5-氮雜胞苷誘導(dǎo)內(nèi)生真菌Penicillium sp. GZWMJZ-042代謝抗α-葡萄糖苷酶活性產(chǎn)物研究

王曉洋　龔倩玉　許言超　左明星　王立平　朱偉明

摘要：目的 利用表觀遺傳修飾劑誘導(dǎo)杜仲內(nèi)生真菌Penicillium sp. GZWMJZ-042產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物。方法 在大米固體培養(yǎng)基中添加5-氮雜胞苷對(duì)真菌進(jìn)行培養(yǎng)；利用柱色譜及高效液相色譜等對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化；運(yùn)用質(zhì)譜、核磁共振和比旋光等鑒定化合物的結(jié)構(gòu)；采用PNPG法測(cè)試化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。結(jié)果 從菌株GZWMJZ-042的發(fā)酵產(chǎn)物中分離并鑒定了9個(gè)單體化合物，其中化合物1為新化合物，其結(jié)構(gòu)分別鑒定為14-hydrocyclopeptin（1）、viridicatol（2）、viridicatin（3）、（2S， 4aR， 4bR， 6aS， 12bS， 12cS， 14aS）-4a-demethylpaspaline-4a-carboxylic acid（4）、fumigaclavine C（5）、（-）chaetominine（6）、cyclo（dehydrohistidyl-L-tryptophyl）（7）、dankasterones A（8）和2'-deoxythymidine（9）?；衔?，2，4，6～9對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，IC50分別為147.0、118.7、110.5、65.9、74.6、40.6和151.5 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的IC50為163.9 μg/mL。結(jié)論 利用表觀遺傳修飾劑可誘導(dǎo)杜仲內(nèi)生真菌產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌；表觀遺傳修飾；活性產(chǎn)物；α-葡萄糖苷酶

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the α-glucosidase inhibitors from endophytic Penicillium sp. GZWMJZ-042 induced by 5-azacytidine

Wang Xiaoyang1，2， Gong Qianyu1， Xu Yanchao1， Zuo Mingxing1，2， Wang Liping1，2， and Zhu Weiming1，3

（1 State Key Laborataory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550014;

2 Natural Products Research Center of Guizhou Province， Guiyang 550014; 3 School of Medicine and Pharmacy，

Ocean University of China， Qingdao 266003）

Abstract Objective To induce the production of active metabolites in endophytic fungus Penicillium sp. GZWMJZ-042 from Eucommia ulmoides using epigenetic activation strategy. Methods The fungus was fermented on rice solid medium supplemented with 5-azacytidine. The isolation and purification of compounds were performed by means of column chromatography and HPLC. Their structures were elucidated through the analysis of MS， NMR and specific rotation. The inhibitory activities against α-glucosidase were assayed by PNPG method. Results Nine compounds（1-9） including one new compound（1） were isolated from the cultural broth of Penicillium sp. GZWMJZ-042. Their structures were identified as 14-hydrocyclopeptin（1）， viridicatol（2）， viridicatin（3），（2S， 4aR， 4bR， 6aS， 12bS， 12cS， 14aS）-4a-demethylpaspaline-4a-carboxylic acid（4）， fumigaclavine C（5），（-）chaetominine（6）， cyclo（dehydrohistidyl-L-tryptophyl）（7）， dankasterones A（8） and 2'-deoxythymidine（9）， respectively. Compounds 1， 2， 4， 6-9 showed significant activities against α-glucosidase with IC50 values of 147.0， 118.7， 110.5， 65.9， 74.6， 40.6 and 151.5 μg/mL， respectively. Acarbose， used as the positive control， had an IC50 of 163.9 μg/mL. Conclusion Epigenetic modifiers can induce endophytic fungi from Eucommia ulmoides to produce bioactive compounds with novel structures.

Key words Endophytic fungi; Epigenetic modification; Active products; α-glucosidase

