模板為文獻(xiàn)[21]中S19960127菌株DNA。

2 結(jié)果

110株被試菌株中Probe2[VIC]陽(yáng)性的為0株，對(duì)應(yīng)檢測(cè)rpsl（128：G），RFU峰值＜200，陽(yáng)性＞1000。Probe2 [FAM]陽(yáng)性的為110株，對(duì)應(yīng)檢測(cè)rpsl （128：A），RFU峰值>2000，陰性<200；如圖1～2所示。結(jié)果顯示，該地區(qū)未檢測(cè)出耐鏈霉素菌株。

3 討論

細(xì)菌耐藥性主要是由于細(xì)菌的自然選擇、及抗生素過(guò)度應(yīng)用、濫用所導(dǎo)致[14]。自40年代開(kāi)始采用鏈霉素治療鼠疫后，便陸續(xù)出現(xiàn)了耐鏈霉素菌株。目前，我國(guó)仍以鏈霉素作為治療鼠疫患者的首選特效藥物，2003年戴瑞霞等[15]對(duì)青海各鼠疫自然疫源地不同宿主的鼠疫菌，包括海西地區(qū)分離鼠疫菌，應(yīng)用鏈霉素紙片擴(kuò)散法進(jìn)行了鏈霉素耐藥性監(jiān)測(cè)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)耐鏈霉素菌株。2018年何建等[16]針對(duì)耐鏈霉素strA和strB基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)分離自海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，也未發(fā)現(xiàn)鏈霉素抗藥菌株。2020年何建等[17]又利用鼠疫菌最低抑菌（minimum inhibitory concentration，MIC）方法測(cè)定12種抗菌藥物對(duì)分離自青海鼠疫自然疫源地的328株鼠疫菌株的體外抑菌活性，其中包括鏈霉素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均對(duì)鏈霉素敏感。法國(guó)科學(xué)家Galimand等[18]研究證實(shí)，耐鏈霉素鼠疫菌通過(guò)接合轉(zhuǎn)移其他細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒作用于氨基糖的特定羥基，使其磷酸化，導(dǎo)致了耐藥。但隨著研究的不斷深入，2020和2021年相繼報(bào)道了中國(guó)和馬達(dá)加斯加耐鏈霉素鼠疫菌耐藥新機(jī)制，即通過(guò)編輯核糖體蛋白S12的rpsL基因點(diǎn)突變（A→G）后引起的氨基酸43位點(diǎn)（K43R）的替換獲得耐基因突變，導(dǎo)致鏈霉素不能與S12蛋白結(jié)合而表現(xiàn)出鏈霉素抗性[19-21]。由于TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，特點(diǎn)是對(duì)AT含量高的序列探針的設(shè)計(jì)有很大幫助[22]，尤其在細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方面，具有快速且靈敏的優(yōu)勢(shì)[23-24]，能快速檢測(cè)rpsL基因點(diǎn)突變導(dǎo)致鏈霉素耐藥鼠疫菌。因此，本研究應(yīng)用TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，針對(duì)我國(guó)鏈霉素耐藥基因rpsl基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan-MGB探針，快速篩檢海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐鏈霉素基因，以此掌握當(dāng)?shù)氐氖笠呔昴退幥闆r，這將對(duì)突發(fā)人間鼠疫的精準(zhǔn)治療及提高患者的生存率意義重大。

本研究結(jié)果顯示，該地區(qū)110株分離鼠疫菌中FAM檢測(cè)均為陽(yáng)性（RFU峰值>2000）；VIC陽(yáng)性的為0株（RFU峰值<200），所有被測(cè)菌株未檢測(cè)出耐鏈霉素菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該地區(qū)今后仍以鏈霉素作為首選藥物治療鼠疫患者是合理的。但鏈霉素的使用劑量要適當(dāng)，既要避免過(guò)大劑量的應(yīng)用造成藥物毒副反應(yīng)出現(xiàn)，又要注意由于劑量不足或聯(lián)合用藥不當(dāng)而造成耐藥，替代傳統(tǒng)抗生素的新藥研發(fā)也是今后的重要研究方向之一。

參 考 文 獻(xiàn)

紀(jì)樹(shù)立. 鼠疫[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 1988： 207-216.

張濤. 鼠疫高級(jí)細(xì)菌學(xué)[M]. 寧夏： 寧夏人民出版社， 2006： 1-26.

楊瑞馥. 鼠疫耶爾森菌的研究及其軍事醫(yī)學(xué)意義[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2012， 37（3）： 172-176.