真菌的代謝產(chǎn)物是藥物分子的重要來源之一，如青霉素類抗生素和他汀類降血脂藥物，挽救了無數(shù)的生命。但是經(jīng)過上百年的研究，真菌來源的藥物研究遇到了瓶頸，如何更有效的發(fā)掘菌株的代謝潛力，是研究真菌藥物迫切需要解決的問題?；蚪M學(xué)研究表明，真菌包含了大量的代謝產(chǎn)物基因簇，但是在常規(guī)培養(yǎng)條件下大部分基因簇處于沉默狀態(tài)。這是因?yàn)檎婧松镏蠨NA甲基化可誘導(dǎo)局部組蛋白去乙?；谷旧|(zhì)乙?；浇档?，且甲基化的序列可募集甲基CpG結(jié)合蛋白與組蛋白去乙?；笍?fù)合物，對(duì)基因的表達(dá)起到抑制作用[1]，即DNA甲基化與組蛋白的去乙?；梢鸨磉_(dá)基因的“沉默”。在不改變基因序列的條件下，表觀遺傳修飾，如DNA甲基化酶（DNMT）抑制劑與組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑可以將真菌沉默基因激活。對(duì)內(nèi)生真菌Stagonospora nodorum培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙?；敢种苿┓⒅Z他（SAHA）和煙酰胺，代謝產(chǎn)生了1個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的丁酰基苯類化合物（+）-4'-methoxy-（2S）-methylbutyrophenone，具有較好的抗菌活性，對(duì)Fusarium solani 的MIC為50 ?g/mL，強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照酮康唑[2]；在Penicillium citreonigrum的大米培養(yǎng)基中加入5-氮雜胞苷（5-aza），代謝產(chǎn)生了兩個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的化合物altlantiones A和B[3]。上述結(jié)果表明，表觀遺傳修飾技術(shù)可用于發(fā)掘真菌的代謝潛力發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物。

杜仲是一種重要的藥用植物，其內(nèi)生菌也引起了研究者的興趣，但是在常規(guī)培養(yǎng)條件下僅分離得到了一些已知化合物[4-8]。為發(fā)掘杜仲內(nèi)生菌的活性天然產(chǎn)物，對(duì)分離自黔產(chǎn)杜仲樹葉的一株內(nèi)生真菌Penicillium sp. GZWMJZ-042通過添加5-aza來進(jìn)行代謝調(diào)控，發(fā)現(xiàn)添加了表觀遺傳修飾劑后發(fā)酵提取物的豐富程度明顯增加，液相檢測(cè)圖譜如圖1所示。對(duì)表觀遺傳修飾后的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行研究，分離鑒定了9個(gè)化合物，包括1個(gè)新化合物，其結(jié)構(gòu)依次為14-hydrocyclopeptin（1）、viridicatol（2）、viridicatin（3）、（2S， 4aR， 4bR， 6aS， 12bS， 12cS， 14aS）-4a-demethylpaspaline-4a-carboxylic acid（4）、fumigaclavine C（5）、（-）chaetominine（6）、cyclo（dehydrohistidyl-L-tryptophyl）（7）、dankasterones A（8）和2'-deoxythymidine（9），其結(jié)構(gòu)如圖2所示。測(cè)試了化合物1～9對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)化合物1，2，4，6～9的活性較強(qiáng)，IC50值分別為147.0，118.7，110.5，65.9，74.6，40.6 和151.5 μg/mL，

陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的IC50為163.9 μg/mL。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：Waters 2695 LCQ-MS型質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Finnigan公司）；INOVA-400MHz型核磁共振儀（美國(guó)Varian公司）（氘代溶劑中添加TMS為內(nèi)標(biāo)物）；Primaide型分析型和制備型高效液相色譜儀（日本日立公司）；Air Tech型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ZF-6型三用紫外線分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；LDZX-75KBS型高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；FA1104型電子分析天平（上海天平儀器廠）；ZWY-2112型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；GF254型薄層層析板（青島海洋化工集團(tuán)公司）；分離用正相硅膠（青島譜科分離材料有限公司）；羥丙基葡聚糖LH-20凝膠（瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司）。

試劑：提取和分離所用的分析純?nèi)軇?，如甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚等（上海沃化化工有限公司），液相用色譜純甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

菌株GZWMJZ-042分離自采集于貴州省貴陽(yáng)市藥用植物園的杜仲葉，保藏于貴州省天然產(chǎn)物研究中心。菌株委托北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行ITS的提取、擴(kuò)增和測(cè)序，基因序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì)，鑒定為青霉屬真菌，其GenBank登錄號(hào)為No. KY038581。

1.3 菌株發(fā)酵

將保藏于4 ℃的菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上，28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。然后挑取單菌落接種到真菌二號(hào)培養(yǎng)基中，于恒溫震蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)4 d，其條件為28 ℃下180 r/min。菌液經(jīng)超聲破碎，菌體在溶液中均勻分散后，作為種子液后續(xù)發(fā)酵接種使用。后將種子液接種到由50 g大米+50 mL含有表觀遺傳修飾劑5-aza（0.25 g/L）水溶液配置的固體培養(yǎng)基中，于28 ℃靜置發(fā)酵培養(yǎng)3 d，發(fā)酵量10 kg。

1.4 活性產(chǎn)物的提取分離

菌株GZWMJZ-042提取物的制備：30 d發(fā)酵結(jié)束后，在培養(yǎng)基中加入乙酸乙酯將菌株滅活，然后用發(fā)酵物3倍體積的乙酸乙酯攪拌提取3次（攪拌時(shí)間分別為1，2和4 h），將提取液減壓濃縮，共得到提取物137.24 g。

代謝產(chǎn)物的分離：提取物首先進(jìn)行正相硅膠柱色譜分離，依次用石油醚，石油醚：二氯甲烷（V：V=1：1），二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇（V：V=100：1，50：1，20：1，10：1，5：1，2：1，1：1）的溶液梯度洗脫，得到8個(gè)組分（Fr.1～8）。Fr.2通過正相硅膠柱色譜，分別用石油醚：乙酸乙酯（V：V= 5：1，2：1，1：1）的溶液梯度洗脫，得到6個(gè)組分（Fr.2.1～6）。Fr.2.3（4.05 g）通過Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱層析[二氯甲烷：甲醇（V：V=1：1）]洗脫，得到13個(gè)組分（Fr.2.3.1～13）。Fr.2.3.5通過正相硅膠柱色譜，石油醚：乙酸乙酯（V：V =2：1）洗脫，得到 6 個(gè)組分（Fr.2.3.5.1～6）。Fr. 2.3.5.6經(jīng)HPLC（ODS-C18柱，95% MeOH：H2O，4 mL/min）得到化合物 8（tR=6.5 min，8.3mg）。Fr. 2.3.11通過正相硅膠柱色譜，石油醚：乙酸乙酯（V：V=2：1） 洗脫，得到9個(gè)組分（Fr.2.3.11.1～9）。Fr.2.3.11.6 經(jīng)HPLC（ODS-C18柱， 80% MeOH：H2O，4 mL/min）得到化合物3

（tR=6.0 min，14.0 mg）。Fr.3（11.17 g） 通過Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱層析（MeOH）洗脫，得到15個(gè)組分（Fr.3.1～15）。Fr.3.5 通過正相硅膠柱色譜，二氯甲烷：甲醇（V：V=10：1） 洗脫，得到3個(gè)組分（Fr.3.5.1～3），F(xiàn)r.3.5.2 經(jīng) HPLC（ODS-C18柱，60% MeOH：H2O，

4 mL/min）得到化合物5（tR=5.8 min，22.7 mg）。Fr. 3.9 通過正相硅膠柱色譜，二氯甲烷：甲烷（V：V=5：1）洗脫，得到6個(gè)組分（Fr.3.9.1～6），F(xiàn)r.3-9-6 經(jīng) HPLC（ODS-C18 柱，90% MeOH：H2O，4 mL/min）

得到化合物4（tR=7.8 min，3.3 mg）。Fr.3.12 經(jīng)HPLC（ODS-C18柱，60% MeOH：H2O，4 mL/min）得到化合物1（tR=5.0 min，6.0 mg）和化合物6（tR=

7.8 min， 14.0 mg）。Fr.6（3.09 g）通過 Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜分離，洗脫劑為甲醇，得到11個(gè)組分（Fr.6.1～11）。Fr.6.10經(jīng) HPLC（ODS-C18柱，60% MeOH：H2O，4 mL/min）得到化合物2（tR=8.5 min，

8.6 mg）。Fr.7（9.37 g）通過Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜分離，洗脫劑為甲醇，得到16個(gè)組分（Fr.7.1～16）。Fr.7.3通過正相硅膠柱色譜，二氯甲烷：甲醇（V：V=5：1）洗脫，得到化合物9（20.4 mg）。Fr. 7.11通過正相硅膠柱色譜，二氯甲烷：甲醇（V：V=8：1）洗脫，得到化合物7（40.3 mg）。