張帆. 青霉素的發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)史[J]. 生物學(xué)教學(xué)， 2008， （7）： 70-71.

Uddin T M， Chakraborty A J， Khusro A， et al. Antibiotic resistance in microbes： History， mechanisms， therapeutic strategies and future prospects[J]. J Infection Public Heal， 2021， 14（12）： 1750-1766.

Meyer K F. Modern therapy of plague[J]. J Am Med Assoc， 1950， 144（5）： 982-985.

Meyer K F. Effective treatment of plague[J]. Ann NY Acad Sci， 1952， 55（6）： 1228-1274.

Welch T J， Fricke W F， McDermott P F， et al. Multiple antimicrobial resistance in plague： An emerging public health risk[J]. PLoS One， 2007， 2（3）： e309.

Rosario-Acevedo R， Biryukov S S， Bozue J A， et al. Plague prevention and therapy： Perspectives on current and future strategies[J]. Biomedicines， 2021， 9（10）： 1421.

尚國(guó)寶， 田富彰， 李國(guó)昌， 等. 2008—2013年青海省海西州鼠疫病原監(jiān)測(cè)分析[J]. 疾病監(jiān)測(cè)， 2016， 31（6）： 482-484.

吳海生， 田富彰， 陳洪艦， 等. 青藏鐵路沿線青海段2003—2013年鼠疫流行態(tài)勢(shì)分析[J]. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2014， 25（6）： 561-563．

王梅， 唐新元， 王祖鄖， 等. 青海省鼠疫疫源地分布特征的研究[J]. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2015， 26（2）： 194-195.

Li Y， Dai E， Cui Y， et al. Different region analysis for genotyping Yersinia pestis isolates from China[J]. PLoS One， 2008， 3（5）： e2166.

Chokshi A， Sifri Z， Cennimo D， et al. Global contributors to antibiotic resistance[J]. J Glob Infect Dis， 2019， 11（1）： 36-42.

戴瑞霞， 李敏， 趙海紅， 等. 中國(guó)鼠疫菌耐鏈霉素菌株的監(jiān)測(cè)[J]. 中華流行病學(xué)雜志， 2003， 24（11）： 1066.

何建， 楊曉艷， 辛有全， 等. 鼠疫耶爾森菌多種耐藥基因PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 中華地方病學(xué)雜志， 2018， 37（3）： 207-211.

何建， 辛有全， 李勝， 等. 青海鼠疫菌株對(duì)12種抗生素體外抑菌活性分析[J]. 中國(guó)地方病防治， 2020， 35（3）： 223-224.

Galimand M， Guiyoule A， Gerbaud G， et al. Multidrug resistance in Yersinia pestis mediated by a transferable plasmid[J]. New Engl J Med， 1997， 337（10）： 677-681.

梁云， 胡曉玲， 洪梅， 等. 兩型鼠疫菌耐鏈霉素菌株的檢測(cè)[J]. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制， 2007， 23（1）： 26-28.

Dai R X， He J， Zha X， et al. A novel mechanism of streptomycin resistance in Yersinia pestis： Mutation in the rpsL gene[J]. PLoS Negl Trop Dis， 2021， 15（4）： e0009324.

Andrianaivoarimanana V， Wagner D M， Birdsell D N， et al. Transmission of antimicrobial resistant Yersinia pestis during a pneumonic plague outbreak[J]. Clin Infect Dis， 2022， 74（4）： 695-702.

Kuang S Y， Jackson P E， Wang J B， et al. Specific mutations of hepatitis B virus in plasma predict liver cancer development[J]. Proc Nat Acad Sci USA， 2004， 101（10）： 3575-3580.

陳建， 王縵， 陳華， 等. 實(shí)時(shí)熒光PCR法快速檢測(cè)乙型肝炎病毒基因YMDD突變株[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志， 2008， （4）： 333-335.

李鴿. 實(shí)時(shí)定量熒光PCR法快速檢測(cè)突變型HBX基因的方法建立及其應(yīng)用研究[D]. 杭州： 浙江中醫(yī)藥大學(xué)， 2016.

孫雙勇， 王蒙蒙， 李麗， 等. 抗生素耐藥與抗生素新藥開(kāi)發(fā)的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床， 2022， 37（2）： 221-229.

收稿日期：2022-12-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 82260401）

作者簡(jiǎn)介：張琪，女，生于1988年，在讀碩士研究生，主管醫(yī)師，主要從事鼠疫防治及鼠疫菌種鑒定，E-mail： 449132626@qq.com

*通信作者，E-mail： drx200907@163.com