1.5 活性評(píng)價(jià)方法

化合物1～9的α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)試采用PNPG法。準(zhǔn)備好磷酸鹽緩沖溶液（取0.1 mol/L的磷酸二氫鈉和0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液等體積混合），PNPG 溶液（用0.1 mol/L PBS溶液將PNPG配制成2.5 mmol/L 的溶液），0.2 mol/L的碳酸鈉溶液、10% DMSO。將阿卡波糖和待測(cè)化合物用二甲基亞砜溶解，然后用PBS稀釋配制成2.5 mg/mL的溶液。96孔板上設(shè)有空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、實(shí)驗(yàn)組和背景組。空白對(duì)照：80 μL PBS溶液+20 μL 10% DMSO； 陰性對(duì)照：70 μL PBS溶液+10 μL 10% DMSO+20 μL α-葡萄糖苷酶；陽(yáng)性對(duì)照：70 μL PBS溶液+10 μL阿卡波糖+20 μL α-葡萄糖苷酶；實(shí)驗(yàn)組：70 μL PBS溶液+10 μL化合物+20 μL α-葡萄糖苷酶；背景組：90 μL PBS溶液+10 μL化合物。每組設(shè)置3個(gè)平行孔。分別加好以上各組后，將96孔板置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min；取出96孔板，分別在每孔中加入20 μL PNPG溶液，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min；取出96孔板，分別在每孔中加入80 μL碳酸鈉溶液，于405 nm波長(zhǎng)下酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)；依據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算每組的平均值并按照公式計(jì)算抑制率：[抑制率 =（陰性對(duì)照-空白對(duì)照）-（實(shí)驗(yàn)組-背景組）/（陰性對(duì)照-空白對(duì)照）]×100%。有活性的化合物繼續(xù)稀釋測(cè)試抑制率，用SPSS軟件計(jì)算得出IC50[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：棕色固體，高分辨質(zhì)譜在 m/z 295.1074 處給出[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰（calcd. [M+H]+ 295.1038），提示化合物1的分子量為294，分子式為C17H14N2O3，不飽和度為12。紅外光譜（KBr， cm-1）在3422，2924，1675，1627，1396，1205波長(zhǎng)處給出吸收峰，紫外光譜λmax（logε）：219（3.17），216（3.06），293（2.17）處的吸收峰提示可能含酚羥基、酯基、苯環(huán)等結(jié)構(gòu)?；衔锏暮舜殴舱駡D譜（表1）給出7個(gè)季碳信號(hào)（δC? 170.7，166.2，159.0，136.9，131.0，125.4，122.9），9個(gè)次甲基信號(hào)（δC 132.6，131.2×2，130.7，129.5，124.1，120.8，116.0×2）和1個(gè)甲基碳信號(hào)（δC35.0），以上信號(hào)與文獻(xiàn)報(bào)道的dehydrocyclopeptin比較接近[10-11]，其主要區(qū)別在于苯環(huán)片段有羥基取代。在HMBC譜中，1-NH（δH 10.46）與C-3和C-5a相關(guān)，H-6（δH 7.77）與C-5和C-9a相關(guān)，H-8（δH 7.49）與C-9a相關(guān)，H-9（δH 7.13）與C-5a相關(guān)，H-10（δH 6.75）與C-2和C-12/16相關(guān)，H-13/15（δH 6.81）與C-10相關(guān)，H3-17（δH 3.05）與C-3和C-5相關(guān)，14-OH（δH 10.09）與C-13/15相關(guān)；1H-1H COSY譜中，H-6/H-7/H-8/H-9之間有相關(guān)信號(hào)，H-12/16與H-13/15之間有相關(guān)信號(hào)，證明了化合物是dehydrocyclopeptin的14位羥基取代的衍生物，NOESY譜中，H3-17與H-12/16之間的相關(guān)信號(hào)表明雙鍵構(gòu)型為Z型，因此化合物1的結(jié)構(gòu)得以確證，并命名為14-hydrocyclopeptin（圖3）。

化合物2：棕褐色固體。陰離子質(zhì)譜ESI-MS在m/z 252.1處給出[M-H]-峰，提示該化合物的分子量為253，并結(jié)合1H、13C NMR確定其分子式為C15H11NO3。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δH 12.22（1H， s， 3-OH）， 9.56（1H， s， 3'-OH）， 9.17（1H， s， 1-NH）， 7.34-7.28（3H， m， H-5/8/5'）， 7.11-7.05（2H， m， H-6/7）， 6.82（1H， d， J=7.3 Hz， H-6'）， 6.72（1H， d， J=7.3 Hz， H-4'）， 6.71（1H， s， H-2'）；13C NMR（100 MHz， DMSO-d6） δC 158.4（C-2）， 157.3（C-3'）， 142.3（C-8a）， 135.0（C-1'）， 133.1（C-3）， 129.4（C-5'）， 126.5（C-7）， 124.5（C-5）， 124.1（C-4）， 122.2（C-6）， 121.0（C-4a）， 120.4（C-6'）， 116.7（C-4'）， 115.3（C-8）， 114.7（C-2'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物2為viridicatol。

化合物3：淡紫色固體。陰離子質(zhì)譜ESI-MS在m/z 236.1處給出[M-H]-峰，提示該化合物的分子量為237，并結(jié)合1H、13C NMR確定其分子式為C15H11NO2。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δH 12.24（1H， s， 1-NH）， 9.23（1H， s， 3-OH）， 7.51（2H， t， J=7.7 Hz， H-3'/5'）， 7.43（1H， t， J=7.1 Hz， H-4'）， 7.36-7.31（4H， m， H-5/8/2'/6'）， 7.09-7.03（2H， m， H-6/7）; 13C NMR（100 MHz， DMSO-d6） δC 158.3（C-2）， 142.5（C-8a）， 133.8（C-1'）， 133.2（C-3）， 129.9（C-2'/6'）， 128.4（C-3'/5'）， 127.7（C-4'）， 126.5（C-7）， 124.4（C-5）， 124.0（C-4）， 122.2（C-6）， 121.0（C-4a）， 115.3（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物3為viridicatin。

化合物4：淡灰色固體，[α]–7.5（c 0.53， MeOH）。陽(yáng)離子質(zhì)譜ESI-MS在m/z 474.2處給出[M+Na]+峰，提示分子量為451，并結(jié)合1H、13C NMR確定其分子式為C28H37NO4。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6 ） δH 10.58（1H， s， 12-NH）， 7.26（1H， d， J=7.4 Hz， H-11）， 7.24（1H， d， J=7.4 Hz， H-8）， 6.92（1H， t， J=7.4 Hz， H-10）， 6.89（1H， t， J=7.4 Hz， H-9）， 3.12（1H， br s， H-2）， 3.10（1H， br s， H-14a）， 2.65～2.59（1H， m， H-6a）， 2.59～2.56（1H， m， H-7α）， 2.57～2.53（1H， m， H-14β）， 2.35（1H， d， J =11.6 Hz， H-4β）， 2.25～2.20（1H， m， H-7β）， 1.98（1H， d， J =12.6 Hz， H-13β）， 1.86～1.76（2H， m， H-13α/5β）， 1.71～1.65（2H， m， H-4b/6β）， 1.65～1.56（3H， m， H-3α/5α/14α）， 1.54～1.47（1H， m， H-6α）， 1.28～1.22（1H， m， H-4α）， 1.22～1.15（1H， m， H-3β）， 1.08（3H， s， H-3'）， 0.99（3H， s， H-2'）， 0.96（3H， s， H-12c-CH3 ）， 0.92（3H， s， H-12b-CH3）; 13C NMR（100 MHz， DMSO-d6） δC 175.5（C-4a-COOH）， 151.1（C-12a）， 140.3（C-11a）， 124.5（C-7b）， 119.5（C-10）， 118.6（C-9）， 117.8（C-8）， 116.0（C-7a）， 112.0（C-11）， 84.3（C-2）， 83.7（C-14a）， 70.5（C-1'）， 51.8（C-12b）， 48.8（C-6a）， 47.4（C-4a）， 46.1（C-4b）， 39.9（C-12c）， 35.4（C-4）， 32.5（C-13）， 27.1（C-7）， 27.1（C-3'）， 25.3（C-14）， 24.9（C-6）， 24.6（C-2'）， 22.9（C-3）， 22.3（C-5）， 16.3（C-12c-CH3）， 14.6（C-12b-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物4為已知化合物（2S， 4aR， 4bR， 6aS， 12bS， 12cS， 14aS）-4a-demethylpaspaline-4a-carboxylic acid。

化合物5：淡棕色固體，[α]–40.8（c 2.45， MeOH）。陽(yáng)離子質(zhì)譜ESI-MS在m/z 367.1處給出[M+H]+峰，提示分子量為366，并結(jié)合1H、13C NMR確定其分子式為C23H30N2O2。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δH 10.67（1H， s， 1-NH）， 7.14（1H， d， J=7.9 Hz， H-14）， 6.99（1H， t， J=7.9 Hz， H-13）， 6.61（1H， d， J=7.9 Hz， H-12）， 6.15（1H， dd， J=17.1， 10.8 Hz， H-22）， 5.59（1H， br s， H-9）， 5.08（1H， br s， H-23a）， 5.05（1H， d， J=7.4 Hz， H-23b）， 3.68～3.62（2H， m， H-4a/10）， 3.59（1H， br s， H-5）， 3.44（2H， br s， H-7）， 3.03（3H， s， H-17）， 3.00～2.90（1H， m， H-4b）， 2.33（1H， br s， H-8）， 1.85（3H， s， H-25）， 1.50（3H， s， H-20）， 1.49（3H， s， H-21）， 1.31（3H， d， J=7.4 Hz， H-18）; 13C NMR（100 MHz， DMSO-d6） δC 169.8（C-24）， 145.8（C-22）， 138.4（C-2）， 132.6（C-15）， 126.6（C-11）， 125.2（C-16）， 121.5（C-13）， 112.0（C-12）， 111.3（C-23）， 109.0（C-14）， 101.7（C-3）， 68.4（C-9）， 61.3（C-5）， 55.9（C-7）， 41.0（C-17）， 38.8（C-10）， 36.7（C-19）， 31.3（C-8）， 27.4（C-21）， 27.2（C-20）， 24.3（C-4）， 20.8（C-25）， 14.9（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]，故鑒定化合物5為已知化合物fumigaclavine C。

化合物6：棕色固體，[α]–27.4（c 1.75， MeOH）。陽(yáng)離子質(zhì)譜ESI-MS在m/z 425.0給出準(zhǔn)分子離子峰[M+Na]+，提示分子量為402，并結(jié)合1H、13C NMR確定其分子式為C22H18N4O4。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δH 8.28（1H， br s， H-25）， 8.18（1H， br s， H-19）， 7.85（1H， t， J=7.4 Hz， H-21）， 7.69（1H， d， J=7.4 Hz， H-22）， 7.58（1H， t， J=7.4 Hz， H-20）， 7.52～7.48（2H， m， H-5/8）， 7.43（1H， t， J=7.4 Hz， H-7）， 7.25（1H， t， J=7.4 Hz， H-6）， 5.91（1H， br s， H-14）， 5.60（1H， s， H-2）， 4.61（1H， q， J=6.4 Hz， H-11）， 2.93（1H， t， J=12.5 Hz， H-13αβ）， 2.50（1H， br s， H-13β）， 1.60（3H， d， J=6.4 Hz， H-12）; 13C NMR（100 MHz， DMSO-d6） δC 172.1（C-10）， 165.5（C-17）， 160.1（C-15）， 148.6（C-24）， 147.4（C-23）， 138.7（C-9）， 136.7（C-4）， 134.8（C-21）， 129.9（C-7）， 127.3（C-22）， 127.2（C-20）， 126.4（C-19）， 125.5（C-6）， 124.9（C-5）， 121.1（C-18）， 114.5（C-8 ）， 82.6（C-2）， 76.4（C-3）， 59.6（C-11）， 50.8（C-14）， 38.6（C-13）， 14.0（C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故鑒定化合物6為已知化合物（-）chaetominine。

化合物7：黃棕色固體，[α]+50.5（c 2.22， MeOH）。陽(yáng)離子質(zhì)譜ESI-MS在m/z 322.0給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，提示分子量為321，并結(jié)合1H、13C NMR確定其分子式為C17H15N5O2。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δH 12.76（1H， br s， 1-NH）， 10.90（1H， s， 15-NH）， 10.15（1H， s， 12-NH）， 8.78（1H， br s， 19-NH）， 7.62（1H， s， H-20）， 7.57（1H， d， J=7.7 Hz， H-4）， 7.23（1H， d， J=7.7 Hz， H-7）， 7.04（1H， s， H-22）， 7.01（1H， s， H-2）， 7.00（1H， t， J=7.7 Hz， H-6）， 6.94（1H， t， J=7.7 Hz， H-5）， 5.96（1H， br s， H-17）， 4.34（1H， br s， H-11）， 3.31（1H， dd， J=14.3， 3.7 Hz， H-10b）， 3.09（1H， dd， J=14.3， 4.7 Hz， H-10a）; 13C NMR（100 MHz， DMSO-d6） δC 166.0（C-16）， 160.7（C-13）， 136.7（C-9）， 136.0（C-20）， 133.2（C-22）， 127.7（C-8）， 125.6（C-18）， 124.6（C-2）， 121.9（C-14）， 120.9（C-6）， 118.8（C-4）， 118.5（C-5）， 111.2（C-7）， 107.9（C-3）， 106.9（C-17）， 56.0（C-11）， 29.4（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17]，故鑒定化合物7為已知化合物cyclo（dehydrohistidyl-L-tryptophyl）。

化合物8：黃色固體，[α]+14.8（c 0.81， MeOH）。陽(yáng)離子質(zhì)譜ESI-MS在m/z 447.3處給出[M+Na]+峰，提示分子量為424，并結(jié)合1H、13C NMR確定其分子式為C28H40O3。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δH 5.94（1H， s， H-4）， 5.29-5.25（2H， m， H-22/23）， 2.76（1H， t， J=8.5 Hz， H-9）， 2.68～2.62（1H， m， H-7α）， 2.62～2.58（1H， m， H-7β）， 2.43～2.40（2H， m， H-15α/15β）， 2.37～2.22（2H， m， H2-2）， 2.24～2.21（1H， m， H-20）， 1.91～1.88（1H， m， H-1α）， 1.88～1.86（1H， m， H-β）， 1.86～1.84（1H， m， H-11α）， 1.84～1.82（1H， m， H-11β）， 1.82～1.80（1H， m， H-16α）， 1.80～1.77（1H， m， H-24）， 1.71～1.66（1H， m， H-12α）， 1.66～1.61（1H， m， H-12β）， 1.61～1.57（1H， m， H-16β）， 1.55（1H， dd， J=12.8， 5.2 Hz， H-17）， 1.48～1.40（1H， m， H-25）， 1.19（3H， s， H-19）， 1.06（3H， d， J=6.8 Hz， H-21）， 0.86（3H， s， H-18）， 0.80-0.77（9H， m， H3-26/27/28）; 13C NMR（100 MHz， DMSO-d6） δC 215.5（C-14）， 200.3（C-6）， 199.2（C-3）， 157.6（C-5）， 133.9（C-23）， 133.0（C-22）， 124.7（C-4）， 62.2（C-8）， 54.3（C-13）， 48.9（C-9）， 46.4（C-17）， 42.6（C-24）， 40.0（C-7）， 38.3（C-1）， 37.7（C-12）， 36.7（C-20）， 36.5（C-15）， 36.0（C-10）， 34.1（C-2）， 32.6（C-25）， 24.6（C-11）， 23.6（C-19）， 23.4（C-16/21）， 20.0（C-27）， 19.6（C-26）， 17.5（C-28）， 16.5（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，故鑒定化合物8為已知化合物 dankasterones A。

化合物9：棕色油狀物。[α]+18.6（c 2.94， MeOH），陽(yáng)離子質(zhì)譜ESI-MS在m/z 265.0處給出[M+Na]+峰，提示分子量為242，并結(jié)合1H、13C NMR確定其分子式為C10H14N2O5。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δH 7.70（1H， s， H-6）， 6.16（1H， t， J=7.0 Hz， H-1'）， 4.24（1H， m， H-4'）， 3.77～3.73（1H， m， H-3'）， 3.60～3.52（2H， m， H2-5'）， 2.08～2.04（2H， m， H2-2'）， 1.76（3H， s， H-7）；13C NMR（100 MHz， DMSO-d6） δC 164.0（C-4）， 150.7（C-2）， 136.2（C-6）， 109.4（C-5）， 87.3（C-1'）， 83.8（C-4'）， 70.4（C-3'）， 61.3（C-5'）， 39.4（C-2'）， 12.4（C-7）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19]，該化合物鑒定為已知化合物 2'-deoxythymidine。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制測(cè)試結(jié)果

化合物1～9采用PNPG法測(cè)試對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，結(jié)果見表2。

3 討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑是通過抑制淀粉等多糖的降解，延遲小腸對(duì)葡萄糖的吸收起到降糖作用，這類藥物既能有效降低餐后高血糖又不會(huì)引起低血糖癥狀，其對(duì)以碳水化合物為主要熱量來源的中國(guó)患者具有較好的治療效果。目前臨床上使用的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，均是來源于微生物的代謝產(chǎn)物或者其衍生物，由此可以認(rèn)為從微生物代謝產(chǎn)物中尋找新的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。課題組開展了杜仲內(nèi)生菌來源的α-葡萄糖苷酶抑制活性化合物的研究工作，在一株曲霉菌的培養(yǎng)基中添加杜仲葉，誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)多樣的聯(lián)三苯類化合物，并結(jié)合化學(xué)修飾進(jìn)一步拓展了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出了較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性[20]。本研究對(duì)另一株杜仲內(nèi)生菌進(jìn)行了表觀遺傳修飾調(diào)控，發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物的豐富程度明顯提升，從中分離得到了1個(gè)新化合物及8個(gè)已知化合物，大部分都為生物堿類化合物。新化合物1具有苯并二氮雜環(huán)的母核且3位有苯烯基取代，天然來源的此類骨架的化合物報(bào)道較

少[10-11，21]，相比于天然產(chǎn)物dehydrocyclopeptin和trans-3-（3'-hydroxybenzylidene）-3，4-dihydro-4-methyl-lH-1，4-benzodiazepin-2，5-dione[11]，其結(jié)構(gòu)新穎性在于苯烯片段中苯環(huán)的取代羥基處于對(duì)位?；钚栽u(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)分離的9個(gè)化合物大多具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物2的活性優(yōu)于化合物3，推測(cè)是取代苯環(huán)上多了一個(gè)羥基所致活性增加。綜上，菌株在添加5-aza進(jìn)行表觀遺傳修飾調(diào)控后，代謝產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)新穎并且具有較好α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，為杜仲內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究提供了新的研究思路，并為α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

Ng H H， Jeppesen P， Bird A. Active repression of methylated genes by the chromosomal protein MBD1[J]. Mol Cell Biol， 2000， 20（4）： 1394-1406.

Yang X L， Awakawa T， Wakimoto T， et al. Induced biosyntheses of a novel butyrophenone and two aromatic polyketides in the plant pathogen Stagonospora nodorum[J]. Nat Prod Bioprospect， 2013， 3： 141-144.

Wang X， Sena Filho J G， Hoover A R， et al. Chemical epigenetics alters the secondary metabolite composition of guttate excreted by an atlantic-forest-soil-derived Penicillium citreonigrum[J]. J Nat Prod， 2010， 73（5）： 942-948.

龔倩玉， 許言超， 左明星， 等. 杜仲內(nèi)生青霉菌GZWMJZ-

068次生代謝產(chǎn)物研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2018， 30（10）： 1721-1727.

楊秀芳， 田從麗， 張弘弛， 等. 杜仲內(nèi)生真菌 EL09 次生代謝產(chǎn)物的研究[J]. 中成藥， 2012， 34（6）： 1115-1118.

Zhang H C， Liu R， Zhou F， et al. Antimicrobial metabolites from the endophytic fungus Aspergillus sp. of Eucommia ulmoides[J]. Chem Nat Compd， 2014， 50（3）： 526-528.

Ma Y M， Zhang H C， Zhao J， et al. Secondary anti-fungi metabolites from the endophytic fungus Fusarium sp. in Eucommia ulmoides[J]. Chem Nat Compd， 2012， 48（1）： 170-171.

Liu W， Liu Y， Yang F， et al. Asperflaloids A and B from Aspergillus flavipes DZ-3， an endophytic fungus of Eucommia ulmoides Oliver[J]. Molecules， 2021， 26： 3514.

Shim Y J， Doo H K， Ahn S Y， et al. Inhibitory effect of aqueous extract from the gall of Rhus chinensis on alpha-glucosidase activity and postprandial blood glucose[J]. J Ethnopharmacol， 2003， 85（2-3）： 283-287.

Framm J， Nover L， Azzouny A E， et al. Cyclopeptin and dehydrocyclopeptin： Intermediates of biosynthesis of alkaloids of cyclopenin viridicatin group in Penicillium cyclopium westling[J]. Eur J Biochem， 1973， 37（1）： 78-85.

Zhang C C， Ding S S， Shi W S， et al. A new quinolinone from freshwater lake-derived fungus Myrothecium verrucaria[J]. Nat Prod Res， 2017， 31（1）： 99-103.

Shu Z， Liu Q， Xing C， et al. Viridicatol isolated from deep-sea Penicillium griseofulvum alleviates anaphylaxis and repairs the intestinal barrier in mice by suppressing mast cell activation[J]. Mar Drugs， 2020， 18（10）： 517.

Rudolf O， Rouchal M， Lycka A， et al. Pinacol rearrangement of 3，4-dihydro-3，4-dihydroxyquinolin-2（1H）-ones： An alternative pathway to viridicatin alkaloids and their analogs[J]. Helv Chim Acta， 2013， 96（10）： 1905-1917.

Fan Y， Wang Y， Liu P， et al. Indole-diterpenoids with anti-H1N1 activity from the aciduric fungus Penicillium camemberti OUCMDZ-1492[J]. J Nat Prod， 2013， 76（7）： 1328-1336.

Xu J， Song Y， Guo Y， et al. Fumigaclavines D–H， new ergot alkaloids from endophytic Aspergillus fumigatus[J]. Planta Med， 2014， 80（13）： 1131-1137.

左明星， 周彥伶， 許言超， 等. 煙曲霉GZWMJZ-152茶粕發(fā)酵代謝產(chǎn)物[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 2019， 38（2）： 264-271.

Noh H J， Sohn M J， Yu H E， et al. Cyclo（dehydrohistidyl-L-tryptophyl）， an inhibitor of nitric oxide production from a fungal strain， Fb956[J]. J Microbiol Biotechnol， 2007， 17（10）： 1717-1720.

Amagata T， Tanaka M， Yamada T， et al. Variation in cytostatic constituents of a sponge-derived Gymnascella dankaliensis by manipulating the carbon source[J]. J Nat Prod， 2007， 70（11）： 1731-1740.

Ouyang M A. A new adenosyl-alkaloid from Ostrea rivularis[J]. Nat Prod Res， 2006， 20（1）： 79-83.

Xu Y， Wang Y， Wu D， et al. p-Terphenyls from Aspergillus sp. GZWMJZ-055： identification， derivation， antioxidant and α-glycosidase inhibitory activities[J]. Front Microbiol， 2021， 12： 654963.

巨鳳， 羅凡， 馮丹， 等. 冬蟲夏草內(nèi)生菌Penicillium crustosum的化學(xué)成分研究[J].? 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2021， 33（7）： 1147-1155.

收稿日期：2023-04-06

基金項(xiàng)目：貴州省“百人領(lǐng)軍人才”計(jì)劃；中國(guó)科學(xué)院西部青年學(xué)者（院外）；貴州省基礎(chǔ)研究（自然科學(xué)）（No. 黔科合基礎(chǔ)-ZK[2022]一般392）

作者簡(jiǎn)介：王曉洋，女，生于1996年，在讀碩士研究生，主要研究方向：微生物代謝產(chǎn)物，E-mail： wxyang217@163.com

*通信作者，王立平，E-mail： wangliping2022@gmc.edu.cn：朱偉明，E-mail： weimingzhu@ouc.edu.cn